Summary
纤毛产生的流体流动在枯否囊泡(KV)控制的斑马鱼胚胎的左右模式。在这里,我们描述了一种技术,调节基因的功能,特别是在KV细胞。此外,我们展示了如何提供KV可视化流体流动的荧光珠。
Abstract
内部器官,如心脏,大脑和肠道左右(LR)为他们的正常功能是至关重要的不对称性。运动纤毛参与建立LR的不对称性在脊椎动物胚胎,包括老鼠,青蛙和斑马鱼2-6。这些'LR的纤毛'产生不对称的流体流动是必要的,以触发一个保守的不对称交点(TGF-β超家族)的信号级联在左侧侧板中胚层,这被认为是提供开发机关7 LR构图信息。因此,理解机制LR构图,它是必不可少的,以确定基因调节的LR纤毛细胞的组织,运动和长度LR纤毛和他们的能力,以产生强大的非对称流。
在斑马鱼胚胎中,LR纤毛位于巨噬泡(KV)2,4,5。 KV是由一个单一的层monociliated上皮细胞,附上一个充满液体的腔。 KV是来自一组被称为的背先行者细胞(DFCS)迁移外包阶段在背胚率在8,9〜20-30细胞的命运映射。在早期的体节阶段,DFC的集群,并分化成纤毛上皮细胞,形成KV中的胚胎10,11 tailbud。结合的光学透明度和快速发展的斑马鱼胚胎斑马鱼KV一个很好的模型系统来研究,LR纤毛细胞能够识别和跟踪八间指定流感诊所求诊。
有趣的是,DFC / KV细胞谱系的祖细胞保留蛋黄细胞的细胞质之间的桥梁,受精后4小时(HPF)的,而蛋黄细胞和其他接近8高倍视野2后的胚胎干细胞的细胞质之间的桥梁。利用这些细胞的桥梁,我们开发了一个特定阶段的喷油策略提供吗啉代寡otides(密苏里州)专门DFC的和击倒的目标基因的功能,在这些细胞中12。这技术创造嵌合体胚胎基因的功能被撞倒在发展的背景下,野生型胚胎的DFC / KV血统的。在KV,我们要分析非对称流体流动注射荧光微球到KV珠流明,并记录运动时,通过电视显微镜2。流体流动是易于可视化和可量化的跟踪珠位移随着时间的推移。
在这里,使用特定的阶段,的DFC-针对性的基因敲除技术和注射荧光微球KV可视化流程,我们提出了一个协议,提供了一个有效的方法来描述一个特定基因的作用在KV的发育和功能。
Protocol
概述特定阶段的斑马鱼胚胎注射液
反义吗啉代寡核苷酸(MO),结合到靶mRNA和蛋白表达,转录干扰,被广泛用于基因敲除(损失函数)的研究斑马鱼13,14。基因的工具,LLC提供的MO,无论是羧基发出绿色荧光的或丽丝胺(发出红色荧光)的检测MO注射的胚胎中,使用荧光显微镜的标签。通过注入MO到蛋黄细胞在斑马鱼发育的不同阶段中,它能够提供的MO胚胎的具体的室中( 图1A-F)。 MO注射成之间的蛋黄1-4细胞阶段(0-1 HPF)的进入所有胚胎细胞( 图1A,D,D'), 通过连接与蛋黄的持续存在,直到32 -细胞阶段15,以促进全球击倒。 MO注射到蛋黄期间midblast乌拉阶段(2.5-3 HPF)的可以输入DFC的( 图1B中,E,E')可能是通过胞质桥8和敲除基因的功能专门在DFC / KV细胞谱系12,而不进入大多数其它胚胎细胞谱系的祖。作为一个重要的控制测试基因功能是否需要在DFC / KV或也蛋黄12,16,但也可以限制密苏里蛋黄细胞注射后之间的圆顶30%外包阶段(〜4.5 HPF)的已经关闭了所有的胞质桥( 图1C,F,F')。这些注射已被组合使用,以分析基因功能DFC / KV细胞17-24。为了评估中流体流量的KV,荧光微珠注入对KV管腔之间的6-10体节阶段(12-14高倍视野),然后立即使用电视显微镜( 图1G-J)成像。微珠可发出红色或绿色荧光(或两者)的,所以它是可以使用不同的图像荧光微球和MO的渠道。
1。特定阶段的注射液的吗啉代(密苏里州)
MO注射到斑马鱼的胚胎已被证明以前25,26。在这里,我们简要地描述特定阶段的MO注射。所有注射之后,胚胎转移到陪替氏培养皿,并在28.5℃的孵育
- 全球MO注射:收集胚胎受精后,立即将其装入一个喷射板。荧光MO加载到毛细管针,针安装到微量注射器( 如哈佛设备PLI-90的Pico-喷油器)。额的针尖和调整喷射设置(压力和/或时间),以创建具有一定体积的1 NL所描述25,26注射降使用解剖体视显微镜,注入1 NL到蛋黄的MO( 图1A)的≥50胚胎每个实验。快速完成注射液的4芯雄鹿E。
- DFC的目标MO注射:收集后立即受精的胚胎和孵化为28.5°C。 ,当胚胎已经达到256个细胞的阶段(约2.5 HPF),快速加载的喷射板,然后注入到蛋黄≥100之间的256细胞和1000细胞阶段的胚胎( 图 1 NL荧光MO 1B)。
- 卵黄的目标MO注射:收集胚胎受精和孵化后立即为28.5°C。在圆顶阶段(〜4 HPF)的,加载的胚胎成喷射板,然后注入荧光MO 1 NL≥100胚胎之间的圆顶和30%外包阶段( 图1C)的蛋黄。
2。选择注射的胚胎分析
- 当MO注射胚胎达到75%外包阶段(8 HPF),去除未受精和死胚,然后屏幕活胚胎在荧光显微镜分布的荧光MO。然后分配瓦特选择胚胎发育为28.5°C。
- 对于全球密苏里注射,选择胚胎荧光均匀地分布在整个所有的胚胎干细胞( 图1D,图2A)。
- DFC目标MO注射,胚胎荧光MO已扩散到蛋黄,似乎集中在背胚率(DFCS)( 图1E;图2B)。在这个阶段中,也可以是难以可视化荧光DFC的由于在底层卵黄明亮的荧光。小心排除胚胎的荧光MO纳入胚胎干细胞以外的其他八间指定流感诊所求诊或聚集在注射部位( 图2D)。
- 对于蛋黄目标MO注射,选择其中MO荧光均匀地分布在整个蛋黄并没有观察到任何胚胎干细胞( 图1F,图2C)中的胚胎。同样,取出胚胎的荧光MO仍然聚集在注射部位。
- 之间的2-4-体节阶段(〜11 HPF)的,屏幕胚胎在荧光显微镜下,使用更高的放大倍率的第二时间。然后让选定的胚胎发育为28.5°C。
- 对于全球MO注射,确保选定的胚胎具有MO荧光均匀地分布在KV和所有的胚胎干细胞( 图1D,图2E)。
- 对于有针对性的DFC-MO注射,精心选择胚胎,MO荧光只有在KV细胞和蛋黄( 图1E)。转基因胚胎表达GFP KV细胞,例如作为Tg(DUSP6:d2EGFP)27,可以帮助识别在其中MO已成功交付至KV细胞( 图2F)的胚胎。放弃MO荧光另一方面,KV细胞在胚胎干细胞的胚胎。
- 蛋黄目标MO注射,选择MO荧光的胚胎,只在蛋黄( 图1F:图2G)。
3。安装胚胎在KV流体流动分析
- 分析非对称流体流动的KV全球MO,DFC有针对性的MO或蛋黄目标MO注射胚胎,仔细dechorionate的〜20胚体节间4-6级(11-12 HPF)用锋利的镊子。
- 准备到5ml管作为干浴中的液体保持在42℃下的50毫升的1%低熔点琼脂糖和等分试样
- 一个胚胎转移到玻璃抑郁症幻灯片(美国科学用品公司),并尽可能删除尽可能多的水。固定化的胚胎通过添加足够温暖的1%低熔点琼脂糖刚好盖住胚胎(太多琼脂糖可以干扰随后的成像)。琼脂糖凝固,使用产钳的位置,胚胎等,KV朝上(背视图)( 图1H)。安装10每张幻灯片的一个胚胎的胚胎。快速地工作,以确保在下一步骤中的所有注射并发症eted由10个体节阶段(14 HPF)的。
4。荧光微球注射到KV
- 稀释Fluoresbrite Multifuorescent 0.5微米直径的微球(Polysciences的公司)在无菌水中至1:50在1.5ml Eppendorf管中。
- 1:50稀释的微珠混合彻底攻管和加载3微升毛细管针。使用的微量注射器用于MO注射( 如哈佛设备PLI-90的Pico-注射器),打破了针尖,镊子和调整注入的设置,以产生尽可能小的(<0.5 NL)注射下降。
- 在解剖显微镜下,对齐与KV针内腔中的第一安装胚胎。将针头插入管腔和注入体积小(<0.5 nl)的珠( 图1G)。一个小针尖小的注射量是关键,以避免损坏KV。
- 注射所有安装胚胎。一旦胚胎injecte的d,a将一滴无菌水可以添加琼脂糖上,以防止其干燥。珠粒的注射过程中,往往会阻碍针开口。这需要重新打破的针尖和调整通过调节压力或时间设定的显微注射装置的注射量。更换针头变钝,在注射过程中造成重大损害。
- 屏幕注射的胚胎为成功交付珠一个堂堂正正的荧光化合物显微镜下( 例如蔡司AxioImager M1)使用20倍的目标。首先,确定是否使用明视场照明( 图1J)KV结构是完整的,然后用荧光观察珠粒。选择在珠是和里面的KV流明的胚胎。丢弃在KV KV损坏或不漂珠的胚胎。这是很容易会错过的KV,并提供附近的组织或相关蛋黄珠。如果不成功,安装ANOTHER 10个胚胎,并重复注射过程。
5。 KV流体流量的可视化和分析
- 对于每个选定的胚胎KV珠内,加一滴无菌水覆盖琼脂糖,然后使用63X水浸泡目标( 图1I)直立荧光化合物显微镜下观察KV。可替换地,可以应用于用于与非水浸渍的目标和/或倒置显微镜盖玻片。
- 使用高速摄像机安装在显微镜上( 例如蔡司AxioCamHSm)录制10秒的电影。记录使用明场或微分干涉相差(DIC)的信道使用的荧光通道(约70帧/秒),和对KV管腔的珠粒。
- 为了形象化所有珠的动作,随着时间的推移,进口电影的荧光珠ImageJ软件(免费下载http://rsb.info.nih.gov/ij/ )一的第二创建一个最大投影在电影中所有的荧光信号。要执行ImageJ的最大投影中,单击“图片→栈→Z项目。”在“Z项目”窗口中,项目全部与投影片类型的“最大强度”。此图像可以叠加在DIC的图像,其中珠粒成像( 图3A-B)的KV。
- 个人珠的变动可以使用ImageJ进行跟踪。可以下载一个插件(“手动跟踪”)在http://rsbweb.nih.gov/ij/plugins/track/track.html 。打开荧光微球在ImageJ的电影和运行的手动追踪功能。手动跟踪,在该窗口中,选中“显示参数”和“时间间隔”和“X / Y校正”的输入参数。手动选择保持≥50帧的电影在焦平面的珠子,然后跟踪≥5珠,每胎。每个胎圈的路径和速度所产生的次e软件( 图3 CD)。
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Representative Results
图1给出了一个流程图,用于测试基因功能DFC / KV细胞和如何引入荧光珠的可视化流体流的喷射策略阶段特异性的MO注射提供了一种有用的方法来分析基因功能的特定的室中的胚胎。在KV。在成功阶段特异性注射胚胎的是,荧光的MO分布示意性地示出在图2中,在图1D-F和在活胚胎。一个不成功的MO注射,在其中的MO仍然在蛋黄细胞聚集, 如图2D所示。
成功注入胚胎选择基于MO-4-6体节交付到KV腔( 图1G-H)的荧光微珠流体流动分析阶段可以安装在本地化的荧光。电视显微镜是用来记录胎圈变动KV( 图1I-J),其中可以定性分析( 图3A-B)或定量( 图3C-E)的使用ImageJ软件。在正常流动的控制胚胎,珠后续逆时针路径,可以可视化通过使荧光珠的位置随着时间的推移( 图3A)的最大凸起或通过跟踪单个珠随着时间的推移( 图3C)。为了证明损失的协调流程,我们与MO注射胚胎击倒,Rho激酶2B(Rock2b),这是我们先前的研究显示,破坏流量18。在Rock2b MO注射的胚胎,珠随机移动在KV( 图3B,D)。 ImageJ软件被用来计算个别胎圈磁道的速度。 图3E中示出的平均流速5珠从控制和Rock2b MO胚胎。
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图1。阶段特异性MO注射液和微珠注射到KV(A)的注射液荧光MO(红色)的MO整个胚胎为全 球分布的在1 -细胞阶段到蛋黄概述 。 (B)有针对性的DFC-MO MO注射512个细胞的阶段加载到DFC / KV细胞。 (C)卵黄限制在30%外包阶段有针对性的MO注射MO的蛋黄。 (DF)的荧光分布的MO(红色)在成功注射的胚胎在75%外包阶段(D,E,F)和6体节期(D',E',F')以下阶段的示意图具体的注资。 MO聚集在DFC / KV细胞系注射时,在512个细胞的阶段(图中E,E'),但不注射时的30%外包(箭头在F,F')。 (G)的注射液的荧光微珠(绿色)到KV管腔。 (H)A道具而正确的安装KV(箭头)朝上微球注射胚胎。 (I)KV成像粒子运动中使用正置显微镜。 (J)高倍率注射微球的一个完整的KV流明。根据文献胚胎发育和胚胎图。 28。
图2。选择特定阶段的MO注射胚胎。 (AC)作为选定的胚胎在其中荧光MO(红色)在75%外包阶段(8 HPF)的结合要么在所有全球MO注射(一)后的胚胎干细胞,通过蛋黄和DFC(箭头)扩散后DFC目标MO注射(B)或保持在蛋黄后,卵黄定位MO注射液(C)。 (D)的排除胚胎的荧光例rescent MO聚集在注射部位。 (EG)的实施例的荧光MO(红色)在选定的胚胎在4体节阶段(11.5 HPF)的分布。 DIC图像识别KV流明(箭头),在转基因TG(DUSP6:d2EGFP)胚胎表达GFP在KV细胞27。在全球MO注入胚胎,MO观察在KV和所有周围的细胞(E)。在有针对性的DFC-MO注射胚胎,MO最KV细胞与GFP共定位和相关的蛋黄核(F)也出席了会议。在蛋黄有针对性的胚胎中,MO发现了专门蛋黄中核(G)。
图3。 KV流体流动的定性和定量分析。 (AB)的流量,最大投影10秒的电影显示所有fluoresc运动的定性分析耳鼻喉科微珠注入KV已经被叠加在一个全局控制MO(A)或(B)的注入胚胎Rock2b MO上的DIC的KV管腔图像。 (CE),为了量化流,运动的组(n = 5)被跟踪在控制胚胎(C)和Rock2b MO注射胚胎(D)中,并用于计算平均值的胎圈速度(E)的个别的微珠。圆(CD)的KV流明的界限。错误杆(E)代表一个标准偏差。
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Discussion
使用特定阶段的目标MO注射到DFC / KV细胞系是一个非常有用的方法来研究基因功能的细胞自主性,避免多效性所造成的全球基因敲除的表型。然而,这些注射可以在技术上具有挑战性。注射液的MO之间的256细胞和1000细胞的阶段,可能会导致在三种可能的结果:1)在MO仍然聚集在注射部位,2)的MO整个蛋黄扩散并进入DFC / KV细胞或3)的MO整个蛋黄,进入DFC / KV细胞和胚胎干细胞的扩散。因此,在这个实验中,选择其中MO专门DFC / KV细胞移动的胚胎是一个关键步骤。重要的是要注意,MO可以加载到所有DFC / KV细胞,但这些细胞10往往仅输入的一个子集。这马赛克定位的原因仍不清楚,但可能反映如何有效的MO通过蛋黄和/或所述定时关闭IND移动的变异ividual之间的桥梁,蛋黄和DFC祖。我们还没有发现条件,提高靶向性,而是依赖于选择中,大多数的KV细胞已经采取了MO的胚胎。 MO在大多数的DFC / KV细胞生成胚胎的成功率通常〜20%至30%,但,这个可以相当变数日常的。出于这个原因,我们建议注入尽可能多的尽可能的胚胎(≥100),然后小心地选择具有适当分布的荧光吗啉代的胚胎。
解释的结果有针对性的DFC-注射控制实验是非常重要的。应使用不匹配的MO或标准的阴性对照MO(从基因工具,LLC)控制非特异性作用。此外,因为DFC-靶向注射提供MO蛋黄和DFC / KV细胞谱系( 图2F),它是重要的,以确定在这些胚胎的表型是否是由于基因乐趣损失述略DFC / KV细胞或在蛋黄细胞。与的蛋黄有针对性的胚胎( 图2F-G)比较表型DFC-针对性的胚胎细胞特异性识别DFC / KV影响。当然,某些基因可以起到在两个DFC / KV细胞和蛋黄16。虽然我们集中的MO-介导的功能缺失型分析这里,DFC的定位注射技术和相关联的控制实验可以用来评估的增益函数,通过注入合成的mRNA的过表达在DFC一种特定的蛋白质/ KV血统17,22,24,29。使用这种方法的一个聪明的适应DFC-,靶mRNA注射救全球MO击倒的DFC / KV细胞30。然而,应该注意的是,并非所有的mRNA注入DFC的和KV细胞,和重要的控制中所编码的蛋白质的表达在这种方式导致应包括评估水平的蛋白质的表达和分布。
成功交付微珠s到对KV管腔评估非对称流取决于注入期间的瞬态KV器官的快速发展,在最佳阶段珠。我们开始安装胚胎在4-6体节阶段(〜12 HPF),然后注入微球KV到10体节期(14 HPF)。 4体节阶段之前,管腔往往是太小注入,并在后面的阶段(> 10体节)的注入变得困难的,由于KV移动深入胚胎。这种技术的一个限制是,需要对KV管腔扩大的尺寸,可以成功地注射微珠。在MO击倒一个特定基因的情况下,严重破坏的KV组织和/或降低KV的管腔大小(见参考文献31),这将是困难的,如果不是不可能的,使用这种方法检测流量。
当制备胚胎用于注射到KV的微珠,直沿着胚胎轴与KV朝上( 图1H,重要的是要装入胚胎),可能会影响胚胎的位置的角度,针进入KV和KV成像珠的角度。同样重要的是,使用小口径的注射针和小喷射量的微珠,以避免损坏KV。我们建议练习能顺利地发展注入行程,将针头插入KV,释放的珠子,然后迅速收回针从胚胎。当条件是最优的,我们能够成功地交付微珠〜50%( 如n = 5/10),注射的胚胎。
总之,特定阶段的MO注射和可视化微珠KV LR纤毛细胞的候选基因的功能研究提供了一个机会。
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Disclosures
没有利益冲突的声明。
Acknowledgments
我们感谢菲奥娜优良的实验室支持和斑马鱼的保健福利。这项工作是一个AHA博士前奖学金GW(11PRE5730027)的和NHLBI补助金的HJY(R01HL66292)和JDA(R01HL095690)。
Materials
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Standard Control oligo-Lissamine tagged | Gene Tools, LLC | ||
Custom Rock2b morpholino oligo | Gene Tools, LLC | ||
Fluoresbrite Multifluorescent 0.5 micron Microspheres | Polysciences, Inc. | 24054 |
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