Avaliação Geração isométrica e excêntrica Força dos músculos esqueléticos Isolado de modelos murinos de Distrofias Musculares

Summary

As medições da função do músculo contribui para a avaliação de potenciais agentes terapêuticos para o músculo patologia, bem como para a determinação dos mecanismos subjacentes à fisiologia desse tecido. Vamos demonstrar a preparação do extensor longo dos dedos e músculos do diafragma para testes funcionais. Protocolos para contrações isométricas e excêntricas será mostrado, bem como as diferenças de resultados entre os músculos distróficos, representando um estado patológico, e os músculos de tipo selvagem.

Abstract

Crítico para a avaliação de potenciais agentes terapêuticos para a doença muscular são sensíveis e reprodutíveis avaliações fisiológicas da função muscular. Porque muitos ensaios pré-clínicos confiam em modelos de mouse para estas doenças, a função muscular isolado tornou-se um dos padrões para Go / NoGo decisões em movimento candidatos da droga para a frente em pacientes. Iremos demonstrar a preparação do extensor digitorum longus (EDL) e músculos do diafragma para testes funcionais, que são os músculos predominantes utilizados para estes estudos. A geometria do músculo EDL é ideal para preparações de músculo isolado, com dois tendões facilmente acessíveis, e um tamanho pequeno, que pode ser suportado por superfusão de um banho. O diafragma apresenta profunda patologia progressiva em animais distróficos, e pode servir como uma plataforma para avaliar muitas terapias potenciais contrariando fibrose, e promover a estabilidade fibromuscular. Protocolos para testes de rotina, incluindo isométrica e excêntricacontrações TRIC, será mostrado. Força isométrica fornece a avaliação da resistência, e as contracções excêntricas ajudar a avaliar a estabilidade do sarcolema, que é interrompida em diversos tipos de distrofias musculares. As comparações dos resultados esperados entre os músculos de tipo selvagem e os músculos distróficos também será fornecida. Estas medidas podem complementar as medições morfológicas e bioquímicas da homeostase do tecido, bem como a avaliação de animais inteiros da função muscular.

Introduction

As medições da função do músculo contribui para a avaliação de potenciais tratamentos para patologias do músculo, assim como para a determinação dos mecanismos subjacentes à fisiologia desse tecido. Para doença muscular, o uso de modelos de ratos se tornaram um componente central para a compreensão das ligações entre genótipo e fenótipo, e para estender esse conhecimento para o desenvolvimento e teste de terapêuticas potenciais. As distrofias musculares, em particular, basearam-se em ratos, para avaliar estes agentes e estabelecer dados pré-clínicos necessários para avançar para ensaios clínicos em doentes. A medida do resultado frequente usa a função do músculo cardíaco isolado para determinar a força, a qual é aplicável a uma ampla gama de estudos. Outra medida é a utilização de excêntricos, ou alongamento, contracções para determinar as alterações na integridade da membrana muscular, o que é deficiente na distrofia muscular de Duchenne, eo modelo de rato desta doença (mdx). Portanto, é essencial para estes tipos de measurementos para ser sensível e reprodutível.

O rato extensor digitorum longus (EDL) do músculo tem sido amplamente utilizado para a função do músculo cardíaco isolado, devido à sua geometria e tamanho ideal, incluindo a orientação das fibras uniforme e tendões definitivas ^{2, 5, 6, 10, 12.} Métodos para músculos EDL medições isométricas funcionais foram descritos numa publicação anterior JoVE ^8, bem como na SOP Treat-NMD ^1. Nós estendemos a descrição destes métodos para incluir tanto contrações isométricas e excêntricas. Características da doença são evidentes no EDL, incluindo os ciclos heighted de degeneração / regeneração e produção de força diminuída.

O diafragma de rato apresenta a progressão mais rápida patológica de distrofia muscular em comparação com outros músculos do rato ^11. Aos 6 meses de idade, fibrose cumulativa compreende aproximadamente 50% do músculo. Isto resulta em significativamente diminuissed produção de força ^11. Portanto, agentes terapêuticos que podem impedir a infiltração fibrótica pode ser avaliada de forma eficiente no diafragma.

A perda da distrofina no músculo leva ao aumento da fragilidade e danos contráctil aumentada em todos os ⁹ músculos. Portanto, muitas terapias para a distrofia muscular de Duchenne são voltadas para a substituição da distrofina. Como tal, um ensaio que se tornou essencial para a avaliação destas estratégias é a contração excêntrica, que podem distinguir entre o músculo normal e distrófica, bem como determinar o que beneficiem de uma estratégia particular, para proteger um músculo distrófico de danos contrátil ^{2, 3, 4, 12.} Este procedimento requer um duplo modo de servo-motor, que é capaz de modular / registo de tamanho e força, ou por um método de ajustar o comprimento rapidamente separado a partir de um transdutor de força.

Protocol

Todos os procedimentos foram revistos e aprovados pela Universidade da Pensilvânia IACUC.

1. Dissecção EDL e Preparação (cerca de 30 min)

1. Anestesiar ratos para garantir que eles não sentem dor ou desconforto durante o procedimento, mas que os músculos permanecem bem oxigenado pela circulação. Nós rotineiramente um cocktail ketamina / xilazina (100/10 mg / kg), injectada via IP. Plano cirúrgico de anestesia é determinada pela completa ausência de pedal ou reflexos de retirada palpedral, ou a falta de resposta de contracção da orelha.
2. Imobilizar os membros posteriores, utilizando fita adesiva médica, e retirar a pele da parte inferior do membro posterior anterior para expor a musculatura da área. Manter os músculos húmido com a aplicação de PBS, a intervalos regulares.
3. Sob um escopo de dissecação, fazer uma pequena incisão lateral ao joelho, a fim de expor o tendão proximal do músculo EDL. Há dois tendões nesta região, e ambos devem ser cortadas para permitir o regressoMoval da EDL.
4. No tornozelo medial, cortou o tendão do músculo TA para expor os tendões distais do EDL, que se estendem ao longo dos tarsos meta. Levante o músculo TA fora do caminho, tomando cuidado para não cortar ou tocar os debaixo EDL. Retornar para os tendões distais do EDL, snip cada um e atraí-los através do tornozelo, então segurando os tendões, puxe o EDL longe do resto do membro. Deve libertar a partir da extremidade proximal livremente, mas se não for, volte para a incisão lateral para assegurar que o tendão é cortado. Retire o músculo e coloque em um prato cheio de dissecar refrigerados Ringers oxigenados. Pin do músculo através dos tendões no comprimento aproximadamente de repouso, que é o comprimento encontrado in vivo. O comprimento é curto demais quando o músculo está flácido no prato, e por muito tempo se o músculo está puxando os pinos de dissecação.
5. Euthanize o mouse imediatamente após a remoção do músculo por deslocamento cervical.
6. Atar suturas para o 10dons, o mais próximo possível do músculo, mas não tocando o músculo. Pin o músculo em comprimento aproximadamente repouso usando as suturas.

2. Dissecção diafragma e Preparação (aproximadamente 30 minutos)

1. Eutanásia dos ratos antes deste procedimento por deslocamento cervical, sob anestesia, mesmo se o rato é submetido a dois esvaziamentos, ou CO _2, seguido de confirmação com deslocamento cervical.
2. Fazer uma incisão na pele para expor a cavidade abdominal e torácica. Abra a cavidade abdominal, e cortar a parede do corpo, logo abaixo das costelas. Com uma tesoura de ossos, e de partida acima da inserção do diafragma, corte em torno de toda a caixa torácica, seguindo a linha das nervuras, e cortar através da coluna. Cortar os vasos sanguíneos que atravessam o centro do diafragma de modo que o diafragma pode ser removido facilmente.
3. Retire o diafragma do rato, e coloque em um prato cheio de dissecar Ringers oxigenados. Agite suavemente o DIAPhragm no prato para lavar o sangue. Refrescar solução de Ringer, conforme necessário.
4. Cortar uma tira pequena do diafragma do tendão no centro das nervuras ao longo da orientação das fibras na porção central das hemidiafragmas laterais. A tira deve ser entre 2-4 mm de largura. Com uma tesoura de ossos, corte a nervura em ambos os lados da tira, deixando aproximadamente 1-2 mm de saliência nervura em ambos os lados da tira de membrana.
5. Atar suturas ao tendão central. Laço de sutura para cada uma das extremidades das costelas lateralmente salientes e, em seguida amarrar estes em conjunto para fazer um laço grande.
6. Duas tiras podem ser obtidas a partir de qualquer dada diafragma (um de cada lado).

3. Músculos de montagem em Bath Mecânica

1. Agarrar as suturas e usá-las para ligar o músculo a um poste rígida em uma extremidade, e a um transdutor de força, na outra extremidade.
2. Ajustar o comprimento para assegurar que o músculo não é folga, mas não está esticado. Uma boa aproximação é a musc repousole comprimento como em 1,4-1,5.
3. Banho deve ser cheio com solução de Ringer oxigenado mantida a 22 ° C para prolongar a estabilidade do músculo para teste. Músculos deve repousar durante 5 minutos neste banho, antes do teste funcional de modo que a temperatura do músculo é equilibrada a 22 ° C.

4. Contrações isométricas

1. Estabelecer condições de estimulação supramáxima. Depois de um músculo é colocado no banho, usa pulsos de estimulação únicos 0,5 ms para gerar um tique, e monitorar a saída de força. Gradualmente aumentar a corrente até que a força atinge um nível máximo, mas constante. Aumentar a corrente a 10% mais do que este nível para os demais experimentos.
2. Estabelecer comprimento ideal. Usando estímulos contração isométrica, ajustar o comprimento do músculo gradualmente até que uma força máxima é obtida. Descansar o músculo ~ 10 segundos entre cada contração. Comprimento do músculo óptima (L _o) é obtida quando a força é máxima contração. Comprimento de registro muscular (o comprimento sertre as junções miotendínea para EDL e entre a junção miotendínea tendão central e a inserção do músculo para a nervura), utilizando compassos de calibre de Vernier.
3. Força isométrica máxima tetânica. Estimular o músculo fixado em L _o por um período de 500 ms, com uma série de pulsos de 0,5 ms a estimulação supramáxima e na freqüência de fusão (a partir do planalto da relação freqüência-força (por exemplo, Ref:. ⁸⁾ O planalto para os músculos EDL é tipicamente alcançado com 120 Hz, e para os músculos do diafragma com 100 Hz. Estimular a 3 vezes na freqüência correspondente com períodos de descanso de 5 minutos entre as sessões de estimulação para cada músculo.

5. Contrações excêntricas

1. Permitir muscular para descansar 5 minutos entre a realização de contrações isométricas e excêntricas.
2. Estimular os músculos a 80 Hz para o isometricamente inicial de 500 ms, seguido de um estiramento de 10% L _o na final estimulação msec 200 (uma taxa de estiramento de 0,5 L _o/ Seg.)
3. Repita padrão de estimulação com 5 min entre descansos para o número desejado de contrações excêntricas.
4. Medir a força de cada contracção no período de tempo antes do estiramento. Calcule a queda na força de contração entre o primeiro eo último.

6. Remoção do músculo do Aparelho

1. Encurtar o comprimento do músculo para permitir a remoção suave do músculo do transdutor e postar e devolvê-lo a um prato de dissecação com Ringer.
2. Remover as suturas dos músculos.
3. Para o músculo EDL, limpar o músculo, duas vezes, em seguida, pesar, antes de um processamento subsequente (por exemplo, congelamento de fixação, etc.) Isto será importante para o cálculo da área da secção transversal, e uma força específica.
4. Para o músculo do diafragma, embeber em 0,1% Procion laranja, um corante impermeante de membrana para 15-20 min. Isto irá proporcionar um índice de dano dissecção.
5. Dissecar a distância do músculo esquelético de inserção, bem como o centtendão ral. Isto é necessário para proporcionar um peso preciso do músculo. Blot como acima antes da pesagem e posterior preparação.
6. Calcular a área transversal (CSA):
   CSA (mm ²⁾ = massa (mg) / [(L _o mm) * (L / L _o) * (1,06 mg / mm ^3)],
   onde L / L _o é a fibra de músculo relação comprimento (0,45 para EDL, 1,0 para o diafragma) ⁵ e 1,06 é a densidade do músculo.

Representative Results

Os valores esperados para as forças isométricas do músculo EDL a partir de 12 semanas de idade, os animais são mostrados na Figura 1. Como os músculos mdx apresentam hipertrofia compensatória, força tetânica total pode ser maior em comparação com o músculo mdx idade controlos de tipo selvagem correspondentes. No entanto, uma medida mais apropriada da saída funcional é a força específica (Figura 2), em que a força é normalizado para a área da secção transversal para calcular este valor. Força específica depende da capacidade inerente funcional do músculo, em que a fraqueza nos músculos distróficos é mais aparente quando tanto a força absoluta e área da secção transversal são contabilizados. Em nossas mãos, músculos EDL de camundongos mdx gerar aproximadamente 20 - 25% mais baixas do que aquelas forças específicas de idade foram camundongos tipo selvagem 10-26 semanas de idade.

Para o diafragma, apenas a força específica é relevante para comparações, porque a preparação é uma parte do músculo dependente da Dissection. Comparação da força específica entre o tipo selvagem e os músculos do diafragma mdx reflecte a patologia progressiva neste tecido. Saída de força isométrica diminui com a idade (Figura 3), de modo que aos 6 meses de idade, os músculos do diafragma de ratos mdx produzir mais do que metade do produto funcional do diafragma a partir de tiras de controles pareados por idade de tipo selvagem.

Um exemplo de contracções excêntricas dos testes diafragma é mostrado na Figura 4. Com cada contracção subsequente excêntrico, produção de força diminui em tiras de membrana de ambos tipo selvagem (C57) e ratos mdx. No entanto, a perda de força é mais dramática em amostras de músculo do rato mdx, presumivelmente a partir da ausência de distrofina e suas proteínas associadas.

Figura 1. Força tetânica isométrica no tipo selvagem e EDL mdx f músculos camundongos rom 12 semanas de idade. Força absoluta pode ser maior em pareados por idade músculos mdx EDL devido à hipertrofia compensatória.

Figura 2. Força isométrica tetânica normalizados por área seccional muscular é Força específico, e revela pressionada a capacidade funcional do músculo EDL a partir de ratos mdx em comparação com aqueles dos ratinhos de tipo selvagem. Traços são dos mesmos ratinhos como mostrado na Figura 1.

Figura 3. A perda progressiva da capacidade de geração de força avaliada por força específica é mais aparente no diafragma de ratos mdx (barras vermelhas) em comparação com o tipo selvagem (C57 na linha azul).

36/50036fig4.jpg "/>
Figura 4. A perda de força em função do número de contração excêntrica para os músculos do diafragma a partir de 12 semanas de idade e C57 ratos mdx. Os dados são médias ± SEM para N = 4 músculos por genótipo.

Discussion

O objetivo deste artigo é fornecer orientação para a execução da função muscular isolado em dois músculos de camundongos - a EDL e do diafragma. A avaliação destes músculos pode fornecer informações sobre se deve ou não candidatos terapêuticos para a doença muscular são benéficas. Para ambos os músculos, o principal fator na obtenção de dados consistentes que uma dissecação limpa. Portanto, praticando e aperfeiçoando o passo isolamento inicial é essencial antes de passar para testes funcionais. Além disso, o estabelecimento de parâmetros funcionais para muscular normal é fundamental antes de fazer comparações com o músculo distrófico, ou entre os tratamentos. Isto irá assegurar que os resultados do estudo não estão sujeitos a variabilidade conferida pela capacidade da pessoa que realiza as experiências. O uso de um corante impermeante de membrana podem ajudar com a optimização da preparação de dissecação, para a incubação de qualquer músculo, em uma solução que contém um tal corante irá marcar a maioria das fibras danificadas, e pode servir como um indicador de dissection sucesso. Minimizar o número de fibras danificadas no músculo irá ajudar a otimizar a medição. As fibras danificadas por dissecção fluorescência muito mais intensamente do que os danos por contracção excêntrica, e por isso, se o corante é também usado durante o processo de mecânica, pode-se usar a intensidade do corante para distinguir entre os dois tipos de danos.

Dissecação de tiras de membrana terá sempre os danos nas fibras, simplesmente porque, cortando ao longo do comprimento das fibras, inevitavelmente algumas são destruídas. A absorção do corante é forte em que essas fibras danificadas, e estas são normalmente restringida às arestas exteriores da preparação. Em média, observa-se uma banda de fibras danificadas isto é ~ 3 fibras de largura (~ 120 mm) de cada lado da tira de músculo. Se a faixa danificada compreende mais de 15% do músculo, em seguida, os dados são descartados. A preparação diafragma também tem restrições sobre o tamanho ideal para as medidas funcionais. Encontraram-se que os pedaços de diaphragm que são maiores do que 5 mm começam a dobrar-se sobre si mesmos, porque o empate tendão central é apenas em um ponto. Isto resulta numa diminuição da força específica na preparação. Verificámos também que as tiras mais estreitas também têm menor força específica, que acreditamos ser visto que o número de fibras que foram danificados durante a dissecção compreendem uma maior proporção do número total de fibras. Por exemplo, se 0,1 milímetros de cada lado está danificado e, em seguida, que é de 5% (2x0.1 mm / 4 tira mm) da preparação de músculo que não contribui para a força, enquanto que, se a tira é apenas 1 mm, em seguida, 20 % da preparação de músculo está danificado. Assim, tanto a largura da região danificada, bem como a largura de toda a preparação são factores importantes para controlar.

As medições de tensão isométrica máxima requerem que todas as fibras musculares em um músculo é estimulado. Uma vez que há uma grande variedade na dos componentes de um aparelho de funcionamento, isto deve ser determinado para cada conjunto individual-se. Por exemplo, o tamanho do banho ou do tipo de estimulador pode afectar a intensidade da estimulação. Estimulação Twitch é uma forma razoável para determinar as condições de estimulação supramáximos. Uma vez que esta é estabelecida por uma configuração específica e muscular, ele pode ser utilizado para estudos posteriores.

Em contrapartida, o comprimento óptimo de qualquer músculo dado tem de ser medida para cada preparação utilizando o processo iterativo descrito acima. Isto assegura que não há sobreposição de filamentos grossos e finos são ideais e a capacidade de produção máxima potencial força é medida. Os processos alternativos podem contar com os padrões de difracção associados com as estrias do músculo, mas isso requer equipamento adicional não descrito aqui.

Rotineiramente usar 500 durações estimulação ms, que cai na faixa média deste parâmetro utilizado por outros investigadores nesta área. Embora isto possa causar alguma fadiga do músculo durante a contracção, o que é evidentepor um "sag" na produção de força máxima, isso por si só pode ser informativo. Por exemplo, uma diferença de fadiga pode ser obtida por diferentes tipos de terapias, incluindo aqueles manuseamento de cálcio que, portanto, o objectivo de sag em vigor durante a contracção activo pode servir como um indicador de melhoria. Em alternativa, a perda de força pode indicar que as suturas nos tendões não são suficientemente apertado, e que são o escorregamento durante a contracção. O músculo devem ser removidos a partir do banho e as suturas devem ser re-ligada se isto ocorre. Nós também utilizar uma série de 3 contracções tetânica, o que ajuda a estimar a estabilidade da preparação. Mais uma vez, deslizamentos de sutura levaria à perda de força entre as contrações, requerendo sutura re-subordinação. Grandes músculos também pode gerar núcleos anóxicas, que levam a perdas de força durante o protocolo. Tamanho muscular é um fator limitante para a realização de testes de função muscular isolado, onde os músculos EDL com massas superiores a 20 mg perder força a cada contraçãoção, e não pode ser suportado por superfusão de um banho. Tiras de membrana não sofrem as mesmas complicações porque são suficientemente fina para que a viabilidade prolongada no banho.

Outros músculos podem ser utilizados para a função do músculo cardíaco isolado, incluindo o músculo sóleo, que é comumente utilizada, mas não descritas aqui. Muitos dos mesmos procedimentos podem ser adoptados para o sóleo, em termos de preparação e os testes funcionais. No entanto, as principais diferenças estão na freqüência de estimulação, e os parâmetros para contrações excêntricas. Utilização dos sóleo de função complementa a dos outros dois músculos, e por isso deve ser considerado como parte de um "pacote" de avaliação camundongos distróficos ^{4, 7.}

Contração excêntrica proporciona um índice de fragilidade contráctil, e é importante o uso de um protocolo que resulta em perda de força modesta em músculos de animais de tipo selvagem e de uma perda significativa da força nasnão tratados músculos distróficos para que haja uma ampla faixa dinâmica para comparações. A falta de qualquer perda de força nos músculos normais sugerem que a contração excêntrica é muito leve, e não será suficiente para distinguir entre as terapias que não são eficazes e as que são realmente benéfica. No entanto, uma perda dramática de força nos músculos normais submetidos a contração excêntrica pode ser muito grande para trazer à tona diferenças associadas com a doença. O protocolo para o EDL e diafragma utiliza uma taxa de estiramento 0,5 Lo / sec para produzir uma alteração de comprimento de 10%. Nós normalmente executam 5 contrações excêntricas, que resultam em uma pequena perda de força nos músculos normais e uma significativa perda de força nos músculos distróficos. Certamente, todos estes parâmetros podem ser variados para aumentar o comprimento global mudança, a taxa de estiramento, ou o número de contracções excêntricas para distinguir diferenças entre músculo doente e saudável, bem como sobre os efeitos de um tipo específico de mutação ou tratamento um está estudando. Enquanto não existe uma diferença marcada entre os músculos normais e doentes, então existe um padrão de ouro para alcançar em termos de tratamentos.

Em resumo, este protocolo estabelece as diretrizes para a realização de contrações isométricas e excêntricas, e espero que identifica os potenciais armadilhas a evitar quando definir esta técnica em seu laboratório.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
in vitro Muscle Test System	Aurora Scientific	1200A
Dissecting microscope	Leica	MZ6
ACE light source	Schott-Fostec	A20500
Dissecting scissors	Fine Science Tools	14060-11
Angled dissecting scissors	Fine Science Tools	15006-09
Scalpel handle	Fine Science Tools	10003-12	alternate dissecting tool
Curved scalpel blades #12	Fine Science Tools	10012-00	alternate dissecting tool
Bone scissors	Fine Science Tools	16044-10
S&T suture tying forceps	Fine Science Tools	00272-13
Dumont SS forceps - angled	Fine Science Tools	11203-25
Braided silk suture size 6-0	Teleflex Medical	07-30-10
Medical tape	Transpore	3M
Ketamine hydrochloride 100 mg/ml	Hospira	NDC 0409-2051-05	Final Dose is 80 mg/kg
TranquiVed Injection (xylazine 100 mg/ml)	Vedco	NDC 50989-234-11	Final Dose is 10 mg/kg
Reactive orange 14	Sigma-Aldrich	R-8254
Ringers Solution Components			Solution is gas equilibrated with 95% O2 and 5% CO2, final pH 7.4
Sodium chloride	Sigma-Aldrich	S7653	Final Concentration: 118 mM
Potassium chloride	Fisher Scientific	P217-3	Final Concentration: 4.7 mM
Calcium chloride dihydrate	Fisher Scientific	C79-500	Final Concentration: 2.5 mM
Potassium phosphate monobasic	Fisher Scientific	P-285	Final Concentration: 1.2 mM
Magnesium sulfate	J.T. Baker	2500-01	Final Concentration: 0.57 mM
4-(2-Hydroxyethyl)piperazine-1-ethanesulfonic acid (HEPES)	Fisher Scientific	BP310-500	Final Concentration: 5.95 g/L
Glucose	Sigma-Aldrich	G8270	Final Concentration: 5.5 mM