Summary
सिलिया उत्पन्न Kupffer पुटिका में द्रव का प्रवाह (केवी) zebrafish भ्रूण के बाएँ सही patterning नियंत्रित करता है. यहाँ, हम एक केवी कोशिकाओं में जीन समारोह विशेष रूप से मिलाना तकनीक का वर्णन. इसके अतिरिक्त, हम बताते हैं कि कैसे केवी में फ्लोरोसेंट मोती देने के लिए तरल पदार्थ का प्रवाह कल्पना.
Protocol
स्टेज विशिष्ट Zebrafish भ्रूण इंजेक्शन का अवलोकन
Antisense morpholino (एमओ) oligonucleotides, जो एक लक्षित mRNA करने के लिए बाध्य है और उस प्रतिलिपि से प्रोटीन अभिव्यक्ति को बाधित, जीन पछाड़ना में व्यापक रूप से उपयोग किया जाता है (नुकसान का समारोह) 13,14 zebrafish में अध्ययन करता है. जीन उपकरण, LLC राज्यमंत्री है कि या तो हरी प्रतिदीप्ति उत्सर्जन करता carboxyfluorescein या Lissamine (लाल प्रतिदीप्ति उत्सर्जन करता है) के साथ टैग कर रहे हैं इंजेक्शन फ्लोरोसेंट माइक्रोस्कोपी का उपयोग भ्रूण में एमओ का पता लगाने प्रदान करता है. जर्दी सेल में zebrafish के विकास के विभिन्न चरणों में एमओ इंजेक्शन लगाने के द्वारा, यह संभव है कि भ्रूण के विशिष्ट डिब्बों (आंकड़े 1 ए एफ) एमओ देने. MO 1-4 चरणों सेल (0-1 HPF) कनेक्शन के माध्यम से सभी भ्रूण जर्दी आंकड़े (1 ए, डी, डी ') के साथ जारी रहती है कि 32-सेल चरण 15 तक वैश्विक पछाड़ना को सुविधाजनक बनाने के लिए कोशिकाओं में प्रवेश करती है के बीच की जर्दी में इंजेक्शन. एमओ midblast दौरान जर्दी में इंजेक्शनula चरणों (2.5-3 HPF) विशेष रूप से सबसे अन्य भ्रूण सेल प्रजातियों में प्रवेश के बिना सेल / डीएफसी केवी 12 वंश में DFCS (आंकड़े 1 बी, ई, ई) cytoplasmic 8 पुलों और पछाड़ना जीन समारोह के माध्यम से होने की संभावना के progenitors दर्ज कर सकते हैं . जीन समारोह डीएफसी / केवी में भी या 12,16 जर्दी में आवश्यक है कि परीक्षण के लिए एक महत्वपूर्ण नियंत्रण के रूप में, यह भी संभव है के बाद गुंबद-30% epiboly चरणों (~ 4.5 HPF) के बीच इंजेक्शन द्वारा जर्दी सेल मो को प्रतिबंधित सभी cytoplasmic पुलों (आंकड़े 1C, एफ, एफ ') बंद कर दिया है. ये इंजेक्शन संयोजन में इस्तेमाल किया गया है / डीएफसी केवी 17-24 कोशिकाओं में जीन समारोह का विश्लेषण. केवी में द्रव का प्रवाह का आकलन, फ्लोरोसेंट microbeads 6-10 विखंड (12-14 HPF) चरणों और फिर तुरंत videomicroscopy (1G - जम्मू आंकड़े) का उपयोग imaged. के बीच केवी लुमेन में इंजेक्ट कर रहे हैं Microbeads उपलब्ध है कि लाल या हरी प्रतिदीप्ति (या दोनों) उत्सर्जित कर रहे हैं, तो यह संभव है का उपयोग करने के लिए अलगछवि फ्लोरोसेंट microbeads और एमओ चैनलों.
1. Morpholinos इंजेक्शन स्टेज विशिष्ट (एमओ)
MO zebrafish भ्रूण में इंजेक्शन 25,26 पहले प्रदर्शन किया गया है. यहाँ, हम संक्षेप में मंच विशिष्ट MO इंजेक्शन का वर्णन. सभी इंजेक्शन के बाद, भ्रूण एक पेट्री डिश में स्थानांतरित कर रहे हैं और 28.5 डिग्री सेल्सियस पर incubated
- ग्लोबल MO इंजेक्शन: तुरंत निषेचन के बाद भ्रूण को ले लीजिए और उन्हें एक इंजेक्शन प्लेट में लोड. लोड एक केशिका सुई में फ्लोरोसेंट MO माउंट और एक microinjector पर सुई (जैसे हार्वर्ड उपकरण पीएलआई-90 पिको सुई लगानेवाला). सुई टिप तोड़ और इंजेक्शन सेटिंग्स (दबाव और / या समय) को समायोजित करने के लिए एक विदारक stereomicroscope का उपयोग कर एक इंजेक्शन ड्रॉप है कि 1 nl की एक मात्रा के रूप में 25,26 वर्णित है. जर्दी में एमओ की 1 nl इंजेक्षन (चित्रा 1 ए) ≥ प्रयोग प्रति 50 भ्रूण की. जल्दी से काम करने के लिए हिरन 4 सेल द्वारा इंजेक्शन पूराई.
- डीएफसी लक्षित MO इंजेक्शन: भ्रूण निषेचन के बाद तुरंत ले लीजिए और 28.5 पर सेते हैं डिग्री सेल्सियस जब भ्रूण चरण में 256 सेल (~ 2.5 HPF) तक पहुँच चुके हैं, जल्दी से उन्हें एक इंजेक्शन की थाली में लोड करने के लिए और फिर ≥ 256-सेल और 1,000 सेल चरणों के बीच 100 भ्रूण की जर्दी में 1 फ्लोरोसेंट एमओ के nl इंजेक्षन (चित्रा ) 1B.
- जर्दी - लक्षित MO इंजेक्शन: निषेचन और सेते के तुरंत बाद 28.5 पर भ्रूण लीजिए डिग्री सेल्सियस गुंबद चरण (~ 4 HPF), एक इंजेक्शन की थाली में भ्रूण लोड और फिर ≥ गुंबद और 30% epiboly चरणों (चित्रा 1C) के बीच 100 भ्रूण की जर्दी में 1 फ्लोरोसेंट एमओ के nl इंजेक्षन.
2. विश्लेषण के लिए इंजेक्शन भ्रूण का चयन
- जब एमओ भ्रूण चरण में 75% epiboly तक पहुँचने (8 HPF) इंजेक्शन, unfertilized और मृत भ्रूण को हटाने और फिर फ्लोरोसेंट एमओ के वितरण के लिए एक फ्लोरोसेंट विदारक खुर्दबीन के नीचे रहने वाले भ्रूण स्क्रीन. फिर allow भ्रूण 28.5 पर विकसित करने के लिए चयनित डिग्री सेल्सियस
- इंजेक्शन वैश्विक एमओ के लिए, भ्रूण कि प्रतिदीप्ति समान रूप से सभी भ्रूण कोशिकाओं (चित्रा 1D, चित्रा 2A) भर में वितरित चयन करें.
- डीएफसी लक्षित MO इंजेक्शन के लिए, भ्रूण जिसमें फ्लोरोसेंट MO जर्दी भर में दूर तक फैला हुआ है और प्रतीत होता है पृष्ठीय निषिक्त (DFCS) मार्जिन (चित्रा 2B चित्रा 1E) पर ध्यान केंद्रित का चयन करें. इस स्तर पर, यह कठिन हो सकता फ्लोरोसेंट अंतर्निहित जर्दी में प्रतिदीप्ति उज्ज्वल कारण DFCS कल्पना कर सकते हैं. ख्याल रखना भ्रूण जो फ्लोरोसेंट MO भ्रूण DFCS के अलावा अन्य कोशिकाओं में शामिल किया गया है या इंजेक्शन साइट (चित्रा 2 डी) में एकत्रित रहता है बाहर.
- जर्दी लक्षित MO इंजेक्शन के लिए, भ्रूण में जो MO प्रतिदीप्ति समान जर्दी भर में वितरित किया जाता है और किसी भी भ्रूण कोशिकाओं (चित्रा 2C चित्रा 1F) में नहीं मनाया का चयन करें. फिर, भ्रूण में जो फ्लोरोसेंट MO रहता है दूरइंजेक्शन स्थल पर एकत्रित.
- 2-4 - विखंड चरणों (~ 11 HPF) के बीच, स्क्रीन भ्रूण उच्च वृद्धि का उपयोग कर एक फ्लोरोसेंट खुर्दबीन के नीचे एक दूसरी बार. फिर चयनित भ्रूण 28.5 पर विकसित करने की अनुमति डिग्री सेल्सियस
- वैश्विक MO इंजेक्शन के लिए सुनिश्चित करने के लिए, चयनित भ्रूण MO प्रतिदीप्ति केवी और सभी भ्रूण कोशिकाओं (चित्रा 1D '; चित्रा 2E) में समान रूप से वितरित.
- डीएफसी लक्षित MO इंजेक्शन के लिए, ध्यान से भ्रूण है कि केवी कोशिकाओं में ही MO प्रतिदीप्ति और जर्दी (चित्रा 1E ') का चयन करें. ट्रांसजेनिक भ्रूण के कि टीजी के रूप में केवी कोशिकाओं में व्यक्त GFP (Dusp6: d2EGFP) 27, भ्रूण जिसमें मो सफलतापूर्वक किया गया है केवी कोशिकाओं (चित्रा 2 एफ) के लिए दिया की पहचान में सहायता कर सकते हैं. एमओ प्रतिदीप्ति साथ अन्य है कि केवी कोशिकाओं भ्रूण कोशिकाओं में भ्रूण को त्यागें.
- जर्दी लक्षित MO इंजेक्शन के लिए, भ्रूण कि जर्दी (चित्रा 1F 'में एमओ प्रतिदीप्ति विशेष रूप से है का चयन: चित्रा2G).
3. के.वी. में द्रव प्रवाह विश्लेषण बढ़ते भ्रूण
- वैश्विक एमओ के के.वी. में असममित द्रव का प्रवाह का विश्लेषण करने के लिए, MO या जर्दी - लक्षित MO इंजेक्शन भ्रूण DFC - लक्षित ध्यान dechorionate ~ 4-6 तेज संदंश के साथ विखंड चरणों (~ 11-12 HPF) के बीच 20 भ्रूण.
- 5 मिलीग्राम एक सूखी स्नान में एक तरल पदार्थ के रूप में 42 पर बनाए रखा जा ट्यूबों डिग्री सेल्सियस में 1% कम पिघलने बिंदु agarose और अशेष भाजक के 50 मिलीलीटर की तैयारी
- एक गिलास अवसाद स्लाइड (संयुक्त वैज्ञानिक आपूर्ति, इंक) एक भ्रूण स्थानांतरण और संभव के रूप में पानी की बहुत दूर. पर्याप्त गर्म जोड़ने 1% कम पिघलने बिंदु agarose सिर्फ भ्रूण को कवर (बहुत ज्यादा agarose बाद इमेजिंग के साथ हस्तक्षेप कर सकते हैं) के द्वारा भ्रूण स्थिर. Agarose solidifies, संदंश का उपयोग करने के लिए इस तरह के भ्रूण की स्थिति है कि केवी का सामना करना पड़ रहा है (पृष्ठीय दृश्य) (1H चित्रा). 10 भ्रूण स्लाइड प्रति एक भ्रूण के साथ माउंट. जल्दी से काम करने के लिए सुनिश्चित करने के लिए अगले चरण में सभी इंजेक्शन compl10 विखंड चरण (14 HPF) द्वारा eted.
4. प्रतिदीप्त microbeads केवी में इंजेक्शन
- 1:50 Multifuorescent 0.5 माइक्रोन व्यास Microspheres (Polysciences, Inc) एक 1.5 मिलीलीटर Eppendorf ट्यूब में बाँझ पानी में Fluoresbrite पतला.
- Microbeads के 1:50 कमजोर पड़ने ट्यूब दोहन से अच्छी तरह से मिक्स और एक केशिका सुई में 3 μl लोड. वही MO इंजेक्शन (जैसे हार्वर्ड उपकरण पीएलआई-90 पिको सुई लगानेवाला) के लिए इस्तेमाल किया microinjector का प्रयोग, संदंश के साथ सुई टिप को तोड़ने और इंजेक्शन सेटिंग्स को समायोजित करने के लिए छोटी संभव (<0.5 nl) इंजेक्शन ड्रॉप उत्पन्न.
- एक विदारक माइक्रोस्कोप के तहत 1 घुड़सवार भ्रूण के केवी लुमेन के साथ सुई पंक्ति. लुमेन में सुई डालें और मोतियों की एक छोटी मात्रा (<0.5 nl) (चित्रा 1G) इंजेक्षन. एक छोटी सुई टिप और छोटे इंजेक्शन की मात्रा के लिए हानिकारक केवी से बचने के लिए महत्वपूर्ण हैं.
- सभी घुड़सवार भ्रूण इंजेक्षन. एक बार एक भ्रूण injecte किया गया हैघ, बाँझ पानी की एक बूंद agarose के शीर्ष पर जोड़ा जा सकता है और यह बाहर सुखाने से रोकने. इंजेक्शन के दौरान, मोती अक्सर सुई खोलने में बाधा डालती है. यह जरूरी है फिर से सुई टिप तोड़ने और modulating microinjection तंत्र के दबाव या समय की स्थापना द्वारा इंजेक्शन मात्रा का समायोजन. सुई की जगह अगर यह काफी कुंद करने के लिए इंजेक्शन के दौरान महत्वपूर्ण नुकसान का कारण बन जाता है.
- स्क्रीन एक ईमानदार फ्लोरोसेंट यौगिक सूक्ष्मदर्शी (जैसे Zeiss AxioImager एम 1) के तहत मोती के सफल प्रसव के लिए इंजेक्शन भ्रूण एक 20X उद्देश्य का उपयोग. सबसे पहले, निर्धारित क्या केवी संरचना brightfield रोशनी (चित्रा 1j) का उपयोग बरकरार है, और फिर प्रतिदीप्ति उपयोग को मोती का पालन. भ्रूण का चयन करें जिसमें मोती वर्तमान और केवी लुमेन के अंदर चल रहे हैं. केवी क्षति या केवी में कोई अस्थायी मोती के साथ भ्रूण त्यागें. यह आसान है केवी याद आती है और पास के ऊतक या अंतर्निहित जर्दी को मोती देने. असफल अगर, माउंट anoवहाँ 10 भ्रूण और इंजेक्शन प्रक्रिया को दोहराने.
5. विज़ुअलाइज़ेशन और केवी द्रव प्रवाह के विश्लेषण
- केवी अंदर मोतियों के साथ प्रत्येक चयनित भ्रूण बाँझ पानी की एक बूंद को जोड़ने के लिए agarose को कवर करने के लिए और फिर ईमानदार फ्लोरोसेंट यौगिक माइक्रोस्कोप का उपयोग कर एक 63X पानी की सूई उद्देश्य (1ï चित्रा) के तहत केवी का पालन. वैकल्पिक रूप से, एक coverslip गैर पानी की सूई के उद्देश्यों और / या उलटा माइक्रोस्कोप के साथ प्रयोग करने के लिए लागू किया जा सकता है.
- एक उच्च गति माइक्रोस्कोप पर घुड़सवार (जैसे Zeiss AxioCamHSm) एक 10 सेकंड फिल्म रिकॉर्ड कैमरे का उपयोग. दोनों फ्लोरोसेंट (लगभग 70 फ्रेम / सेक) चैनल और के.वी. लुमेन का उपयोग कर एक brightfield या अंतर हस्तक्षेप विपरीत (डीआईसी) चैनल का उपयोग मोती रिकार्ड.
- समय पर सभी मनका आंदोलनों कल्पना ImageJ (पर मुफ्त डाउनलोड सॉफ्टवेयर में फ्लोरोसेंट मोतियों की फिल्म आयात http://rsb.info.nih.gov/ij/ ) एकएन डी फिल्म में सभी फ्लोरोसेंट संकेत की एक अधिकतम प्रक्षेपण बनाने. ImageJ में अधिकतम प्रक्षेपण प्रदर्शन "ढेर → → Z परियोजना छवि.", क्लिक करें "Z परियोजना" विंडो में, "अधिकतम तीव्रता" के प्रक्षेपण प्रकार के साथ सभी स्लाइस परियोजना. इस छवि में जो मोती (आंकड़े 3A-B) imaged थे केवी की एक डीआईसी छवि पर आरोपित किया जा सकता है.
- व्यक्तिगत मोतियों की आंदोलनों ImageJ का उपयोग कर पता लगाया जा सकता है. एक प्लगइन ("मैनुअल ट्रैकिंग") पर डाउनलोड किया जा सकता है http://rsbweb.nih.gov/ij/plugins/track/track.html . ImageJ में फ्लोरोसेंट मोती फिल्म खोलें और मैनुअल ट्रैकिंग समारोह चलाते हैं. मैन्युअल ट्रैकिंग के विंडो में, "समय अंतराल" और "x / y अंशांकन" के लिए "शो पैरामीटर" और इनपुट पैरामीटर्स की जाँच करें. मैन्युअल रूप से मोती कि ≥ 50 फ्रेम के लिए फिल्म के फोकल हवाई जहाज़ में रहने का चयन करें और तब ≥ भ्रूण प्रति 5 मोती ट्रैक. पथ और प्रत्येक मनका के वेग वें द्वारा उत्पन्न होता हैई सॉफ्टवेयर (आंकड़े 3 सीडी).
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Representative Results
स्टेज विशिष्ट MO इंजेक्शन भ्रूण के विशेष डिब्बों में जीन समारोह का विश्लेषण के लिए एक उपयोगी दृष्टिकोण चित्रा 1 प्रदान करते हैं. इंजेक्शन डीएफसी / केवी कोशिकाओं में जीन समारोह का परीक्षण करने के लिए इस्तेमाल किया रणनीतियों फ्लोरोसेंट मोती को लागू करने के लिए तरल पदार्थ का प्रवाह कल्पना का प्रवाह चार्ट प्रस्तुत केवी में. सफल मंच विशिष्ट इंजेक्शन भ्रूण में फ्लोरोसेंट एमओ के वितरण schematically 1D एफ आंकड़े में और चित्रा 2 में रहते भ्रूण में दिखाया गया है एक असफल एमओ इंजेक्शन, जिसमें रहता एमओ की जर्दी सेल में एकत्रित, चित्रा 2 डी में दिखाया गया है.
भ्रूण को सफलतापूर्वक इंजेक्शन MO-तरल प्रवाह का विश्लेषण करने के लिए फ्लोरोसेंट microbeads केवी लुमेन (1G-एच आंकड़े) में वितरण के लिए 4-6 विखंड चरणों में रखा जा फ्लोरोसेंट के स्थानीयकरण पर आधारित है. Videomicroscopy के.वी. में मोती आंदोलनों (आंकड़े 1ï जम्मू), रिकॉर्ड करने के लिए प्रयोग किया जाता है जो गुणात्मक विश्लेषण किया जा सकता है (आंकड़े 3A-B) या मात्रात्मक ImageJ (आंकड़े 3C-E) सॉफ्टवेयर का उपयोग कर. सामान्य प्रवाह के साथ एक नियंत्रण भ्रूण में, मोती रास्तों कि समय पर एक फ्लोरोसेंट मनका पदों की अधिकतम प्रक्षेपण (चित्रा 3A) बनाने या समय (चित्रा 3C) पर व्यक्तिगत मोती ट्रैकिंग द्वारा देखे जा सकते हैं counterclockwise का पालन करें. समन्वित प्रवाह के नुकसान को प्रदर्शित करने के लिए, हम मो के साथ भ्रूण पछाड़ना रो kinase (Rock2b) 2b, जो हम पहले से पता चला है 18 प्रवाह बाधित इंजेक्शन. Rock2b MO इंजेक्शन भ्रूण में, मोती केवी (3B आंकड़े, डी) में बेतरतीब ढंग से चलते हैं. ImageJ सॉफ्टवेयर के लिए व्यक्तिगत मनका पटरियों के वेग की गणना करने के लिए इस्तेमाल किया गया था. नियंत्रण और Rock2b MO भ्रूण से 5 मोतियों की औसत वेग 3E चित्र में दिखाया गया है.
es.jpg "src =" / files/ftp_upload/50038/50038fig1.jpg / ">
चित्रा 1. केवी में मंच विशिष्ट MO इंजेक्शन और microbead इंजेक्शन के अवलोकन 1-सेल भ्रूण भर में मो के वैश्विक वितरण के लिए मंच पर जर्दी में (ए) फ्लोरोसेंट एमओ (लाल) इंजेक्शन. (बी) 512-सेल स्तर पर एमओ इंजेक्शन डीएफसी लक्षित DFC / केवी कोशिकाओं में एमओ लोड. (सी) 30 चरण% epiboly MO इंजेक्शन जर्दी लक्षित जर्दी मो को प्रतिबंधित. (लोमो ') (ई' एफ 'के बाद 75% epiboly मंच (डी, ई, एफ) और 6 विखंड D) मंच पर सफलतापूर्वक इंजेक्शन भ्रूण में फ्लोरोसेंट एमओ (लाल) के वितरण के योजनाबद्ध प्रतिनिधित्व' मंच विशिष्ट इंजेक्शन. एमओ सेल / डीएफसी केवी वंश में जम जाता है जब 512-सेल मंच (ई, ई में तीर ') इंजेक्शन, जब 30% पर epiboly इंजेक्शन (एफ में तीर, एफ नहीं है, लेकिन'). फ्लोरोसेंट microbeads (G) के.वी. लुमेन में (हरा) इंजेक्शन. (एच) एक सहाराभ्रूण केवी (तीर) microbead इंजेक्शन के लिए ऊपर का सामना करना पड़ रहा साथ erly घुड़सवार. के.वी. में इमेजिंग (आई) मोती आंदोलन एक ईमानदार माइक्रोस्कोप का उपयोग कर. (जे) एक अक्षुण्ण केवी microbeads इंजेक्शन के साथ लुमेन के उच्च बढ़ाई. भ्रूण चरणों और भ्रूण चित्र रेफरी के आधार पर कर रहे हैं. 28.
चित्रा 2. मंच विशिष्ट MO इंजेक्शन के बाद भ्रूण का चयन. 75% epiboly मंच (8 HPF) (एसी) चयनित भ्रूण के उदाहरण में जो फ्लोरोसेंट एमओ (लाल) या तो वैश्विक MO इंजेक्शन (ए) के बाद सभी भ्रूण कोशिकाओं, डीएफसी के बाद की जर्दी और DFCS (तीर) के माध्यम से विसरित में शामिल किया गया है लक्षित एमओ (B) या इंजेक्शन की जर्दी लक्षित MO इंजेक्शन (सी) के बाद की जर्दी में बने रहे. (डी) एक अपवर्जित भ्रूण जिसमें fluo के उदाहरणrescent MO इंजेक्शन स्थल पर एकत्रित. (जैसे) चरण 4 विखंड (11.5 HPF) फ्लोरोसेंट एमओ (लाल) चयनित भ्रूण में वितरण के उदाहरण हैं. डीआईसी छवियाँ ट्रांसजेनिक टीजी में केवी (तीर) लुमेन (Dusp6: d2EGFP) भ्रूण की पहचान है कि 27 केवी के कोशिकाओं में व्यक्त GFP. वैश्विक MO इंजेक्शन भ्रूण में, MO केवी और सभी कोशिकाओं के आसपास (ई) में मनाया गया. डीएफसी लक्षित MO इंजेक्शन भ्रूण में, एमओ सबसे केवी कोशिकाओं में GFP के साथ सह और स्थानीय भी अंतर्निहित जर्दी नाभिक (एफ) में मौजूद था. भ्रूण की जर्दी - लक्षित, MO जर्दी नाभिक (G) में विशेष रूप से पाया गया था.
चित्रा 3. के.वी. में द्रव का प्रवाह के गुणात्मक और मात्रात्मक विश्लेषण. (एबी) के प्रवाह के गुणात्मक विश्लेषण, सभी fluoresc के 10 सेकंड फिल्म दिखा आंदोलन की एक अधिकतम प्रक्षेपण के लिएकेवी में इंजेक्शन ent microbeads केवी लुमेन के एक वैश्विक नियंत्रण (A) एमओ या Rock2b एमओ (बी) इंजेक्शन भ्रूण में एक डीआईसी छवि पर आरोपित किया गया है. (सीई) व्यक्तिगत microbeads (n 5 =) एक नियंत्रण (सी) भ्रूण और Rock2b MO इंजेक्शन भ्रूण (डी) में लगाया गया था और एक औसत मनका वेग (ई) की गणना करने के लिए प्रयोग किया जाता के प्रवाह आंदोलन, यों. सर्किलों (सीडी) अनुमानित केवी लुमेन सीमाओं. त्रुटि सलाखों (ई) एक मानक विचलन का प्रतिनिधित्व करते हैं.
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Discussion
मंच विशिष्ट इंजेक्शन का उपयोग करने के लिए सेल / डीएफसी केवी वंश एमओ को लक्षित करने के लिए सेल जीन समारोह की स्वायत्तता का अध्ययन करने और pleiotropic phenotypes वैश्विक जीन पछाड़ना की वजह से से बचने के लिए एक उपयोगी दृष्टिकोण है. हालांकि, इन इंजेक्शनों तकनीकी रूप से चुनौतीपूर्ण हो सकता है. मो के 256-सेल और 1,000 सेल के चरणों के बीच इंजेक्शन तीन संभावित परिणामों में परिणाम कर सकते हैं: 1) एमओ इंजेक्शन साइट, 2 पर एकत्रित रहता है) की जर्दी भर MO diffuses और डीएफसी / केवी कोशिकाओं या) 3 MO में प्रवेश करती है जर्दी भर diffuses और डीएफसी / केवी कोशिकाओं और अन्य भ्रूण कोशिकाओं में प्रवेश करती है. इसलिए, भ्रूण जिसमें मो डीएफसी / केवी कोशिकाओं के लिए विशेष रूप से ले जाया गया है का चयन इस प्रयोग में एक महत्वपूर्ण कदम है. यह नोट करना महत्वपूर्ण है कि मो सभी / डीएफसी केवी कोशिकाओं में लोड कर सकते हैं, लेकिन अक्सर ही इन 10 कोशिकाओं के एक सबसेट में प्रवेश करती है. इस लक्ष्यीकरण मोज़ेक अंतर्निहित कारण अस्पष्ट रहते हैं, लेकिन कैसे कुशलतापूर्वक की जर्दी और या इंडस्ट्रीज़ के बंद होने के समय / के माध्यम से मो चालों में परिवर्तनशीलता को प्रतिबिंबित कर सकते हैंजर्दी और डीएफसी progenitors के बीच ividual पुलों. हम शर्तों को नहीं मिला है कि दक्षता में वृद्धि को लक्षित है, बल्कि भ्रूण जो में केवी कोशिकाओं के सबसे MO ले लिया है के चयन पर भरोसा. मो के साथ डीएफसी / केवी कोशिकाओं के बहुमत में भ्रूण पैदा करने के लिए सफलता की दर आमतौर पर 20-30% ~ है, लेकिन यह काफी दिन से दिन में चर हो सकता है. इस कारण से, हम संभव के रूप में कई भ्रूण (≥ 100) के रूप में इंजेक्शन लगाने की सलाह देते हैं, और फिर ध्यान से भ्रूण कि फ्लोरोसेंट morpholino के उचित वितरण का चयन.
नियंत्रण प्रयोगों DFC - लक्षित इंजेक्शन के परिणामों की व्याख्या करने के लिए महत्वपूर्ण हैं. एक बेमेल MO या मानक नकारात्मक नियंत्रण एमओ (जीन उपकरण से, LLC) लिए गैर विशिष्ट प्रभाव के लिए नियंत्रण करने के लिए इस्तेमाल किया जाना चाहिए. इसके अलावा, क्योंकि DFC - लक्षित इंजेक्शन दोनों जर्दी और डीएफसी केवी / सेल वंश (चित्रा 2 एफ) मो उद्धार, यह निर्धारित करने के लिए महत्वपूर्ण है कि इन भ्रूण में phenotypes जीन मज़ा के नुकसान के कारण कर रहे हैंction / डीएफसी केवी कोशिकाओं में या जर्दी सेल में. जर्दी - लक्षित भ्रूण (2 एफ जी आंकड़े) के साथ DFC - लक्षित भ्रूण में phenotypes तुलना / डीएफसी केवी सेल विशिष्ट को प्रभावित करता है की पहचान करेगा. बेशक, कुछ जीन दोनों डीएफसी / केवी कोशिकाओं और जर्दी 16 में कार्य कर सकते हैं. हालांकि हम MO-मध्यस्थता नुकसान का समारोह विश्लेषण के यहाँ ध्यान केंद्रित, DFC - लक्षित इंजेक्शन तकनीक और जुड़े नियंत्रण प्रयोगों सिंथेटिक mRNA इंजेक्शन डीएफसी / केवी में एक विशेष प्रोटीन overexpress एक लाभ का समारोह का आकलन करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है 17,22,24,29 वंश. इस दृष्टिकोण का एक चालाक adaption DFC - लक्षित mRNA इंजेक्शन डीएफसी केवी / 30 कोशिकाओं में ही वैश्विक MO पछाड़ना बचाव. हालांकि, यह ध्यान दिया जाना चाहिए कि DFCS और केवी कोशिकाओं, और महत्वपूर्ण नियंत्रण में इनकोडिंग प्रोटीन की अभिव्यक्ति में इस तरह के परिणाम में इंजेक्शन नहीं mRNAs सभी के लिए प्रोटीन अभिव्यक्ति और वितरण के स्तर का आकलन करने के लिए शामिल किया जाना चाहिए.
Microbead के सफल प्रसवकेवी लुमेन में असममित प्रवाह का आकलन इष्टतम चरणों में क्षणिक केवी अंग के तेजी से विकास के दौरान मोती इंजेक्शन लगाने पर निर्भर करता है. हम 4-6 विखंड चरणों (~ 12 HPF) पर बढ़ते भ्रूण शुरू करते हैं और फिर केवी में microbeads 10 विखंड चरण (14 HPF) इंजेक्षन. 4 विखंड चरण के लिए पहले, लुमेन अक्सर भी इंजेक्षन करने के लिए छोटे, और बाद के चरणों (> 10 somites) में इंजेक्शन की वजह से मुश्किल हो जाता है के.वी. भ्रूण में गहरी आगे बढ़. इस तकनीक की एक सीमा है कि केवी लुमेन एक आकार है कि सफलतापूर्वक microbeads साथ इंजेक्ट किया जा सकता है विस्तार करने की आवश्यकता है. मामलों में एक विशेष जीन के एमओ पछाड़ना गंभीर जहां बाधित केवी संगठन और / या केवी लुमेन आकार (रेफरी में की समीक्षा 31.) यह मुश्किल हो सकता है, अगर नहीं नामुमकिन परख इस दृष्टिकोण का उपयोग कर प्रवाह को कम कर देता है.
जब microbeads केवी में इंजेक्शन के लिए भ्रूण को तैयार है, यह महत्वपूर्ण है केवी ऊपर का सामना करना पड़ रहा (1h चित्रा भ्रूण अक्ष के साथ सीधे भ्रूण माउंट), भ्रूण की स्थिति के रूप में कोण है कि सुई केवी और के.वी. में मोतियों की इमेजिंग कोण में प्रवेश को प्रभावित कर सकते हैं. यह भी महत्वपूर्ण है के लिए एक छोटे बोर इंजेक्शन सुई और microbeads के छोटे इंजेक्शन की मात्रा का उपयोग के लिए हानिकारक केवी से बचने के लिए. हम एक चिकनी इंजेक्शन केवी में सुई डालने स्ट्रोक विकसित अभ्यास करने की सलाह देते हैं, मोती जारी है और फिर जल्दी से भ्रूण से सुई वापस लेना. जब स्थितियों इष्टतम कर रहे हैं, हम सफलतापूर्वक इंजेक्शन भ्रूण की 50% (जैसे n = 5/10) के लिए microbeads देने में सक्षम हैं.
सारांश में, मंच विशिष्ट MO इंजेक्शन और microbeads केवी में दृश्य एक LR रोमक कोशिकाओं में उम्मीदवार जीनों के समारोह का अध्ययन करने का अवसर प्रदान करते हैं.
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Disclosures
ब्याज की कोई संघर्ष की घोषणा की.
Acknowledgments
हम उत्कृष्ट प्रयोगशाला सहायता और zebrafish देखभाल के लिए Fiona Foley धन्यवाद. यह काम एक अहा गिनीकृमि predoctoral फेलोशिप (11PRE5730027) और (R01HL66292) HJY और प्राधिकरण (R01HL095690) NHLBI अनुदान समर्थित किया गया.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Standard Control oligo-Lissamine tagged | Gene Tools, LLC | ||
| Custom Rock2b morpholino oligo | Gene Tools, LLC | ||
| Fluoresbrite Multifluorescent 0.5 micron Microspheres | Polysciences, Inc. | 24054 |
References
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