Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

Analyse af genfunktioner og Visualisering af Cilia er genereret Fluid Flow i Kupffer s vesikel

Published: March 31, 2013 doi: 10.3791/50038
Automatic Translation
1, 2, 1
1Department of Cell and Developmental Biology, State University of New York, Upstate Medical University, 2Department of Neurobiology and Anatomy, Eccles Institute of Human Genetics, University of Utah

Summary

Cilia-genereret fluidstrøm i Kupffer s vesikel (KV) styrer venstre-højre mønstret af den zebrafisk embryo. Her beskriver vi en teknik til at modulere genfunktion specifikt i KV celler. Derudover viser vi, hvordan man leverer fluorescerende perler i KV at visualisere fluidstrømning.

Abstract

Indre organer som hjerte, hjerne og tarm udvikle venstre-højre (LR) asymmetrier, der er kritiske for deres normale funktioner 1. Motile cilier er involveret i at etablere LR asymmetri i hvirveldyr embryoner, herunder mus, frø, og zebrafisk 2-6. Disse "LR cilia 'generere asymmetriske fluidstrøm, der er nødvendig for at udløse en konserveret asymmetrisk Nodal (TGF-β superfamilien) signaleringskaskade i den venstre laterale plade mesoderm, som menes at tilvejebringe LR mønster information for at udvikle organer 7. Således at forstå mekanismerne bag LR mønsterdannelse er det vigtigt at identificere gener, der regulerer tilrettelæggelsen af ​​LR cilierede celler, motilitet og længde LR cilier og deres evne til at skabe en robust asymmetrisk strømning.

I zebrafisk embryo, er LR cilia beliggende i Kupffer s vesikel (KV) 2,4,5. KV består af et enkelt lag af monociliated epithelcellerat vedlægge en væskefyldt hulrum. Fate kortlægning har vist, at KV er afledt af en gruppe ~ 20-30 celler kendt som dorsale forløberen celler (DFCs), der vandrer på den dorsale blastoderm margin under epiboly faser 8,9. Under tidlige somit faser, til DFCs klynge og differentiere til cilierede epitelceller danne KV i tailbud af embryonet 10,11. Evnen til at identificere og spore DFCs-i kombination med optisk transparens og hurtig udvikling af zebrafisk embryo-gør zebrafisk KV en fremragende model til undersøgelse LR cilierede celler.

Interessant, progenitorer af DFC / KV celleafstamning bevarer cytoplasmiske broer mellem blommen celle op til 4 timer efter befrugtning (HPF), hvorimod cytoplasmiske broer mellem blommesækken celle og andre embryonale celler tæt efter 2 HPF 8. Drage fordel af disse cytoplasmiske broer, vi udviklet en trinspecifik injektion strategi om at levere morpholino oligonucleotides (MO) udelukkende til DFCs og knockdown funktionen af en målrettet gen i disse celler 12. Denne teknik skaber kimære embryoner i hvilket gen funktion er slået ned i DFC / KV afstamning udvikler sig i forbindelse med en vildtype-embryo. At analysere asymmetrisk fluidstrøm i KV, vi indsprøjte fluorescerende mikroperler i KV lumen og optage perle bevægelsen ved hjælp videomicroscopy 2. Fluidstrømning er let visualiseres og kan kvantificeres ved at spore vulst forskydning over tid.

Her bruger trinspecifik DFC målrettet gen knockdown teknik og injektion af fluorescerende mikroperler i KV at visualisere flow, præsenterer vi en protokol, der giver en effektiv tilgang til at karakterisere rollen af ​​et bestemt gen i løbet af KV udvikling og funktion.

Protocol

Oversigt over Stage-specifikke zebrafisk Embryo Indsprøjtninger

Antisense morpholino oligonucleotider (MO), der binder til en målrettet mRNA og forstyrre proteinekspression fra dette transkript, er meget udbredt i gen knockdown (tab-af-funktion) undersøgelser i zebrafisk 13,14. Gene Tools, LLC tilbyder MOs, der er mærket med enten carboxyfluorescein (udsender grøn fluorescens) eller lissamin (udsender rød fluorescens) til påvisning MO i injicerede embryoner ved hjælp af fluorescerende mikroskopi. Ved indsprøjtning af MO i blommen cellen på forskellige stadier af zebrafisk udvikling, er det muligt at levere MO specifikke rum i embryoet (fig. 1A-F). MO injiceret i blommen mellem 1-4 celler trin (0-1 HPF) træder alle embryonale celler (figur 1A, D, D ') via forbindelser med blommen, der fortsat indtil 32-cellestadiet 15 for at lette den globale knockdown. MO injiceret i blommen i midblastUla stadier (2,5-3 HPF) kan indtaste stamfædre til de DFCs (figur 1B, E, E ') sandsynlige gennem cytoplasmatiske broer 8 og knockdown genfunktion specifikt i DFC / KV celleafstamning 12, uden at indtaste de fleste andre embryonale cellelinier . Som en vigtig kontrol for at teste, om genfunktion er påkrævet i DFC / KV eller også i æggeblomme 12,16, er det også muligt at begrænse MO til blommen celle ved at injicere mellem dome-30% epiboly faser (~ 4,5 HPF) efter alle cytoplasmiske broer har lukket (figur 1C, F, F '). Disse injektioner er blevet anvendt i kombination til at analysere genfunktion i DFC / KV celler 17-24. At vurdere fluidstrømning i KV, er fluorescerende mikroperler injiceres i KV lumen mellem 6-10 somit trin (12-14 HPF) og derefter straks afbildes ved hjælp videomicroscopy (fig. 1G-J). Mikroperler er til rådighed, udsender rød eller grøn fluorescens (eller begge), så det er muligt at anvende forskelligekanaler til billedet fluorescerende mikrokugler og MO.

1. Trinspecifik Injektion af Morpholinos (MO)

Injektion af MO i zebrafisk embryoner er blevet påvist tidligere 25,26. Her vil vi kort beskrive fase-specifikke MO injektioner. Efter alle injektioner, der embryoer overført til en petriskål og inkuberet ved 28,5 ° C.

  1. Global MO injektion: Collect embryoner umiddelbart efter befrugtningen, og indlæse dem i en indsprøjtning plade. Indlæs fluorescerende MO ind i en kapillær nål og montere nålen på en microinjector (f.eks Harvard Apparatus PLI-90 Pico-injektor). Bryde nålespidsen og justere injektion indstillinger (tryk og / eller tid) for at skabe en injektion dråbe, der har et volumen på 1 nl som beskrevet 25,26. Ved hjælp af en dissekere stereomikroskop, injiceres 1 nl af MO i blommen (figur 1A) af ≥ 50 embryoner pr eksperiment. Arbejde hurtigt at fuldføre injektioner af 4-cellers stage.
  2. DFC målrettede MO injektion: Collect embryoner umiddelbart efter befrugtningen og inkuberes ved 28,5 ° C. Når embryonerne har nået 256-celle stadiet (~ 2,5 HPF), hurtigt indlæse dem i en indsprøjtning plade og derefter injiceres 1 nl af fluorescerende MO i blommen af ≥ 100 fostre mellem de 256-celle-og 1.000-celle faser (figur 1B).
  3. Yolk målrettede MO injektion: Collect embryoner umiddelbart efter befrugtningen og inkuberes ved 28,5 ° C. På kuplen stadie (~ 4 HPF), indlæse embryoner i en indsprøjtning plade og derefter injiceres 1 nl af fluorescerende MO i blommen af ≥ 100 embryoer mellem kuplen og 30% epiboly stadier (figur 1C).

2. Valg Injicerede Embryoner til analyse

  1. Når MO injicerede embryoner nå 75%-epiboly stadie (8 HPF), fjern ubefrugtede og døde fostre og derefter skærmen levende fostre under en fluorescerende dissektionsmikroskop til fordeling af fluorescerende MO. Så allow udvalgte embryoner til at udvikle ved 28,5 ° C.
    1. For global MO injektioner, vælge embryoner, der fluorescens jævnt fordelt i hele alle embryonale celler (figur 1D, figur 2A).
    2. For DFC-målrettet MO injektioner, vælge embryoner hvori fluorescerende MO er diffunderet gennem hele blommen og vises koncentreret ved den dorsale blastoderm margin (DFCs) (figur 1E, figur 2B). På dette trin kan det være vanskeligt at visualisere fluorescerende DFCs grund af lys fluorescens i den underliggende æggeblomme. Vær omhyggelig med at udelukke embryoner, hvor den fluorescerende MO har indarbejdet i embryonale celler, bortset fra DFCs eller forbliver aggregeres på injektionsstedet (Figur 2D).
    3. For æggeblomme-målrettet MO injektioner, vælge embryoner hvori MO fluorescens jævnt fordelt i hele blommen og ikke observeret i nogen embryonale celler (figur 1F, figur 2C). Igen ved at fjerne embryoer, hvor den fluorescerende MO forbliveraggregeres på injektionsstedet.
  2. Mellem de 2-4-somit faser (~ 11 HPF), embryoner skærmen en anden gang under et fluorescensmikroskop med højere forstørrelse. Lad derefter udvalgte embryoner til at udvikle ved 28,5 ° C.
    1. For globale MO injektioner, sikre udvalgte embryoer har MO fluorescens jævnt fordelt i KV og alle embryonale celler (figur 1D «figur 2E).
    2. For DFC målrettet MO injektioner, skal du vælge omhyggeligt embryoner, der har MO fluorescens kun i KV-celler og blommesækken (Figur 1E «). Transgene embryoner, som udtrykker GFP i KV celler, såsom Tg (Dusp6: d2EGFP) 27, kan hjælpe til identifikation af embryoner, hvor MO er blevet leveret til KV celler (figur 2F). Kassér fostre med MO fluorescens i embryonale celler andre at KV celler.
    3. For æggeblomme målrettet MO injektioner, skal du vælge fostre, der har MO fluorescens udelukkende i blommen (Figur 1F ': Figur2G).

3. Montering Embryoner til at analysere Fluid Flow i KV

  1. At analysere asymmetrisk fluidstrøm i KV af den globale MO, DFC målrettet MO eller æggeblomme-målrettede MO injicerede embryoner, omhyggeligt dechorionate ~ 20 fostre mellem 4-6 somit faser (~ 11-12 HPF) med skarpe pincet.
  2. Fremstilling af 50 ml 1% lav-smeltepunkt agarose og alikvot i 5 ml rør, der skal holdes som en væske i en tør bad ved 42 ° C.
  3. Overfør ét embryon til et glas depression slide (United Scientific Supplies, Inc.) og fjerne så meget af vandet som muligt. Immobilisere embryo ved tilsætning af tilstrækkelig varme 1% lav-smeltepunkt agarose til blot at dække fosteret (for meget agarose kan interferere med efterfølgende billeddannelse). Som agarosen størkner, bruge pincet til at placere foster, således at KV vender opad (dorsal view) (Figur 1 H). Monter 10 fostre med ét æg per dias. Arbejde hurtigt for at sikre, at alle injektioner i det næste trin er kompleted af 10 somit fase (14 HPF).

4. Injektion af Fluorescerende Microbeads til KV

  1. Fortynd Fluoresbrite Multifuorescent 0,5 mikron diameter mikrosfærer (Polysciences, Inc.) til 1:50 i sterilt vand i et 1,5 ml Eppendorf-rør.
  2. Bland 1:50 fortynding af mikroperler omhyggeligt ved at banke på glasset og indlæse 3 pi i en kapillær nål. Brug den samme microinjector bruges til MO injektioner (f.eks Harvard Apparatus PLI-90 Pico-injektor), bryde nålespidsen med en pincet og justere indsprøjtning indstillingerne til at generere den mindst mulige (<0,5 nl) injektion dråbe.
  3. Under et dissektionsmikroskop, rette nålen med KV lumen af ​​det første monteret embryo. Stik nålen ind i hulrummet og injicere et lille volumen (<0,5 nl) af perler (figur 1G). En lille nål spids og lille injektionsvolumen er afgørende for at undgå skadelige KV.
  4. Indsprøjtes alle mountede embryoner. Når et embryo er injected, en dråbe sterilt vand kan tilsættes på toppen af ​​agarose for at forhindre det i at tørre ud. I løbet af injektionerne, vil perlerne forhindrer ofte nålen åbning. Dette kræver igen at bryde nålespidsen og justering af injektionsvolumen ved at modulere trykket eller tidsindstilling af mikroinjektion apparatet. Udskift nålen, hvis den bliver sløv nok til at forårsage betydelig skade under indsprøjtning.
  5. Screen de injicerede embryoner til vellykket levering af perler under en opretstående fluorescerende forbindelse mikroskop (f.eks Zeiss AxioImager M1) med en 20X målsætning. Først afgøre, om KV struktur er intakt hjælp brightfield belysning (Figur 1J), og derefter bruge fluorescens at observere perlerne. Vælg embryoner, hvis perlerne er til stede og bevæger sig inde i KV lumen. Skille embryoner med KV skade eller ingen flydende perler i KV. Det er nemt at gå glip af KV og levere perler til nærliggende væv eller den underliggende æggeblomme. Hvis mislykket, mount another 10 embryoer og gentag injektionsproceduren.

5. Visualisering og analyse af KV fluidstrømning

  1. For hvert udvalgt embryo med perler inde KV, en dråbe sterilt vand til dækning af agarose og derefter observere KV under den opretstående fluorescerende forbindelse mikroskop med et 63x vand dypning mål (figur 1I). Alternativt kan et dækglas anvendes til brug med ikke-vand dypning mål og / eller inverterede mikroskoper.
  2. Brug et high-speed kamera monteret på mikroskop (f.eks Zeiss AxioCamHSm) for at optage et 10 sek film. Optage både perlerne ved hjælp af fluorescerende kanal (ca. 70 billeder / sek) og KV lumen ved hjælp af en brightfield eller differential interferens kontrast (DIC) kanal.
  3. For at visualisere alle perle bevægelser over tid, importere filmen af fluorescerende perler i ImageJ software (gratis download på http://rsb.info.nih.gov/ij/ ) ennd maksimalt oprette fremskrivning af alle fluorescerende signaler i filmen. For at udføre den maksimale projektion i ImageJ, klik på "Billede → Stacks → Z projekt." I "Z-projektet" vinduet, projicerer alle udsnit med projektion type "Max intensitet". Dette billede kan vises på en DIC billede af KV hvis perlerne blev afbildet (figur 3A-B).
  4. De bevægelser af de individuelle perler kan spores ved hjælp ImageJ. Et plugin ("Manual Tracking") kan downloades på http://rsbweb.nih.gov/ij/plugins/track/track.html . Åbn fluorescerende perler film i ImageJ og kør Manual Tracking-funktionen. I vinduet af Manuel sporing, tjek "Vis parametre" og inputparametrene for "tidsintervaller" og "x / y kalibrering". Vælg manuelt perler, der forbliver i brændplanet af filmen i ≥ 50 billeder og derefter spore ≥ 5 perler pr foster. Stien og hastigheden af ​​hver perle er genereret af the software (fig. 3 CD).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Fase-specifikke MO injektioner giver en nyttig fremgangsmåde til at analysere genfunktion i bestemte rum i embryoet. Figur 1 viser et rutediagram over injektionsanlæggene strategier anvendes til at teste genfunktion i DFC / KV celler og hvordan at indføre fluorescerende perler at visualisere fluidstrømning i KV. Fordelingen af fluorescerende MO i vellykkede fase-specifikke injicerede embryoner er vist skematisk i figur 1D-F og i levende embryoner i fig. 2. Et mislykket MO injektion, i hvilken MO er aggregeret i blommen cellen, er vist i figur 2D.

Succesfuld injicerede embryoer-valgt på basis af lokaliseringen af fluorescerende MO-kan monteres i de 4-6 somit trin til afgivelse af fluorescerende mikrokugler ind i KV lumen (fig. 1G-H) til at analysere fluidstrømning. Videomicroscopy anvendes til at registrere perle bevægelser i KV (fig. 1I-J), som kan analyseres kvalitativt (figur 3A-B) eller kvantitativt (figur 3C-E) under anvendelse ImageJ software. I et kontrolelement foster med normale strøm, follow perler uret stier, der kan visualiseres ved at gøre en maksimal projektion af fluorescerende perler positioner over tid (figur 3A) eller ved sporing af individuelle perler over tid (figur 3C). For at demonstrere tab af koordineret flow, vi injicerede embryoner med MO til knockdown Rho-kinase 2b (Rock2b), som vi tidligere har vist forstyrrer flow 18. I Rock2b MO injicerede embryoner, flytte perler tilfældigt i KV (figur 3B, D). ImageJ software blev anvendt til at beregne hastigheden af ​​individuelle perle spor. Den gennemsnitlige hastighed af 5 perler fra kontrol-og Rock2b MO embryoer er vist i figur 3E.

es.jpg "src =" / files/ftp_upload/50038/50038fig1.jpg "/>
Figur 1. Oversigt over trinspecifik MO injektioner og mikroperle injektion i KV. (A) Injektion af fluorescerende MO (rød) i blommen ved den 1-cellestadiet til global fordeling af MO hele embryonet. (B) DFC-målrettet MO injektion på 512-celle stadiet at indlæse MO i DFC / KV-celler. (C) blomme-målrettet MO injektion på 30%-epiboly stadium at begrænse MO til æggeblomme. (DF) Skematisk repræsentation af fordelingen af fluorescerende MO (rød) i held injicerede embryoner på 75% epiboly trin (D, E, F) og 6 somit trin (D ', E', F ') efter trin- specifikke injektioner. MO akkumuleres i DFC / KV cellelinie, når det injiceres i 512-celle stadiet (pile i E, E '), men ikke når det blev injiceret ved 30% epiboly (pile i F, F'). (G) Injektion af fluorescerende mikrokugler (grøn) i KV lumen. (H) En afstivningtigt monteret foster med KV (pil) opad for mikrokugle injektion. (I) Imaging perler bevægelse i KV ved hjælp af en opretstående mikroskop. (J) Stor forstørrelse af et intakt KV lumen injiceret med mikroperler. Fosterstadiet og embryonproduktionsteam tegninger er baseret på ref. 28.

Figur 2
Figur 2. Udvælgelse af embryoner efter etape-specifikke MO injektioner. (AC) Eksempler på udvalgte embryoer på 75% epiboly trin (8 HPF), hvori fluorescerende MO (rød) er enten inkorporeret i alle embryoniske celler efter global MO injektion (A), diffunderet gennem blomme og DFCs (pil) efter DFC målrettede MO injektion (B) eller forblev i blommen efter blommen målrettet MO injektion (C). (D) Eksempel på en udelukkede foster, hvor fluorescent MO aggregeret på injektionsstedet. (EG) Eksempler på fluorescerende MO (rød) fordeling i udvalgte embryoer på 4-somit stadie (11,5 HPF). DIC billeder identificere KV lumen (pil) i transgen Tg (Dusp6: d2EGFP) embryoner, der udtrykker GFP i KV celler 27. I den globale MO injicerede embryon blev MO observeret i KV og alle omgivende celler (E). I DFC-målrettede MO injicerede embryon, co-lokaliseret med GFP i de fleste KV celler og MO var også til stede i underliggende æggeblomme kerner (F). I æggeblomme-målrettet embryo, blev MO udelukkende findes i æggeblomme kerner (G).

Figur 3
Figur 3. Kvalitative og kvantitative analyser af strømninger i KV. (AB) For kvalitativ analyse af flow, en maksimal projektion af en 10 sek film viser bevægelse af alle fluorescskellige mikroperler sprøjtes ind KV er blevet overlejret på en DIC billede af KV lumen i en global kontrol-MO (A) eller Rock2b MO (B) injiceret embryo. (CE) at kvantificere flow, bevægelse af de individuelle mikrokugler (n = 5) blev sporet i en kontrol-embryon (C) og Rock2b MO injiceret embryo (D) og anvendes til at beregne en gennemsnitlig vulst hastighed (E). Cirkler (CD) tilnærme KV lumen grænser. Fejllinjer (E) repræsenterer en standardafvigelse.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Brug af fase-specifikke injektioner at målrette MO til DFC / KV celleafstamning er en nyttig tilgang til at studere celle-autonomi genfunktion og undgå pleiotrope fænotyper som følge af den globale gen knockdown. Dog kan disse injektioner være teknisk udfordrende. Injektion af MO mellem de 256-celle-og 1.000-celle faser kan resultere i tre mulige udfald: 1) den MO forbliver aggregeres på injektionsstedet, 2) de MO diffunderer hele blommen og kommer ind DFC / KV celler eller 3) den MO diffunderer gennem hele blommen og kommer ind DFC / KV celler og andre embryonale celler. Derfor vælger embryoner, som MO har flyttet udelukkende de DFC / KV-celler er et vigtigt skridt i dette eksperiment. Det er vigtigt at bemærke, at MO kan indlæse i alle DFC / KV celler, men ofte går kun en delmængde af disse celler 10. Årsagerne til denne mosaik målretning er fortsat uklare, men kan afspejle variabilitet i hvor effektivt MO bevæger sig gennem blommen og / eller tidspunktet for lukning af individual broer mellem blommen og DFC progenitorer. Vi har ikke fundet forhold, der øger målrettet effektivitet, men snarere har påberåbt udvælge fostre, hvor de fleste af de KV cellerne har optaget MO. Succesraten for generering af embryoner med MO i de fleste DFC / KV celler typisk ~ 20-30%, men dette kan være ganske variabel fra dag til dag. Af denne grund anbefaler vi injektion så mange embryoner som muligt (≥ 100), og derefter omhyggeligt embryonerne som har den rette fordeling af fluorescerende morpholino.

Kontrol eksperimenter er afgørende for fortolkningen af ​​resultaterne af DFC-målrettede injektioner. En mismatch MO eller standard negativ kontrol MO (fra gen-værktøjer, LLC) bør anvendes til at kontrollere for ikke-specifikke virkninger. Desuden, eftersom DFC-målrettede injektioner leverer MO til både blommens og DFC / KV cellelinie (figur 2F) er det vigtigt at fastslå, om fænotyper i disse embryoner skyldes tab af genet funIndsatsen i DFC / KV celler eller i blommen celle. Sammenligning fænotyper i DFC-målrettede embryoner med æggeblomme målrettede embryoner (figur 2F-G) vil identificere DFC / KV cellespecifik påvirker. Selvfølgelig kan nogle gener fungerer i både DFC / KV celler og blommen 16. Selvom vi fokuserer af MO-medierede tab af funktion analyser her kan DFC-målrettede injektionsteknik og forbundet kontrolforsøg anvendes til at vurdere en forstærkning af funktion ved at injicere syntetisk mRNA at overudtrykke et bestemt protein i DFC / KV afstamning 17,22,24,29. Et smart tilpasning af denne fremgangsmåde brugt DFC målrettet mRNA injektioner for at redde den globale MO knockdown kun i DFC / KV celler 30. Imidlertid skal det bemærkes, at ikke alle mRNA'er injiceret på denne måde resulterer i ekspression af det kodede protein i DFCs og KV celler og vigtige kontroller bør indgå at vurdere niveauet af proteinekspression og distribution.

Vellykket leverance af mikroperles i KV lumen at vurdere asymmetrisk strømning afhænger injicere perlerne ved optimale trin i den hurtige udvikling af den transiente KV organ. Vi begynder montering embryoner i 4-6 somit faser (~ 12 HPF) og derefter injicere mikrokugler ind KV op til 10 somit fase (14 HPF). Forud for 4 somit fase, hulrummet er ofte for lille til at injicere, og på senere trin (> 10 somitter) injektionen bliver vanskelig på grund af KV bevæger dybere ind i embryonet. En begrænsning ved denne teknik er, kræver KV lumen til at udvide sig til en størrelse, der med held kan injiceres med mikroperler. I tilfælde, hvor MO knockdown af et bestemt gen alvorligt forstyrrer KV organisation og / eller reducerer KV lumen størrelse (oversigt i ref. 31) vil det være vanskeligt, hvis ikke umuligt, at assay strømning ved hjælp af denne fremgangsmåde.

Ved udarbejdelsen embryoner til injektion af mikroperler i KV, er det vigtigt at montere embryo lige langs den embryoniske akse med KV opad (fig. 1 H), Kan som embryon stilling påvirker den vinkel, at nålen kommer ind KV og vinklen af ​​billeddannende perler i KV. Det er også vigtigt at anvende en lille-boring injektionsnål og lille injektionsvolumen mikroperler at undgå beskadigelse KV. Vi anbefaler at praktisere at udvikle en jævn injektion slagtilfælde at indsætte nålen ind i KV, slipper perlerne og derefter hurtigt trække nålen fra embryonet. Når betingelserne er optimale, er vi i stand til at levere mikroperler til ~ 50% (fx n = 5/10) af de injicerede embryoner.

Sammenfattende giver fase-specifikke MO injektioner og visualisering af mikroperler i KV en mulighed for at studere funktionen af ​​kandidatgener i LR cilierede celler.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Ingen interessekonflikter erklæret.

Acknowledgments

Vi takker Fiona Foley for fremragende lab support og zebrafisk pleje. Dette arbejde blev støttet af en AHA predoctoral stipendium til GW (11PRE5730027) og NHLBI tilskud til HJY (R01HL66292) og JDA (R01HL095690).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Standard Control oligo-Lissamine tagged Gene Tools, LLC
Custom Rock2b morpholino oligo Gene Tools, LLC
Fluoresbrite Multifluorescent 0.5 micron Microspheres Polysciences, Inc. 24054

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Sutherland, M. J., Ware, S. M. Disorders of left-right asymmetry: heterotaxy and situsinversus. Am. J. Med. Genet. C Semin. Med. Genet. 151C (4), 307-317 (2009).
  2. Essner, J. J., Amack, J. D., Nyholm, M. K., Harris, E. B., Yost, H. J. Kupffer's vesicle is a ciliated organ of asymmetry in the zebrafish embryo that initiates left-right development of the brain, heart and gut. Development. 132 (6), 1247-1260 (2005).
  3. Nonaka, S., et al. Randomization of left-right asymmetry due to loss of nodal cilia generating leftward flow of extraembryonic fluid in mice lacking KIF3B motor protein. Cell. 95 (6), 829-837 (1998).
  4. Essner, J. J., et al. Conserved function for embryonic nodal cilia. Nature. 418 (6893), 37-38 (2002).
  5. Kramer-Zucker, A. G., et al. Cilia-driven fluid flow in the zebrafish pronephros, brain and Kupffer's vesicle is required for normal organogenesis. Development. 132 (8), 1907-1921 (2005).
  6. Schweickert, A., et al. Cilia-driven leftward flow determines laterality in Xenopus. Curr. Biol. 17 (1), 60-66 (2007).
  7. Tabin, C. J. The key to left-right asymmetry. Cell. 127 (1), 27-32 (2006).
  8. Cooper, M. S., D'Amico, L. A. A cluster of noninvolutingendocytic cells at the margin of the zebrafish blastoderm marks the site of embryonic shield formation. Dev. Biol. 180 (1), 184-198 (1996).
  9. Melby, A. E., Warga, R. M., Kimmel, C. B. Specification of cell fates at the dorsal margin of the zebrafish gastrula. Development. 122 (7), 2225-2237 (1996).
  10. Amack, J. D., Wang, X., Yost, H. J. Two T-box genes play independent and cooperative roles to regulate morphogenesis of ciliated Kupffer's vesicle in zebrafish. Dev. Biol. 310 (2), 196-210 (2007).
  11. Oteiza, P., Koppen, M., Concha, M. L., Heisenberg, C. P. Origin and shaping of the laterality organ in zebrafish. Development. 135 (16), 2807-2813 (2008).
  12. Amack, J. D., Yost, H. J. The T box transcription factor no tail in ciliated cells controls zebrafish left-right asymmetry. Curr. Biol. 14 (8), 685-690 (2004).
  13. Nasevicius, A., Ekker, S. C. Effective targeted gene 'knockdown' in zebrafish. Nat. Genet. 26 (2), 216-220 (2000).
  14. Bill, B. R., Petzold, A. M., Clark, K. J., Schimmenti, L. A., Ekker, S. C. A primer for morpholino use in zebrafish. Zebrafish. 6 (1), 69-77 (2009).
  15. Kimmel, C. B., Law, R. D. Cell lineage of zebrafish blastomeres. I. Cleavage pattern and cytoplasmic bridges between cells. Dev. Biol. 108 (1), 78-85 (1985).
  16. Arrington, C. B., Yost, H. J. Extra-embryonic syndecan 2 regulates organ primordia migration and fibrillogenesis throughout the zebrafish embryo. Development. 136 (18), 3143-3152 (2009).
  17. Caron, A., Xu, X., Lin, X. Wnt/beta-catenin signaling directly regulates Foxj1 expression and ciliogenesis in zebrafish Kupffer's vesicle. Development. 139 (3), 514-524 (2012).
  18. Wang, G., et al. The Rho kinase Rock2b establishes anteroposterior asymmetry of the ciliated Kupffer's vesicle in zebrafish. Development. 138 (1), 45-54 (2011).
  19. Aamar, E., Dawid, I. B. Sox17 and chordin are required for formation of Kupffer's vesicle and left-right asymmetry determination in zebrafish. Dev. Dyn. 239 (11), 2980-2988 (2010).
  20. Neugebauer, J. M., Amack, J. D., Peterson, A. G., Bisgrove, B. W., Yost, H. J. FGF signalling during embryo development regulates cilia length in diverse epithelia. Nature. 458 (7238), 651-654 (2009).
  21. Schneider, I., et al. Zebrafish Nkd1 promotes Dvl degradation and is required for left-right patterning. Dev. Biol. 348 (1), 22-33 (2010).
  22. Matsui, T., et al. Canopy1, a positive feedback regulator of FGF signaling, controls progenitor cell clustering during Kupffer's vesicle organogenesis. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 108 (24), 9881-9886 (2011).
  23. Shu, X., et al. Na,K-ATPase alpha2 and Ncx4a regulate zebrafish left-right patterning. Development. 134 (10), 1921-1930 (2007).
  24. Esguerra, C. V. Ttrap is an essential modulator of Smad3-dependent Nodal signaling during zebrafish gastrulation and left-right axis determination. Development. 134 (24), 4381-4393 (2007).
  25. Rosen, J. N., Sweeney, M. F., Mably, J. D. Microinjection of Zebrafish Embryos to Analyze Gene Function. J. Vis. Exp. (25), e1115 (2009).
  26. Yuan, S., Sun, Z. Microinjection of mRNA and Morpholino Antisense Oligonucleotides in Zebrafish Embryos. J. Vis. Exp. (27), e1113 (2009).
  27. Molina, G., et al. Zebrafish chemical screening reveals an inhibitor of Dusp6 that expands cardiac cell lineages. Nat. Chem. Biol. 5 (9), 680-687 (2009).
  28. Kimmel, C. B., Ballard, W. W., Kimmel, S. R., Ullmann, B., Schilling, T. F. Stages of embryonic development of the zebrafish. Dev. Dyn. 203 (3), 253-310 (1995).
  29. Schneider, I., Houston, D. W., Rebagliati, M. R., Slusarski, D. C. Calcium fluxes in dorsal forerunner cells antagonize beta-catenin and alter left-right patterning. Development. 135 (1), 75-84 (2008).
  30. Clement, A., Solnica-Krezel, L., Gould, K. L. The Cdc14B phosphatase contributes to ciliogenesis in zebrafish. Development. 138 (2), 291-302 (2011).
  31. Matsui, T., Bessho, Y. Left-right asymmetry in zebrafish. Cell Mol. Life Sci. , (2012).

Tags

Developmental Biology genetik cellebiologi Neuroscience Molecular Biology Bioengineering Biofysik Cilia zebrafisk, Gene Knockdown Techniques Venstre-højre asymmetri cilier Kupffer s vesikel dyr model
Analyse af genfunktioner og Visualisering af Cilia er genereret Fluid Flow i Kupffer s vesikel
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Wang, G., Yost, H. J., Amack, J. D.… More

Wang, G., Yost, H. J., Amack, J. D. Analysis of Gene Function and Visualization of Cilia-Generated Fluid Flow in Kupffer's Vesicle. J. Vis. Exp. (73), e50038, doi:10.3791/50038 (2013).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter