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Biology

Kupffer의 소포의 유전자 기능 및 속눈썹 생성 된 유체 흐름의 시각화 분석

Published: March 31, 2013 doi: 10.3791/50038

Summary

Kupffer의 소포에 솜털 생성 된 유체 흐름 (KV)는 zebrafish 배아의 왼쪽, 오른쪽 패턴을 제어합니다. 여기, 우리는 KV 세포에 특별히 유전자 기능을 조절하는 기술을 설명합니다. 또한, 우리는 유체 흐름을 시각화하는 KV에 형광 구슬을 전달하는 방법을 보여줍니다.

Abstract

같은 심장, 뇌, 그리고 내장 등의 내부 기관은 정상적인 기능 1 중요한 왼쪽, 오른쪽 (LR) asymmetries을 개발할 수 있습니다. 운동성 섬모가 부족해은 마우스, 개구리, 그리고 zebrafish 2-6 포함한 척추 동물의 배아에 LR을 비대칭 수립에 참여하고 있습니다. 이러한 'LR의 속눈썹은'장기에게 7 개발을위한 LR의 패턴 정보를 제공하는 것으로 생각되어 왼쪽 측면 판 중배엽에서 층계를 신호 보존 비대칭 결절을 (TGF-β superfamily), 실행하는 데 필요한 비대칭 유체 흐름을 생성합니다. 따라서, LR의 패턴의 근간이 메커니즘을 이해하기 위해, 그것은 LR 솜털이있는 세포의 조직, LR의 속눈썹하고 강력한 비대칭 흐름을 생성하는 능력의 운동성 및 길이를 조절 유전자를 식별하는 것이 중요합니다.

zebrafish 배아에서 LR의 속눈썹은 2,4,5 Kupffer의 소포 (KV)에 위치하고 있습니다. KV는 monociliated 상피 세포의 단일 층으로 구성되어 있습니다유체 - 채워진 내강을 둘러싸 그. 운명 매핑은 KV이 epiboly 단계 8,9 동안 등쪽 배반 엽 여백에 이전 등쪽 전신 세포 (DFCs)로 알려진 ~ 20-30 셀의 그룹에서 파생되는 것으로 나타났습니다. 초기 체절 단계 동안, DFCs 클러스터와 솜털이있는 상피 세포로 분화가 배아 10,11의 tailbud에 KV를 형성합니다. 식별하고 추적 할 수있는 능력을 DFCs을의 조합 광학 투명성과 zebrafish KV LR 솜털이있는 세포를 연구 할 수있는 훌륭한 모델 시스템 배아하게되면 zebrafish의 신속한 개발.

흥미롭게도, DFC / KV 세포 계보 (Lineage)의 progenitors은 4 시간 후 수정을 (hpf)에 난황 세포 사이에 세포질 다리를 유지, 2 hpf 8 후 가까운 난황 세포와 다른 배아 세포 사이에 세포질 다리 반면. 이 세포질 다리 활용, 우리는 morpholino oligonucle를 제공​​ 할 수있는 단계 별 분사 전략을 개발DFCs 및 최저 이러한 세포 12 대상 유전자의 기능에 대한 독점적 otides (MO). 이 기술은 유전자 기능이 야생 형 배아의 맥락에서 개발 DFC / KV 혈통에 쓰러되는 키메라 배아를 생성합니다. KV에서 비대칭 유체 흐름을 분석하기 위해, 우리는 KV 루멘과 videomicroscopy 2를 사용 기록 비즈 운동으로 형광 microbeads를 삽입. 유체 흐름은 쉽게 시각화하고 시간이 지남에 따라 구슬 변위를 추적하여 정량화 할 수 있습니다.

여기 단계 별 DFC 타겟 유전자 최저 기법과 흐름을 시각화 할 수 KV에 형광 microbeads의 주입을 사용하여, 우리는 KV 개발 및 기능 중에 특정 유전자의 역할을 특성화 할 수있는 효과적인 방법을 제공하는 프로토콜을 제시한다.

Protocol

스테이지 별 Zebrafish의 배아 주사의 개요

대상 mRNA에 바인딩하고 증명서의 단백질 표현을 방해 안티센스 morpholino의 oligonucleotides (MO)는, 널리 연구 zebrafish 13,14에서 (손실) 함수 유전자 최저에 사용됩니다. 유전자 도구, LLC는 형광 현미경을 사용하여 주입 배아에 MO를 감지 할 수 carboxyfluorescein (녹색 형광을 방출) 또는 lissamine (적색 형광을 방출) 또는 태그가 수법의 살인을 제공합니다. zebrafish 개발의 여러 단계에서 난황 세포에 MO를 주입함으로써, 배아의 특정 구획 (그림 1A-F)에 MO를 제공 할 수 있습니다. MO는 1-4 세포 단계 (0-1 hpf) 32 셀 단계 15 세계 최저를 촉진하기까지 계속 노른자와 연결을 통해 모든 배아 세포를 (그림 1A, D, D ') 입력 사이의 난황에 주입. MO는 midblast 동안 노른자에 주입울라 단계 (2.5-3 hpf)는 특별히 DFC / KV 세포 계보 (Lineage) 12의 다른 대부분의 배아 세포 lineages를 입력하지 않고 세포질 다리 8 최저 유전자 기능을 통해 가능성이 DFCs (인물 1B, E, E ')의 progenitors을 입력 할 수 있습니다 . 유전자 기능이 DFC / KV 나 또한 난황 12,16 할 필요가 있는지 여부를 테스트하는 중요한 관리로서 한 후 돔 - 30 % epiboly 단계 (~ 4.5 hpf) 사이에 주입하여 난황 세포에 MO를 제한하는 것도 가능합니다 모든 세포질 다리 (그림 1C, F, F ') 마감했습니다. 이 주사는 DFC / KV 세포 17-24에서 유전자 기능을 분석하기 위해 함께 사용되었습니다. KV의 유체 유동을 평가하기 위해, 형광등 microbeads은 6-10 체절 단계 (12-14 hpf) 후 즉시 videomicroscopy을 (도 1G-J)를 사용하여 이미징. 사이의 KV 내강에 주입 아르 Microbeads 빨간색 또는 녹색 형광 (또는 둘 다)를 방출이 가능합니다, 그래서 다른을 사용할 수 있습니다이미지 형광 microbeads와 MO에 채널.

1. Morpholinos의 스테이지 별 사출 (MO)

zebrafish의 배아에 MO의 주입은 이전에 25,26 입증되었습니다. 여기 우리가 곧 무대 특정 MO 주사에 대해 설명합니다. 모든 주사 후, 배아는 배양 접시에 전송하고 28.5에서 incubated ° C.

  1. 글로벌 MO 주입 : 즉시 수정을 한 후 배아를 수집하고 주입 판으로로드합니다. 모세관 바늘에 형광 MO를로드하고 (예를 들면 하버드 장치 PLI-90 피코 주사기) microinjector에 바늘을 탑재합니다. 바늘 팁을 깨고 25,26 설명 제 1 NL의 볼륨이 분사 드롭을 만드는 사출 설정 (압력 및 / 또는 시간) 조정합니다. 해부 stereomicroscope를 사용하여 (그림 1A) 난황에 MO의 1 NL를 삽입 실험 당 ≥ 50 배아의. 4 셀 사슴으로 주사를 완료하는 데 신속하게 작업5.
  2. DFC 타겟팅 MO 분사 : 28.5에서 바로 수정을 한 후 배아를 수집하여 배양 ° C. 배아는 256 세포 단계 (~ 2.5 hpf)에 도달했을 때, 빠르게 분사 판으로를로드 한 다음 (그림 256 전지 및 1,000 세포 단계 사이 ≥ 100 배아의 난황에 형광 MO의 1 NL를 삽입 1B).
  3. 난황 타겟팅 MO 분사 : 28.5에서 바로 수정을하고 배양 한 후 배아를 수집 ° C. 돔 단계 (~ 4 hpf)에서 분사 판으로 배아를로드 한 후 돔과 30 % epiboly 단계 (그림 1C) 사이 ≥ 100 배아의 난황에 형광 MO의 1 NL를 삽입.

2. 분석을위한 양념을 넣은 태아를 선택

  1. MO는 배아는 (8 hpf) 75%-epiboly 단계에 도달 주입하면 형광 MO의 배포 용 형광 해부 현미경 unfertilized와 죽은 태아를 제거하고 화면 생활 배아. 그런 다음여w는 배아는 28.5에서 개발 선택한 ° C.
    1. 글로벌 MO 주사를 들어, 골고루 모든 배아 세포 (; 그림 2A 그림 1D)를 통해에 형광 배포 한 배아를 선택합니다.
    2. DFC 타겟팅 MO 주사를 들어, 형광 MO는 난황에 걸쳐 확산하고 등쪽의 배반 엽 마진 (DFCs) (, 그림 2B 그림 1E)에 집중 표시되는 배아를 선택합니다. 이 단계에서는 기본 난황에서 밝은 형광에 의한 형광 DFCs을 시각화하기 어려울 수 있습니다. 형광 MO는 DFCs 이외의 배아 세포에 통합하거나 남아있는 분사 사이트 (그림 2D)에서 집계 한있는 배아를 제외 조심해.
    3. 난황 타겟팅 MO 주사를 들어, MO 형광이 고르게 난황 전체에 분산하고 배아 세포 (; 그림 2C 그림 1 층)에서 관찰되지 않은 배아를 선택합니다. 다시 말하지만, 형광 MO가 남아있는 배아를 제거사출 사이트에서 집계됩니다.
  2. 2-4-체절 ​​단계 (~ 11 hpf) 사이, 화면이 배아 높은 배율을 사용하여 형광 현미경으로 두 번째 시간입니다. 그런 다음 선택한 배아는 28.5에서 개발 할 수 있습니다 ° C.
    1. 글로벌 MO 주사를 들어, 선택된 배아는 MO 형광가 균등하게 KV 모든 배아 세포 (; 그림 2E 그림 1D ')에 배포되어 있는지 확인합니다.
    2. DFC 타겟팅 MO 주사를 들어, 신중하게 MO의 만 KV 세포에서 형광과 난황 (그림 1E '을)이 배아를 선택합니다. 27 MO가 성공적으로 KV 세포 (그림 2F)로 전달되었습니다 된 배아의 식별에 도움이 수 있습니다 : 예 TG와 같은 KV 세포에 명시 GFP는 (d2EGFP Dusp6)는 유전자 변형 배아. KV 셀 다른 배아 세포에서 MO 형광이있는 배아를 폐기하십시오.
    3. 난황 타겟팅 MO 주사를 들어, 난황 (그림 1 층 '에 독점적으로 MO의 형광이 배아를 선택합니다 : 그림2G).

3. KV에서 유체 흐름을 분석 할 마운트 태아

  1. 글로벌 MO의 KV에 비대칭 유체 흐름을 분석하기 위해, MO 또는 난황 타겟팅 MO 주입 배아를 DFC는 타겟팅 신중하게 dechorionate ~ 날카로운 집게와 4-6 체절 단계 (~ 11-12 hpf) 사이 20 배아.
  2. 42의 건조한 목욕탕에서 액체로 유지되어야하는 5 ML 튜브 ° C.에 1% 낮은 녹는 점 아가로 오스와 나누어지는 50 ML 준비
  3. 유리 우울증 슬라이드 (미국 과학 용품, 주식회사) 하나의 배아를 전송하고 가능한 한 물을 많이를 제거합니다. 단지 (너무 많은 아가로 오스는 이후 영상을 방해 할 수 있습니다) 배아를 커버하기에 충분한 따뜻한 1% 낮은 녹는 점 아가로 오스를 추가하여 배아를 고정. 아가로 오스는 굳은으로, 이러한 배아를 위치 시키도록 포셉을 사용하는 KV는 (그림 1H) (등쪽보기)를 향하고 있습니다.에게 슬라이드 당 하나의 배아로 10 배아를 탑재합니다. 다음 단계의 모든 주사는 compl을 보장하기 위해 신속하게 작업10 체절 단계 (14 hpf)에 의해 eted.

4. KV에 형광 Microbeads의 주입

  1. 1.5 ML Eppendorf 튜브에 멸균 물에 1시 50분에 Multifuorescent 0.5 미크론 직경 마이크로을 (Polysciences 주식회사) Fluoresbrite 희석.
  2. 튜브를 클릭하여 철저하게 microbeads의 1시 50분 희석을 섞어서 모세관 바늘로 3 μl를로드합니다. MO 주사 (예를 들면 하버드 장치 PLI-90 피코 주사기)에 사용 된 것과 같은 microinjector를 사용하여 집게로 바늘 끝을 해제하고 가장 작은 가능한 (<0.5 NL) 주입 드롭을 생성하기 위해 분사 설정을 조정합니다.
  3. 해부 현미경의 첫 번째 장착 된 배아의 KV의 루멘으로 바늘을 맞 춥니 다. 루멘에 바늘을 넣고 구슬의 작은 볼륨 (<0.5 NL) (그림 1G)를 주입. 작은 바늘 끝과 작은 사출 볼륨이 손상 KV를 방지하는 것이 중요합니다.
  4. 모든 마운트 된 배아를 삽입. 난자는 injecte되면D, 멸균 물 한 방울은 이미 건조하지 않도록 아가로 오스의 상단에 추가 할 수 있습니다. 주사의 과정 동안, 구슬은 종종 바늘 구멍을 방해합니다. 이 바늘 끝을 다시 깨고 microinjection 장치의 변조 압력 또는 시간 설정에 의해 주입 볼륨을 조정해야합니다. 이 분사 동안 상당한 손상을 일으킬 정도로 무딘 될 경우 바늘을 교체합니다.
  5. 화면 수직 형광 복합 현미경 (예 : Zeiss AxioImager M1)에 따라 구슬을 성공적으로 배달 주입 배아는 20X 목표를 사용합니다. 첫째, KV 구조가 brightfield 조명을 (그림 1J)를 사용하여 손상 여부를 확인한 다음 구슬을 관찰하는 형광 사용합니다. 구슬이 존재하고 KV의 내강 내에 이사하는 배아를 선택합니다. KV 손상 또는 KV에없이 떠있는 구슬이있는 배아를 폐기하십시오. 이 KV를 놓치지 인근 조직 또는 기본 노른자에 구슬을 제공하는 간단합니다. 마운트 ano, 실패하는 경우10 배아를 군터 및 분사 절차를 반복하십시오.

5. KV의 유체 흐름의 가시화 및 분석

  1. KV 내부 구슬로 선택한 각 배아를 들어, 아가로 오스를 커버 한 다음 63X 물을 찍어 목적 (그림 1I)를 사용하여 수직 형광 화합물 현미경 KV를 관찰하기 위해 멸균 물 한 방울을 추가합니다. 또는 coverslip가 아닌 물을 찍어 목표 및 / 또는 거꾸로 현미경에 사용하기 위해 적용 할 수 있습니다.
  2. 10 초 동영상을 녹화 할 수 (예 : Zeiss AxioCamHSm) 현미경에 장착 고속 카메라를 사용합니다. brightfield 또는 차등 간섭 대비 (DIC) 채널을 사용하여 형광 채널 (약 70 프레임 / 초)와 KV의 루멘을 사용하여 구슬을 모두 기록합니다.
  3. 시간이 지남에 따라 모든 구슬 움직임을 시각화하려면, ImageJ 소프트웨어 (에서 무료로 다운로드에 형광 구슬의 동영상을 가져 http://rsb.info.nih.gov/ij/ )ND는 영화의 모든 형광 신호의 최대 투영을 만듭니다. ImageJ에서 최대 투영을 수행하려면 다음 "이미지 → 스택 → Z 프로젝트를." "Z 프로젝트"창에서 "최대 강도"의 프로젝션 유형으로 모든 조각 프로젝트. 이 이미지는 구슬이 (그림 3A-B) 이미지로 된의 KV의 DIC 이미지를 겹쳐 할 수 있습니다.
  4. 개인 구슬의 움직임이 ImageJ를 사용하여 추적 할 수 있습니다. 플러그인 ( "수동 추적")에서 다운로드 할 수 있습니다 http://rsbweb.nih.gov/ij/plugins/track/track.html . ImageJ에서 형광 구슬 동영상을 열고 수동 추적 기능을 실행합니다. 수동 추적 창에서 "시간 간격"과 "X / Y 보정"에 대한 "표시 매개 변수"및 입력 매개 변수를 확인합니다. 수동 ≥ 50 프레임 동영상의 초점 평면에 남아있는 구슬을 선택한 다음 배아 당 ≥ 5 구슬을 추적 할 수 있습니다. 각 구슬의 경로와 속도는 일에 의해 생성되는전자 소프트웨어 (도 3 CD).

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Representative Results

스테이지 별 MO 주사는 배아의 특정 구획에서 유전자 기능을 분석 할 수있는 유용한 방법을 제공합니다. 그림 1은 유체 흐름을 시각화하는 형광 구슬을 소개하는 DFC / KV 세포와 방법에 유전자 기능을 테스트하는 데 사용되는 분사 전략의 흐름 차트를 제공 KV 인치 성공적인 단계 별 주입 배아의 형광 MO의 배포는 그림 1D-F과 그림 2에서 라이브 배아에서 개략적으로 표시됩니다. 실패 MO 분사는, 난황 셀에 집계 된 MO 남아가 그림 2D에 표시되는 인치

성공적으로 주입 배아 - 선택 형광의 지역화 MO는 - 수 유체 흐름을 분석 할 수있는 KV 루멘 (그림 1G-H)로 형광 microbeads의 제공을위한 4-6 체절 단계에서 설치할 수에 따라. Videomicroscopy는 KV의 구슬 움직임을 (그림 1I-J), 기록하는 데 사용되는 질적 분석 (그림 3A-B) 또는 양적 (그림 3C-E) ImageJ 소프트웨어를 사용하실 수 있습니다. 정상적인 흐름 제어 배아에서 구슬은 시간이 지남에 따라 형광 구슬 위치의 최대 돌출부 (그림 3A)를 제작하거나 시간 (그림 3C)를 통해 개별 비즈를 추적하여 시각화 할 수 있습니다 경로를 반 시계 방향하십시오. 조율 흐름의 손실을 보여줍니다하기 위해, 우리는 우리가 이전에 흐름이 18 방해가 게재 최저로 (Rho) 키나아제 2B (Rock2b)에 MO와 배아를 주입했다. Rock2b MO 주입 배아에서 구슬 KV (그림 3B, D)에 무작위로 이동합니다. ImageJ 소프트웨어는 각각의 구슬 트랙의 속도를 계산하는 데 사용되었다. 제어 및 Rock2b MO의 배아에서 5 구슬의 평균 속도는 그림 3E에 표시됩니다.

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1 그림. KV로 단계 별 MO 주사와 microbead 주입의 개요. 배아를 통해 MO의 글로벌 배포를위한 1-세포 단계에서 난황에 형광 MO (빨간색)의 (A) 사출. (B) DFC / KV 셀에 MO를로드 512 세포 단계에서 MO 주입을 DFC 타겟팅. (C) 노른자에 MO를 제한 30 % - epiboly 단계에서 MO 분사를 난황 타겟팅. '(, E', F '다음 (DF) 75% epiboly 단계 (D, E, F)와 6 체절 단계 D)에서 성공적으로 주입 배아의 형광 MO (빨간색)의 분포의 개략도'무대 특정 주사. '(F에서 화살표, F) epiboly 30 % 주입하지 않을 때, 그러나 512 세포 단계 (E, E의 화살표)'에 주입했을 때 MO는 DFC / KV 세포 계보 (Lineage)에 축적. KV의 내강에 형광 microbeads의 (G) 사출 (녹색). (H) A 소품KV (화살표)가 microbead 주입에 직면하고있는 erly 장착 배아. KV에서 (I) 이미징 비즈 운동 직립 현미경을 사용합니다. microbeads를 주입 그대로 KV의 루멘의 (J) 높은 배율. 배아 단계와 배아 그림은 심판을 기반으로합니다. 28.

그림 2
그림 2. 단계 별 MO 주사에 따라 배아의 선택. 형광 MO (빨간색)이 중 DFC에 따라 난황과 DFCs (화살표)를 통해 확산 글로벌 MO 분사 (A)에 따라 모든 배아 세포에 통합되었습니다있는 75% epiboly 단계 (8 hpf)에서 선택한 배아의 (AC) 예 타겟 MO 분사 (B) 또는 난황 타겟 MO 분사 (C)에 따라 난황에 남아. 의 fluo 제외 배의 (D) 예rescent MO은 주입 사이트에서 집계됩니다. 4 체절 단계 (11.5 hpf)에서 선택 배아의 형광 MO (빨간색) 배포 (EG) 예. DIC 이미지는 유전자 변형 TG에서 KV 루멘 (화살표) (Dusp6 : d2EGFP)를 식별 배아를 그 KV 세포 27 특급 GFP. 글로벌 MO 주입 배아에서, MO는 KV와 모든 주변 세포 (E)에서 관찰되었다. DFC 타겟팅 MO 주입 배아에서, MO는 대부분의 KV 세포에 GFP와 함께 공동 번역 있으며, 난황의 핵 (F)를 하부에 존재했다. 난황 타겟 배아에서, MO는 난황의 핵 (G)에 독점적으로 발견되었다.

그림 3
그림 3. KV에서 유체 유동의 정성 및 정량 분석합니다. (AB) 흐름의 질적 분석, 모든 fluoresc의 10 초 영화 상영 운동의 최대 투영의 경우KV에 주입 싶어 질 microbeads은 글로벌 제어 MO (A) 또는 Rock2b MO (B) 주입 배아의 KV 루멘의 DIC 이미지를 겹쳐되었습니다. (CE) (N = 5)이 제어 배아 (C)와 Rock2b MO 주입 배아 (D)에서 추적과 평균 비드 속도 (E)를 계산하는 데 사용 된 각각의 microbeads의 흐름, 운동을 수량화합니다. 원 (CD) 대략 KV 루멘 경계. 오류 바 (E)는 하나의 표준 편차를 나타냅니다.

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Discussion

DFC / KV 세포 계보 (Lineage)에 MO를 타겟팅 할 단계 별 주사를 사용하여 유전자 기능의 휴대 자율성을 연구하고 글로벌 유전자 최저로 인한 pleiotropic phenotypes을 방지 할 수있는 유용한 방법이다. 그러나, 이러한 주사는 기술적 도전이 될 수 있습니다. 256 전지 및 1,000 세포 단계 사이 MO의 주입이 세 가지 결과가 발생할 수 있습니다 : 1) MO는 난황에 걸쳐 MO의 diffuses)는 주사 사이트 2 집계 유지하고 DFC / KV 셀 또는 3) MO를 입력 난황에 걸쳐 diffuses 및 DFC / KV 세포와 다른 배아 세포를 입력합니다. 따라서, MO는 DFC / KV 셀에 독점적으로 이동되었습니다 된 배아를 선택하면이 실험에서 핵심 단계입니다. 그것은 MO 모든 DFC / KV 셀에로드 할 수 있습니다하는 것이 중요하지만 종종 이러한 세포 (10)의 하위 집합 만 들어갑니다. 대상이 모자이크를 근간 이유는 불분명 남아 있지만, 난황 및 / 또는 산업의 폐쇄의 타이밍을 통해 얼마나 효율적으로 MO 이동의 변화가 반영 될 수 있습니다난황 및 DFC의 progenitors 사이 ividual 다리. 우리는 조건을 찾지 못한 그 증가 효율성을 타겟 아니라 KV 세포의 대부분은 MO를 데리고있는 배아를 선택에 의존하고 있습니다. DFC / KV 세포의 대부분에 MO와 배아를 생성 성공률은 일반적으로 20~30%을 ~되어 있지만,이 날마다 매우 변수가 될 수 있습니다. 이러한 이유로, 우리는 가능한 한 많은 배아 (≥ 100)로 주입하는 것이 좋습니다 후 조심스럽게 형광 morpholino의 적절한 분포를 가지고있는 배아를 선택합니다.

제어 실험 DFC 타겟 주사의 결과를 해석하는데 매우 중요합니다. 불일치 MO 또는 표준 대조군 MO는 (유전자 도구에서, LLC)가 아닌 특정 효과를 제어 할 수 있어야합니다. DFC 타겟 주사는 난황 및 DFC / KV 세포 계보 (Lineage) (그림 2F) 모두 MO를 제공 이후뿐만 아니라,, 이러한 배아의 phenotypes이 유전자 재미 손실로 인해 여부를 결정하는 것이 중요합니다DFC / KV 셀이나 난황 세포의 ction. 난황 타겟 배아 (그림 2 층-G)와 DFC 타겟 배아의 phenotypes을 비교하면 DFC / KV 세포에 특정한 영향을 미치는를 식별합니다. 물론, 일부 유전자는 DFC / KV 세포와 노른자 16 모두에서 작동 할 수 있습니다. 우리가 MO로 인한 손실 기능 분석의 초점을하지만, DFC 타겟 주입 기술과 관련된 제어 실험 DFC / KV에서 특정 단백질을 overexpress하는 합성 mRNA를 주입하여 이득의 기능을 평가하는 데 사용할 수 있습니다 혈통 17,22,24,29. 이 방법 중 하나 현명하게 적응은 사용 DFC 타겟팅 만 DFC / KV 셀 30 글로벌 MO의 최저를 구출하기 위해 mRNA 주사합니다. 그러나, DFCs와 KV 세포와 중요한 컨트롤의 인코딩 단백질의 표현에서 이러한 방식으로 결과에 주입 모든 mRNAs는 단백질 표현 및 유통의 수준을 평가하기 위해 포함되어야한다는 것을 주목해야한다.

microbead을 성공적으로 전달비대칭 흐름을 평가하는 KV 루멘에 s은 (는) 과도 KV 기관의 급속한 발전하는 동안 최적의 단계에서 구슬을 주입에 따라 달라집니다. 우리는 4-6 체절 단계 (~ 12 hpf)에 장착 배아를 시작하고 10 체절 단계 (14 hpf)까지 KV에 microbeads를 삽입. 전에 4 체절 단계에, 루멘은 종종 주입 너무 작아이며, 이후 단계 (> 10 somites)에 주입으로 인해 KV은 배아에 깊은 이동하기가 어렵됩니다. 이 기법 중 하나 한계는 KV의 내강이 성공적으로 microbeads를 주입 할 수있는 크기로 확장하는 데 필요한 것입니다. 경우있는 특정 유전자의 MO 최저는 심각하게 KV 조직 및 / 방해 또는 KV 루멘 크기 (심판에서 검토. 31)는이 방법을 사용하여 분석 흐름에 이르기까지 불가능하지 않을 경우 어려울 것을 줄일 수 있습니다.

KV에 microbeads의 주입을 위해 배아를 준비 할 때, 직선 KV는 (그림 상반기까지 직면하고있는 배아 축을 따라 배아를 장착하는 것이 중요합니다), 태아의 위치로 바늘이 KV와 KV의 영상 구슬의 각도를 입력하는 각도에 영향을 줄 수 있습니다. 피해 KV를 피하기 위해 작은 구멍 주입 바늘과 microbeads의 작은 사출 볼륨을 사용하는 것도 중요합니다. 우리는 KV에 바늘을 삽입 할 수있는 부드러운 사출 스트로크를 개발하기 위해 연습하는 것이 좋습니다, 구슬을 해제하고 빠르게 배아에서 바늘을 철회. 조건이 최적의 때, 우리는 성공적으로 주입 배아의 ~ 50 % (예를 들어 N = 5 / 10)에 microbeads를 제공 할 수 있습니다.

요약하면, 스테이지 별 MO 주사와 KV의 microbeads의 시각화 LR 솜털이있는 셀의 후보 유전자의 기능을 연구 할 수있는 기회를 제공합니다.

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Disclosures

관심 없음 충돌이 선언 없습니다.

Acknowledgments

우리는 우수한 연구소 지원과 zebrafish 관리에 대한 피오나 폴리 감사드립니다. 이 작품은 GW에 AHA predoctoral 휄로 십 (11PRE5730027)와 HJY (R01HL66292)과 JDA (R01HL095690)에 NHLBI 보조금을 지원했다.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Standard Control oligo-Lissamine tagged Gene Tools, LLC
Custom Rock2b morpholino oligo Gene Tools, LLC
Fluoresbrite Multifluorescent 0.5 micron Microspheres Polysciences, Inc. 24054

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

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Kupffer의 소포의 유전자 기능 및 속눈썹 생성 된 유체 흐름의 시각화 분석
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Wang, G., Yost, H. J., Amack, J. D.More

Wang, G., Yost, H. J., Amack, J. D. Analysis of Gene Function and Visualization of Cilia-Generated Fluid Flow in Kupffer's Vesicle. J. Vis. Exp. (73), e50038, doi:10.3791/50038 (2013).

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