Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

Analyse der Genfunktion und Visualisierung von Cilia-Generated Fluid Flow in Kupffer-Vesicle

Published: March 31, 2013 doi: 10.3791/50038
Automatic Translation
1, 2, 1
1Department of Cell and Developmental Biology, State University of New York, Upstate Medical University, 2Department of Neurobiology and Anatomy, Eccles Institute of Human Genetics, University of Utah

Summary

Cilia-generated Fluidströmung in Kupffer-Vesikel (KV) steuert links-rechts Strukturierung des Zebrafisch-Embryos. Hier beschreiben wir ein Verfahren zur Modulation Genfunktion spezifisch in Zellen KV. Darüber hinaus zeigen wir, wie fluoreszierende Kügelchen in KV liefern Strömung zu visualisieren.

Abstract

Inneren Organen wie Herz, Gehirn und Darm entwickeln Links-Rechts-(LR) Asymmetrien, die kritisch für ihre normale Funktion 1 sind. Motile Zilien sind bei der Festlegung LR Asymmetrie in Wirbeltierembryonen, einschließlich Maus, Frosch und Zebrafisch 2-6 beteiligt. Diese "LR Zilien, Generate asymmetrischen Fluidströmung, die erforderlich sind, um eine konservierte asymmetrischen Nodal (TGF-β-Superfamilie) Signalkaskade in der linken Seitenplatte Mesoderm, die vermutlich LR Strukturieren Informationen zum Entwickeln Organen 7 bereitzustellen wird auslösen soll. Somit, um Mechanismen LR Strukturieren zu verstehen, ist es wichtig, Gene, die die Organisation des LR Flimmerzellen, die Motilität und die Länge von LR Zilien und ihrer Fähigkeit, stabile asymmetrische Strömung erzeugen regulieren identifizieren.

In der Zebrafisch-Embryos werden LR Flimmerhärchen in Kupffer-Vesikel (KV) 2,4,5 entfernt. KV ist aus einer einzigen Schicht von Epithelzellen umfaßt monociliateddass ein mit Flüssigkeit gefüllten Hohlraum umschließen. Schicksal Mapping hat gezeigt, dass KV aus einer Gruppe von ~ 20-30 Zellen als dorsalen Vorläuferzellen (DFCs), die an der dorsalen Rand Blastoderm wandern während epiboly Stufen 8,9 bekannt abgeleitet ist. Während der frühen Somiten Stufen, um DFCs Cluster und differenzieren sich in Flimmerepithelzellen KV in der Schwanzknospe des Embryos 10,11 bilden. Die Fähigkeit, zu identifizieren und zu verfolgen DFCs-in Kombination mit optischen Transparenz und rasche Entwicklung des Zebrafisch-Embryos-make Zebrafisch KV ein hervorragendes Modell System LR Flimmerzellen studieren.

Interessanterweise behalten Vorläuferzellen des DFC / KV Zellstammbaums cytoplasmatischen Brücken zwischen dem Eigelb Zelle bis zu 4 Stunden nach der Befruchtung (HPF), während zytoplasmatische Brücken zwischen dem Eigelb Zelle und andere embryonalen Zellen schließen nach 2 hpf 8. Unter Ausnutzung dieser zytoplasmatischen Brücken, entwickelten wir ein Stadium-spezifische Injektion Strategie Morpholino Oligonucleotide liefernotides (MO) ausschließlich DFCs und Knockdown die Funktion eines gerichteten Gens in diesen Zellen 12. Diese Technik schafft chimären Embryos in dem Genfunktion in dem DFC / KV Linie entwickeln im Kontext eines Wildtyp-Embryos wird geklopft. Um asymmetrische Strömung in KV analysieren, injizieren wir fluoreszierenden Mikrokügelchen in den KV Lumen und aufzeichnen bead Bewegung mit Videomikroskopie 2. Fluidströmung einfach visualisiert und können durch die Verfolgung bead Verschiebung im Laufe der Zeit quantifiziert werden.

Hier mit dem stufenspezifischen DFC-Zielgens Knockdown Technik und Injektion von fluoreszierenden Mikrokugeln in KV zu fließen visualisieren stellen wir ein Protokoll, das einen effektiven Ansatz, um die Rolle eines bestimmten Gens während KV Entwicklung und Funktion charakterisieren bereitstellt.

Protocol

Übersicht der Stage-Specific Zebrafisch Embryo Injections

Antisense Oligonukleotide Morpholino (MO), die zu einer gezielten mRNA binden und stören Proteinexpression von diesem Transkript, sind weit verbreitet in Knockdown Gen verwendet (Loss-of-function) Studien im Zebrafisch 13,14. Gene Tools, LLC bietet MOs, die entweder mit Carboxyfluorescein (emittiert grüne Fluoreszenz) oder Lissamin (emittiert rote Fluoreszenz) getaggt sind, MO in injizierten Embryonen durch Fluoreszenzmikroskopie zu erkennen. Durch Einspritzen von MO in den Dotter Zelle in verschiedenen Stadien des Zebrafisches Entwicklung ist es möglich, die MO nach bestimmten Kompartimenten des Embryos (1A-F) zu liefern. MO in den Dotter zwischen den Zellstadien 1-4 (0-1 hpf) tritt alle embryonalen Zellen (1A, D, D ') über die Anschlüsse, die mit dem Eigelb, bis das 32-Zellen-Stadium 15 globalen Knockdown erleichtern fortbestehen injiziert. MO injiziert in den Dotter in midblastula Stufen (2.5-3 hpf) können die Vorfahren der DFCs (1B, E, E ') wahrscheinlich durch cytoplasmatische Brücken 8 und knockdown Genfunktion speziell in der DFC / KV Zelllinie 12, ohne Eingabe meisten anderen embryonalen Zelllinien geben . Als wichtige Kontrollfunktion zu testen, ob Genfunktion in DFC / KV oder auch im Eigelb 12,16 erforderlich ist, ist es auch möglich, MO nach dem Eigelb-Zelle zu beschränken durch Einspritzen zwischen den kuppelartigen 30% epiboly Stufen (~ 4,5 hpf) nach alle zytoplasmatische Brücken geschlossen (1C, F, F '). Diese Injektionen wurden in Kombination verwendet werden, um Genfunktion in DFC / KV Zellen 17-24 analysieren. Um den Fluidstrom in KV beurteilen, werden fluoreszierenden Mikrokugeln in das Lumen zwischen den KV 6-10 somite Stufen (12-14 hpf) abgebildet und dann sofort mit Videomikroskopie (Abbildungen 1G-J). Eingespritzt Mikroperlen sind verfügbar, rot oder grün emittieren Fluoreszenz (oder beides), so ist es möglich, unterschiedliche verwendenKanäle Bild fluoreszierenden Mikrokügelchen und MO.

Ein. Stage-spezifische Injektion von Morpholinos (MO)

Die Injektion von MO in Zebrafisch-Embryonen wurde zuvor 25,26 demonstriert. Hier beschreiben wir kurz stage-spezifische MO-Injektionen. Nach aller Injektionen, werden Embryonen in eine Petrischale überführt und bei 28,5 ° C.

  1. Globale MO Injektion: Collect Embryonen unmittelbar nach der Befruchtung und laden Sie sie in einer Injektion Platte. Legen fluoreszierende MO in eine Kapillare Nadel und montieren Sie die Nadel auf einer Mikroinjektor (zB Harvard Apparatus PLI-90 Pico-Injektor). Brechen die Nadelspitze und justieren Injektionseinstellungen (Druck und / oder Zeit), um eine Injektion Tropfen, der ein Volumen von 1 nl beschriebenen 25,26 weist erstellen. Verwenden eines Sezieren Stereomikroskop injizieren 1 nl von MO in den Dotter (1A) von ≥ 50 Embryonen pro Versuch. Arbeiten Sie schnell zu Injektionen mit dem 4-Zellen stag abzuschließenE.
  2. DFC-gezielte MO Injektion: Collect Embryonen unmittelbar nach der Befruchtung und bei 28,5 ° C inkubieren Wenn die Embryonen haben die 256-Zell-Stadium (~ 2,5 hpf) erreicht, schnell laden Sie sie in einer Injektion Platte und dann spritzen 1 nl von fluoreszierenden MO in den Dotter von ≥ 100 Embryonen zwischen den 256-Zell-und 1.000-Zell-Stadium (Abbildung 1B).
  3. Yolk-gezielte MO Injektion: Collect Embryonen unmittelbar nach der Befruchtung und inkubieren bei 28,5 ° C. Auf die Kuppel Stufe (~ 4 hpf), laden die Embryonen in eine Einspritzplatte und dann einzuspritzen 1 nl fluoreszierender MO im Eigelb von ≥ 100 Embryonen zwischen der Kuppel und 30% epiboly Stufen (Abbildung 1C).

2. Auswahl injizierten Embryonen für die Analyse

  1. Wenn MO Embryonen erreichen die 75%-epiboly Stufe (8 hpf) eingespritzt wird, zu entfernen und tote unbefruchteten Eizellen und dann Bildschirm lebenden Embryonen unter Fluoreszenz Präpariermikroskop zur Verteilung der fluoreszierenden MO. Dann allow gewählt Embryonen bei 28,5 entwickeln ° C.
    1. Für globale MO-Injektionen, wählen Embryonen, die Fluoreszenz gleichmäßig in in allen embryonalen Zellen (Abbildung 1D; 2A) verteilt.
    2. Für gezielte DFC-MO Injektionen, auszuwählen, in denen Embryonen fluoreszierende MO gesamten Dotter diffundiert ist und scheint an der dorsalen Blastoderm Marge (DFCs) (1E; 2B) eingeengt. In dieser Phase kann es schwierig sein, fluoreszierenden DFCs durch helle Fluoreszenz in der darunterliegenden Dotter visualisieren. Achten Sie darauf, Embryonen, in denen das fluoreszierende MO in embryonale Zellen außer DFCs eingebaut wurde oder bleibt aggregiert an der Injektionsstelle (Abbildung 2D) auszuschließen.
    3. Für yolk-gezielte MO-Injektionen, wählen Embryonen, in denen MO Fluoreszenz gleichmäßig über das Eigelb verteilt wird und nicht in einem embryonalen Zellen (1F, 2C) beobachtet. Wiederum entfernen Embryonen in der die fluoreszierende MO bleibtaggregiert an der Injektionsstelle.
  2. Zwischen den 2-4-somite Stufen (~ 11 hpf), Embryonen Bildschirm ein zweites Mal unter einem Fluoreszenzmikroskop mit stärkerer Vergrößerung. Dann lassen ausgewählten Embryonen bei 28,5 entwickeln ° C.
    1. Für globale MO Injektionen, sicherzustellen ausgewählten Embryonen MO Fluoreszenz gleichmäßig in KV und alle embryonalen Zellen (1D '; Abbildung 2E) verteilt.
    2. Für DFC-gezielte MO Injektionen, sorgfältig auszuwählen Embryonen, MO Fluoreszenz nur in KV-Zellen und das Eigelb (1E) haben. Transgenen Embryos, die Ausdruck GFP in KV Zellen wie Tg (Dusp6: d2EGFP) 27, bei der Identifizierung von Embryonen in der MO erfolgreich an KV Zellen (2F) geliefert unterstützen kann. Verwerfen von Embryonen mit MO Fluoreszenz in embryonalen Zellen anderen, dass KV-Zellen.
    3. Für yolk-gezielte MO-Injektionen, wählen Embryonen, die MO-Fluoreszenz haben ausschließlich im Eigelb (1F ': Abbildung2G).

3. Montage Embryonen Fluid Flow in KV Analysieren

  1. Um asymmetrische Strömung in KV der globalen MO analysieren, MO oder Eigelb-gezielte MO injizierten Embryonen DFC-gezielte, sorgfältig dechorionate ~ 20 Embryonen zwischen 4-6 Somiten Stufen (~ 11-12 hpf) mit scharfen Pinzette.
  2. Planen 50 ml 1% mit niedrigem Schmelzpunkt Agarose und Aliquot in 5 ml Röhrchen als Flüssigkeit in einem trockenen Bad bei 42 ° C gehalten werden
  3. Übertragen eines Embryos zu einem Glas Depressionen slide (United Scientific Supplies, Inc.) und entfernen Sie so viel wie möglich am Wasser. Immobilisierung des Embryos, indem genügend warme 1% niedrig schmelzende Agarose gerade bedeckt den Embryo (zu viel Agarose mit anschließender Bildgebung stören). Wie die Agarose erstarrt, verwenden Pinzette, um den Embryo einer solchen Position, dass KV nach oben (dorsal) (Abbildung 1H). Montieren 10 Embryonen mit einem Embryo pro Folie. Arbeiten Sie schnell, um sicherzustellen, dass alle Injektionen in den nächsten Schritt komplETED vom 10 Somiten-Stadium (14 hpf).

4. Die Injektion von Fluorescent Microbeads in KV

  1. Verdünnte Fluoresbrite Multifuorescent 0,5 Mikron Durchmesser Mikrokugeln (Polysciences, Inc.) bis 1:50 in sterilem Wasser in einem 1,5 ml Eppendorf-Röhrchen.
  2. Mischen Sie die 1:50-Verdünnung von Mikroperlen gründlich durch Antippen des Röhrchens und laden 3 ul in eine Kapillare Nadel. Mit der gleichen Mikroinjektor für MO-Injektionen (zB Harvard Apparatus PLI-90 Pico-Injektor) verwendet, brechen die Nadelspitze mit einer Pinzette und passen Sie die Injektion Einstellungen, um die kleinstmögliche (<0,5 nl) Injektion Tropfen zu erzeugen.
  3. Unter einem Binokular, richten Sie die Nadel mit der KV Lumen der ersten montiert Embryo. Führen Sie die Nadel in das Lumen und injizieren ein kleines Volumen (<0,5 nl) von Perlen (1G). Eine kleine Nadelspitze und kleinen Injektionsvolumen sind entscheidend, um eine Beschädigung KV vermeiden.
  4. Inject alle gemounteten Embryonen. Sobald ein Embryo war injected, ein Tropfen von sterilem Wasser kann auf der Oberseite der Agarose gegeben werden, um sie vor dem Austrocknen zu verhindern. Im Verlauf der Injektionen, werden die Kügelchen oft behindern die Nadelöffnung. Das erfordert ein Brechen der Nadelspitze und Einstellen der Einspritzvolumen durch Modulieren des Drucks oder Zeiteinstellung des Mikroinjektionsvorrichtung. Ersetzen Sie die Nadel, wenn es stumpf genug, um erhebliche Schäden während der Injektion verursacht wird.
  5. Bildschirm die injizierten Embryonen für die erfolgreiche Durchführung der Perlen unter einer aufrechten fluoreszierende Verbindung Mikroskop (zB Zeiss AxioImager M1) mit einem 20x-Objektiv. Erstens, festzustellen, ob KV intakt mit Hellfeldbeleuchtung (Abbildung 1J) ist, und verwenden Sie dann Fluoreszenz, um die Perlen zu beobachten. Wählen Embryonen, in denen Perlen vorhanden sind und sich innerhalb des KV Lumen. Verwerfen von Embryonen mit KV Schäden oder ohne schwimmende Perlen in KV. Es ist leicht zu KV verpassen und liefern Perlen umliegendes Gewebe oder der zugrunde liegenden Eigelb. Wenn erfolglos, mount anoweitere 10 Embryonen und wiederholen Sie die Injektion.

5. Visualisierung und Analyse von KV Strömungstechnik

  1. Für jeden ausgewählten Embryos mit Perlen im Inneren KV, einen Tropfen von sterilem Wasser, um die Agarose zu decken und dann beobachten, KV unter dem aufrechten fluoreszierende Verbindung Mikroskop unter Verwendung eines 63X Wasser Eintauchen Ziel (Abbildung 1I). Alternativ kann ein Deckglas für die Verwendung mit Wasser nicht Eintauchen Ziele und / oder inverse Mikroskope aufgebracht werden.
  2. Verwenden Sie ein High-Speed-Kamera auf dem Mikroskop montiert (z. B. Zeiss AxioCamHSm), um eine 10 sec Film aufzuzeichnen. Notieren Sie sowohl die Perlen mit dem fluoreszierenden Kanal (ca. 70 Bilder / s) und die KV Lumen mit einer Hellfeld-oder Differential-Interferenz-Kontrast (DIC) Kanal.
  3. Um alle bead Bewegungen im Laufe der Zeit zu visualisieren, importieren Sie den Film von fluoreszierenden Kügelchen in ImageJ-Software (kostenloser Download unter http://rsb.info.nih.gov/ij/ ) einend eine maximale Projektion aller Fluoreszenzsignale im Film. Um die maximale Projektion in ImageJ durchzuführen, klicken Sie auf "Bild → Stacks → Z-Projekt." In der "Z-Projekt" Fenster Projekt Scheiben mit Projektionsfläche Art von "Max Intensität". Dieses Bild kann auf einem Bild des DIC KV in denen die Perlen abgebildet (3A-B) wurden übereinandergelegt werden.
  4. Die Bewegungen der einzelnen Perlen, können sie mithilfe ImageJ werden. Ein Plugin ("Manual Tracking") kann heruntergeladen werden unter http://rsbweb.nih.gov/ij/plugins/track/track.html . Öffnen Sie das fluoreszierende Kügelchen Film in ImageJ und führen Sie das manuelle Tracking-Funktion. In dem Fenster der manuellen Tracking, zu überprüfen "show parameters" und Eingabeparameter für "Zeitintervalle" und "x / y-Kalibrierung". Manuell auswählen Perlen, die in der Brennebene des Films für ≥ 50 Frames bleiben und dann zu verfolgen ≥ 5 Perlen pro Embryo. Der Weg und die Geschwindigkeit eines jeden Wulstes durch th erzeugtene Software (Abbildungen 3 CD).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Stufenspezifischen MO Injektionen stellen einen nützlichen Ansatz Genfunktion in bestimmten Kompartimenten des Embryos zu analysieren. Abbildung 1 zeigt ein Flussdiagramm der Injektion Strategien verwendet werden, um Genfunktion in DFC / KV Zellen und wie zu testen, um fluoreszierende Beads einzuführen, um den Fluidstrom zu visualisieren in KV. Die Verteilung der fluoreszierenden MO in erfolgreichen stufenspezifischen injizierten Embryonen ist schematisch in den 1D-F und mit lebenden Embryonen in Abbildung 2 dargestellt. Ein erfolgloser MO Injektion, bei der die MO bleibt im Eigelb Zelle aggregiert, in 2D gezeigt.

Erfolgreich-injizierten Embryonen ausgewählt basierend auf der Lokalisierung von MO-fluoreszierenden kann an den Stufen 4-6 somite Lieferung von fluoreszierenden Mikrokugeln in das Lumen KV (Fig. 1G-H), um eine Fluidströmung zu analysieren montiert werden. Videomikroskopie dient zum Wulst Bewegungen in KV (Fig. 1I-J), die aufzeichnen kann qualitativ analysiert werden (3A-B) oder quantitativ (3C-D) unter Verwendung ImageJ Software. In einem Kontrollexperiment Embryo mit normalen Fluss, folgen Kügelchen Pfade, die sichtbar gemacht werden kann, indem sie eine maximale Projektionsfläche von fluoreszierenden Kügelchen Positionen über die Zeit (3A) oder durch Verfolgen einzelner Sicken über die Zeit (3C) entgegen dem Uhrzeigersinn. Um den Verlust der koordinierten Flow demonstrieren, injizierten wir Embryonen mit MO den Zuschlag Rho-Kinase-2b (Rock2b), die wir bisher gezeigt haben, stört Strömung 18. In Rock2b MO injizierten Embryonen, bewegen Perlen zufällig in KV (3B, D). ImageJ Software wurde verwendet, um die Geschwindigkeit der einzelnen Kügelchen Spuren berechnen. Die mittlere Geschwindigkeit von 5 Kügelchen aus Steuerung und Rock2b MO Embryonen wird in 3E gezeigt.

es.jpg "src =" / files/ftp_upload/50038/50038fig1.jpg "/>
Abbildung 1. Überblick über stufenspezifischen MO Injektionen und Mikroperle Injektion in KV. (A) Injektion von fluoreszierenden MO (rot) in dem Eigelb an der 1-Zellen-Stadium eine weltweite Verteilung der MO gesamten Embryos. (B) MO Injektion an der 512-Zellen-Stadium DFC-gezielt auf MO in DFC / KV-Zellen laden. (C) MO Injektion bei 30%-epiboly Bühne Yolk-gezielt auf MO dem Eigelb zu beschränken. (DF ') Schematische Darstellung der Verteilung von fluoreszierenden MO (rot) in erfolgreich injizierten Embryonen bei der 75% epiboly Stufe (D, E, F) und der 6 somite Stufe (D', E ', F') folgende Stufe- spezifische Injektionen. MO akkumuliert in dem DFC / KV Zellstammbaums, wenn an der 512-Zellen-Stadium (Pfeile in E, E ') injiziert wird, jedoch nicht, wenn bei 30% epiboly (Pfeile F, F' eingespritzt). (G) Injektion von fluoreszierenden Mikrokügelchen (grün) in der KV Lumen. (H) A propnungsgemäß montiert Embryo mit KV (Pfeil) nach oben zum Mikroperle Injektion. (I) Imaging Perlen Bewegung in KV mit einem aufrechten Mikroskop. (J) Hohe Vergrößerung einer intakten KV Lumen mit Mikroperlen injiziert. Embryonalstadien und Embryo-Zeichnungen auf ref basiert. 28.

Abbildung 2
Abbildung 2. Auswahl von Embryonen nach dem Stadium-spezifische MO-Injektionen. (AC) Beispiele für ausgewählte Embryonen bei der 75% epiboly Stufe (8 hpf), in dem fluoreszierende MO (rot) entweder in allen embryonalen Zellen nach Injektion globalen MO (A), durch den Dotter und DFCs (Pfeil) diffundiert nach DFC eingeflossen MO-bezogenen Einspritzung (B) oder in dem Eigelb blieb nach Dotter-bezogenen MO Einspritzung (C). (D) Beispiel eines ausgeschlossenen Embryo in denen die fluostofflampen MO aggregiert an der Injektionsstelle. (ZB) Beispiele für fluoreszierende MO (rot) Verteilung in ausgewählten Embryonen im 4-somite Stufe (11,5 hpf). DIC Bilder zu identifizieren die KV Lumen (Pfeil) in transgenen Tg (Dusp6: d2EGFP) Embryonen, die ausdrückliche GFP in KV Zellen 27. In der globalen MO injizierten Embryonen wurde MO in KV und alle umgebenden Zellen (E) beobachtet. In der DFC-gezielte MO injizierten Embryos, MO mit GFP in den meisten KV-Zellen co-lokalisiert und war auch in den zugrunde liegenden Eigelb Kerne (F). In dem Eigelb gezielten Embryo wurde MO ausschließlich in Eigelb Kerne (G) gefunden.

Abbildung 3
Abbildung 3. Qualitative und quantitative Analysen der Strömung in KV. (AB) Zur qualitativen Analyse der Strömung eine maximale Projektion eines 10 sec Film zeigt Bewegung aller fluoreszent Mikroperlen in KV injiziert wurde auf einem Bild des DIC KV Lumen in einer globalen Steuerung MO (A) oder Rock2b MO (B) injiziert Embryo überlagert. (CE) zu quantifizieren Strömung Bewegung einzelner Mikroperlen (n = 5) in einer Steuereinheit Embryo (C) und Rock2b MO injiziert Embryo (D) verfolgt wurde und verwendet, um einen mittleren Wulst Geschwindigkeit (E) zu berechnen. Circles (CD) Angleichung der KV Lumen Grenzen. Fehlerbalken (E) stellen eine Standardabweichung.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Mit stage-spezifischen Injektionen MO dem DFC / KV Zelllinie Ziel ist ein nützlicher Ansatz zur Zell-Autonomie der Genfunktion zu studieren und zu vermeiden pleiotrope Phänotypen verursacht durch die globale Gen knockdown. Allerdings können diese Injektionen technisch anspruchsvoll. Injektion von MO zwischen den 256-Zelle und 1000-Zellen-Stufen können in drei möglichen Ergebnissen führen: 1) die MO bleibt aggregiert an der Injektionsstelle, 2) die MO diffundiert während des Eigelbs und tritt DFC / KV Zellen oder 3) das MO diffundiert während der Dotter und tritt DFC / KV-Zellen und anderen embryonalen Zellen. Daher Auswahl Embryonen, in denen MO exklusiv den DFC / KV-Zellen verschoben ist ein wichtiger Schritt in diesem Experiment. Es ist wichtig anzumerken, dass MO kann in alle DFC / KV Zellen geladen werden aber häufig tritt nur eine Teilmenge dieser Zellen 10. Die Gründe für dieses Mosaik Targeting bleiben unklar, aber möglicherweise Variabilität, wie effizient die MO bewegt sich durch das Eigelb und / oder den Zeitpunkt der Schließung der ind reflektierenividual Brücken zwischen dem Eigelb und DFC Vorläuferzellen. Wir haben keine Bedingungen gefunden, dass Erhöhung Targeting Effizienz, sondern auf die Auswahl Embryonen, in denen die meisten der KV Zellen bis MO genommen haben verlassen haben. Die Erfolgsrate für die Erzeugung von Embryonen mit MO in der Mehrzahl der DFC / KV-Zellen ist in der Regel ~ 20-30%, aber das kann sehr variabel von Tag zu Tag. Aus diesem Grund empfehlen wir Injektion so viele Embryonen wie möglich (≥ 100), und dann sorgfältig die Auswahl der Embryonen, die entsprechende Verteilung der fluoreszierenden Morpholino haben.

Kontrollexperimente sind entscheidend für die Interpretation der Ergebnisse der DFC-gezielte Injektionen. Ein Missverhältnis MO-oder Standard-negative Kontrolle MO (von Gene Tools, LLC) sollte verwendet werden, um unspezifische Effekte zu steuern. Da zusätzlich DFC-bezogenen Injektionen MO liefern sowohl dem Eigelb und DFC / KV Zellstammbaum (2F), ist es wichtig zu bestimmen, ob Phänotypen in diesen Embryos durch den Verlust von Gen Spaßction in DFC / KV Zellen oder im Eigelb Zelle. Vergleicht Phänotypen in DFC gezielte Embryonen mit Eigelb gezielte Embryonen (Abb. 2F-G) zu identifizieren DFC / KV zellspezifische beeinflusst. Natürlich können einige Gene sowohl in den DFC / KV-Zellen und dem Eigelb 16 funktionieren. Obwohl wir konzentrieren von MO-vermittelten loss-of-function-Analysen hier kann das DFC-bezogenen Injektionstechnik und zugehörigen Steuer Experimenten verwendet, um ein gain-of-function durch Einspritzen synthetischen mRNA, ein bestimmtes Protein in dem DFC / KV überexprimieren beurteilen Linie 17,22,24,29. Eine clevere Adaption dieser Ansatz verwendet DFC-gezielte mRNA Injektionen globalen MO knockdown nur in DFC / KV Zellen 30 zu retten. Es sollte jedoch angemerkt, dass nicht alle mRNAs auf diese Weise die zur Expression des kodierten Proteins in DFCs und KV Zellen und wichtigen Elemente injiziert enthalten sollte, um das Niveau der Proteinexpression und-verteilung zu beurteilen sein.

Erfolgreiche Lieferung von Mikrokügelchens in den KV Lumen asymmetrischen Fluss Beurteilung hängt Injektion die Perlen bei optimaler Stadien während der rasanten Entwicklung der transienten KV Orgel. Wir beginnen Montage Embryonen bei der 4-6 somite Stufen (~ 12 hpf) und dann einzuspritzen Mikroperlen in KV bis 10 somite Stufe (14 hpf). Vor der 4 somite Stufe ist das Lumen oft zu klein zu injizieren, und in späteren Phasen (> 10 Somiten) die Injektion wird schwierig aufgrund KV Bewegen tiefer in den Embryo. Eine Einschränkung dieses Verfahrens besteht darin, daß der KV benötigt Lumen bis zu einer Größe, die erfolgreich mit Microbeads injiziert werden kann expandieren. In Fällen, in denen MO knockdown eines bestimmten Gens stört die KV Organisation und / oder reduziert KV Lumengröße (Übersicht in Lit. 31). Wird es schwierig sein, wenn nicht gar unmöglich, Assay-Flow mit diesem Ansatz.

Bei der Herstellung Embryonen zur Injektion von Mikroperlen in KV, ist es wichtig, den Embryo gerade entlang der embryonalen Achse nach oben mit KV (Fig. 1H montieren), Als Embryo Lage beeinflussen den Winkel, dass die Nadel KV und den Winkel des bildgebenden Kügelchen in KV eintritt. Es ist auch wichtig, eine Kleinkaliber-Injektionsnadel und kleinen Injektionsvolumen von Mikrokügelchen zu verwenden, um schädliche KV zu verhindern. Wir empfehlen praktizieren, um einen reibungslosen Einspritzhub um die Nadel in KV einfügen zu entwickeln, lassen Sie die Perlen und dann schnell zurückziehen Nadel aus dem Embryo. Wenn die Bedingungen optimal sind, sind wir in der Lage, erfolgreich zu liefern Mikroperlen auf ~ 50% (zB n = 5/10) der injizierten Embryonen.

Zusammenfassend liefern stufenspezifischen MO Injektionen und Visualisierung von Mikroperlen in KV die Möglichkeit, die Funktion der Kandidatengene LR Flimmerzellen studieren.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Keine Interessenskonflikte erklärt.

Acknowledgments

Wir danken Fiona Foley für exzellente lab Unterstützung und Zebrafisch Pflege. Diese Arbeit wurde eine AHA Promotionsstipendium GW (11PRE5730027) und NHLBI Zuschüsse HJY (R01HL66292) und JDA (R01HL095690) unterstützt.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Standard Control oligo-Lissamine tagged Gene Tools, LLC
Custom Rock2b morpholino oligo Gene Tools, LLC
Fluoresbrite Multifluorescent 0.5 micron Microspheres Polysciences, Inc. 24054

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Sutherland, M. J., Ware, S. M. Disorders of left-right asymmetry: heterotaxy and situsinversus. Am. J. Med. Genet. C Semin. Med. Genet. 151C (4), 307-317 (2009).
  2. Essner, J. J., Amack, J. D., Nyholm, M. K., Harris, E. B., Yost, H. J. Kupffer's vesicle is a ciliated organ of asymmetry in the zebrafish embryo that initiates left-right development of the brain, heart and gut. Development. 132 (6), 1247-1260 (2005).
  3. Nonaka, S., et al. Randomization of left-right asymmetry due to loss of nodal cilia generating leftward flow of extraembryonic fluid in mice lacking KIF3B motor protein. Cell. 95 (6), 829-837 (1998).
  4. Essner, J. J., et al. Conserved function for embryonic nodal cilia. Nature. 418 (6893), 37-38 (2002).
  5. Kramer-Zucker, A. G., et al. Cilia-driven fluid flow in the zebrafish pronephros, brain and Kupffer's vesicle is required for normal organogenesis. Development. 132 (8), 1907-1921 (2005).
  6. Schweickert, A., et al. Cilia-driven leftward flow determines laterality in Xenopus. Curr. Biol. 17 (1), 60-66 (2007).
  7. Tabin, C. J. The key to left-right asymmetry. Cell. 127 (1), 27-32 (2006).
  8. Cooper, M. S., D'Amico, L. A. A cluster of noninvolutingendocytic cells at the margin of the zebrafish blastoderm marks the site of embryonic shield formation. Dev. Biol. 180 (1), 184-198 (1996).
  9. Melby, A. E., Warga, R. M., Kimmel, C. B. Specification of cell fates at the dorsal margin of the zebrafish gastrula. Development. 122 (7), 2225-2237 (1996).
  10. Amack, J. D., Wang, X., Yost, H. J. Two T-box genes play independent and cooperative roles to regulate morphogenesis of ciliated Kupffer's vesicle in zebrafish. Dev. Biol. 310 (2), 196-210 (2007).
  11. Oteiza, P., Koppen, M., Concha, M. L., Heisenberg, C. P. Origin and shaping of the laterality organ in zebrafish. Development. 135 (16), 2807-2813 (2008).
  12. Amack, J. D., Yost, H. J. The T box transcription factor no tail in ciliated cells controls zebrafish left-right asymmetry. Curr. Biol. 14 (8), 685-690 (2004).
  13. Nasevicius, A., Ekker, S. C. Effective targeted gene 'knockdown' in zebrafish. Nat. Genet. 26 (2), 216-220 (2000).
  14. Bill, B. R., Petzold, A. M., Clark, K. J., Schimmenti, L. A., Ekker, S. C. A primer for morpholino use in zebrafish. Zebrafish. 6 (1), 69-77 (2009).
  15. Kimmel, C. B., Law, R. D. Cell lineage of zebrafish blastomeres. I. Cleavage pattern and cytoplasmic bridges between cells. Dev. Biol. 108 (1), 78-85 (1985).
  16. Arrington, C. B., Yost, H. J. Extra-embryonic syndecan 2 regulates organ primordia migration and fibrillogenesis throughout the zebrafish embryo. Development. 136 (18), 3143-3152 (2009).
  17. Caron, A., Xu, X., Lin, X. Wnt/beta-catenin signaling directly regulates Foxj1 expression and ciliogenesis in zebrafish Kupffer's vesicle. Development. 139 (3), 514-524 (2012).
  18. Wang, G., et al. The Rho kinase Rock2b establishes anteroposterior asymmetry of the ciliated Kupffer's vesicle in zebrafish. Development. 138 (1), 45-54 (2011).
  19. Aamar, E., Dawid, I. B. Sox17 and chordin are required for formation of Kupffer's vesicle and left-right asymmetry determination in zebrafish. Dev. Dyn. 239 (11), 2980-2988 (2010).
  20. Neugebauer, J. M., Amack, J. D., Peterson, A. G., Bisgrove, B. W., Yost, H. J. FGF signalling during embryo development regulates cilia length in diverse epithelia. Nature. 458 (7238), 651-654 (2009).
  21. Schneider, I., et al. Zebrafish Nkd1 promotes Dvl degradation and is required for left-right patterning. Dev. Biol. 348 (1), 22-33 (2010).
  22. Matsui, T., et al. Canopy1, a positive feedback regulator of FGF signaling, controls progenitor cell clustering during Kupffer's vesicle organogenesis. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 108 (24), 9881-9886 (2011).
  23. Shu, X., et al. Na,K-ATPase alpha2 and Ncx4a regulate zebrafish left-right patterning. Development. 134 (10), 1921-1930 (2007).
  24. Esguerra, C. V. Ttrap is an essential modulator of Smad3-dependent Nodal signaling during zebrafish gastrulation and left-right axis determination. Development. 134 (24), 4381-4393 (2007).
  25. Rosen, J. N., Sweeney, M. F., Mably, J. D. Microinjection of Zebrafish Embryos to Analyze Gene Function. J. Vis. Exp. (25), e1115 (2009).
  26. Yuan, S., Sun, Z. Microinjection of mRNA and Morpholino Antisense Oligonucleotides in Zebrafish Embryos. J. Vis. Exp. (27), e1113 (2009).
  27. Molina, G., et al. Zebrafish chemical screening reveals an inhibitor of Dusp6 that expands cardiac cell lineages. Nat. Chem. Biol. 5 (9), 680-687 (2009).
  28. Kimmel, C. B., Ballard, W. W., Kimmel, S. R., Ullmann, B., Schilling, T. F. Stages of embryonic development of the zebrafish. Dev. Dyn. 203 (3), 253-310 (1995).
  29. Schneider, I., Houston, D. W., Rebagliati, M. R., Slusarski, D. C. Calcium fluxes in dorsal forerunner cells antagonize beta-catenin and alter left-right patterning. Development. 135 (1), 75-84 (2008).
  30. Clement, A., Solnica-Krezel, L., Gould, K. L. The Cdc14B phosphatase contributes to ciliogenesis in zebrafish. Development. 138 (2), 291-302 (2011).
  31. Matsui, T., Bessho, Y. Left-right asymmetry in zebrafish. Cell Mol. Life Sci. , (2012).

Tags

Entwicklungsbiologie Genetik Zellbiologie Neurowissenschaften Molekulare Biologie Bioengineering Biophysik Cilia Zebrafisch, Gene Knockdown Techniques Links-Rechts-Asymmetrie Zilien Kupffer-Vesikel Tiermodell
Analyse der Genfunktion und Visualisierung von Cilia-Generated Fluid Flow in Kupffer-Vesicle
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Wang, G., Yost, H. J., Amack, J. D.… More

Wang, G., Yost, H. J., Amack, J. D. Analysis of Gene Function and Visualization of Cilia-Generated Fluid Flow in Kupffer's Vesicle. J. Vis. Exp. (73), e50038, doi:10.3791/50038 (2013).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter