Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Biology

Analys av geners funktion och Visualisering av Cilia-genererade vätskeflöde i Kupffer s vesikel

Published: March 31, 2013 doi: 10.3791/50038

Summary

Cilia genererade vätskeflöde i Kupffer s vesikel (KV) styr vänster-höger mönstring av zebrafisk embryot. Här beskriver vi en teknik för att modulera genfunktion specifikt i KV celler. Dessutom visar vi hur man levererar fluorescerande pärlor i KV att visualisera vätskeflöde.

Abstract

Inre organ som hjärta, hjärna och tarm utvecklar vänster-höger (LR) asymmetrier som är kritiska för deras normala funktioner 1. Rörliga flimmerhår är involverade i upprättandet LR asymmetri i ryggradsdjur embryon, inklusive mus, groda, och zebrafisk 2-6. Dessa "LR cilier 'generera asymmetrisk fluidflöde som är nödvändig för att utlösa en konserverad asymmetrisk Nodal (TGF-β superfamiljen) signaleringskaskad i den vänstra sidoplattan mesoderm, vilket är tänkt att ge LR mönstring information för att utveckla organ 7. Således, för att förstå mekanismerna bakom LR mönstring, är det viktigt att identifiera gener som reglerar organisationen av LR cilierade celler, motilitet och längd LR cilier och deras förmåga att generera robusta asymmetriska flödet.

I zebrafisk embryo är LR cilier ligger i Kupffer s vesikler (KV) 2,4,5. KV består av ett enda skikt av monociliated epitelcellersom innesluter en vätskefyllda hålrum. Ödet kartläggning har visat att KV är härledd från en grupp av ~ 20-30 celler kända som dorsala föregångaren celler (DFCS) som migrerar vid den dorsala BLASTODERM marginalen under epiboly stegen 8,9. Under tidiga somit stadier, till DFCS kluster och differentierar till cilierade epitelceller bilda KV i tailbud av embryot 10,11. Förmågan att identifiera och spåra DFCS-i kombination med optisk transparens och snabb utveckling av zebrafisk embryo-make zebrafisk KV en utmärkt modell för att studera LR cilierade celler.

Intressant stamfäder DFC / KV cellhärstamning behåller cytoplasmiska broar mellan äggula cellen upp till 4 timmar efter befruktning (HPF), medan cytoplasmiska broar mellan äggulan cellen och andra embryonala celler nära efter 2 HPF 8. Med utnyttjande av dessa cytoplasmiska broar, utvecklade vi en scen-specifik injektion strategi att leverera morfolino oligonucleotides (MO) uteslutande DFCS och knockdown funktionen av en riktad gen i dessa celler 12. Denna teknik skapar chimära embryon som genfunktion slås ned i DFC / KV härstamning utvecklas inom ramen för en vildtyp embryo. För att analysera asymmetrisk vätskeflöde i KV, injicera vi fluorescerande mikropärlor till KV lumen och spela pärla rörelse med videomicroscopy 2. Fluidflöde är lätt visualiseras och kan kvantifieras genom att spåra vulst förskjutning över tiden.

Här, med hjälp av steg-specifika DFC-riktad teknik gen ÖVERVÄLDIGANDE och injektion av fluorescerande mikropärlor i KV att visualisera flödet presenterar vi ett protokoll som ger en effektiv metod för att karakterisera den roll en speciell gen under KV utveckling och funktion.

Protocol

Översikt av etapp-specifika injektioner zebrafisk Embryo

Antisens morfolino oligonukleotider (MO), som binder till en riktad mRNA och störa proteinexpression från transkript, används allmänt i gen ÖVERVÄLDIGANDE (förlust av funktion) i zebrafisk 13,14 studier. Gene Verktyg, erbjuder LLC MOS som är märkta med antingen karboxifluorescein (emitterar grön fluorescens) eller lissamin (avger röd fluorescens) för att detektera MO injicerade embryon med fluorescensmikroskopi. Genom att injicera MO i äggula cellen vid olika stadier av utveckling zebrafisk, är det möjligt att leverera MO till specifika avdelningar av embryot (Figurerna 1A-F). MO injiceras i äggulan mellan de 1-4 cell stegen (0-1 HPF) in alla embryonala celler (Figurerna 1A, D, D ') via anslutningar med äggula som kvarstår tills den 32-cellstadiet 15 för att underlätta den globala knockdown. MO injiceras i gulan under midblastULA steg (2,5-3 HPF) kan ange stamfäder för DFCS (figurerna 1B, E, E ') sannolikt genom cytoplasmiska bryggor 8 och ÖVERVÄLDIGANDE genfunktion specifikt i DFC / KV cellhärstamning 12, utan att ange de flesta andra embryonala cellinjer . Som en viktig kontroll för att testa huruvida genfunktion krävs i DFC / KV eller även i äggula 12,16, är det också möjligt att begränsa MO till äggulan cellen genom injicering mellan kupol-30% epiboly steg (~ 4,5 HPF) efter alla cytoplasmiska broar har stängt (figur 1C, F, F '). Dessa injektioner har använts i kombination för att analysera genfunktion i DFC / KV celler 17-24. För att bedöma fluidflöde i KV, är fluorescerande mikropärlor injiceras KV lumen mellan de 6-10 somit stegen (12-14 HPF) och därefter omedelbart avbildas med videomicroscopy (figurerna 1G-J). Mikropärlor finns tillgängliga som avger rött eller grönt fluorescens (eller båda), så det är möjligt att använda olikakanaler till bild fluorescerande mikropärlor och MO.

1. Steg-specifik Injektion av Morpholinos (MO)

Injektion av MO i zebrafisk embryon har visats tidigare 25,26. Här beskriver vi kortfattat steg-specifika MO injektioner. Efter alla injektioner är embryon överfördes till en petriskål och inkuberades vid 28,5 ° C.

  1. Global MO injektion: Samla embryon omedelbart efter befruktningen och ladda in dem i en injektion platta. Fyll fluorescerande MO i en kapillär nål och montera nålen på en microinjector (t.ex. Harvard Apparatus PLI-90 Pico-injektor). Bryt nålspetsen och justera injektion inställningar (tryck och / eller tid) för att skapa en injektion droppe som har en volym på 1 nl som beskrivs 25,26. Med hjälp av en dissekera stereomikroskop, injicera 1 nl i MO i äggulan (Figur 1A) av ≥ 50 embryon per försök. Arbeta snabbt för att fullborda injektioner av 4-cells stage.
  2. DFC-riktade MO injektion: Samla embryon omedelbart efter befruktningen och inkubera vid 28,5 ° C. När embryona har nått 256-cell-stadiet (~ 2,5 HPF), snabbt ladda in dem i en injektion platta och sedan injicera 1 nl av fluorescerande MO i äggulan ≥ 100 embryon mellan de 256-cell och 1000-celler steg (Figur 1B).
  3. Äggula-riktade MO injektion: Samla embryon omedelbart efter befruktningen och inkubera vid 28,5 ° C. I kupolen stadiet (~ 4 HPF), ladda embryona till en injektion platta och sedan injicera 1 nl av fluorescerande MO i gulan av ≥ 100 embryon mellan kupolen och 30% stadier epiboly (figur 1C).

2. Välja Injicerade Embryon för analys

  1. När MO injicerade embryona når 75%-epiboly steg (8 HPF), ta bort obefruktade och döda embryon och sedan skärmen lever embryon under ett fluorescerande dissektionsmikroskop för distribution av den fluorescerande MO. Då alloW är vald embryon att utvecklas vid 28,5 ° C.
    1. För globala MO injektioner väljer embryon som har fluorescens jämnt fördelade i hela alla embryonala celler (Figur 1D, fig. 2A).
    2. För DFC riktade-MO injektioner, välj embryon som fluorescerande MO har diffunderat hela gulan och verkar koncentreras till den dorsala BLASTODERM marginal (DFCS) (Figur 1E, figur 2B). I detta skede kan det vara svårt att visualisera fluorescerande DFCS grund ljusa fluorescens i den underliggande äggula. Var noga med att utesluta embryon där fluorescerande MO har införlivats i embryonala celler än DFCS eller förblir aggregeras vid injektionsstället (Figur 2D).
    3. För äggula riktade-MO injektioner, välj embryon som MO fluorescens jämnt fördelade över hela gulan och inte observerats i någon embryonala celler (Figur 1F, Figur 2C). Återigen, ta bort embryon som den fluorescerande MO förbliraggregeras vid injektionsstället.
  2. Mellan de 2-4-somit steg (~ 11 HPF), skärmen embryon en andra gång under ett fluorescerande mikroskop med större förstoring. Låt sedan utvalda embryon att utvecklas i 28,5 ° C.
    1. För globala MO injektioner, se utvalda embryon har MO fluorescens jämnt fördelat i KV och alla embryonala celler (Figur 1D ", Figur 2E).
    2. För DFC riktade-MO injektioner, noggrant välja embryon som har MO fluorescens endast i KV celler och äggula (figur 1E). Transgena embryon som uttrycker GFP i KV celler, såsom Tg (Dusp6: d2EGFP) 27, kan hjälpa till vid identifieringen av embryon i vilken MO har framgångsrikt levererats till KV-celler (Figur 2F). Kasta embryon med MO fluorescens i embryonala celler andra som KV celler.
    3. För äggula riktade-MO injektioner, välj embryon som har MO fluorescens uteslutande i äggula (Figur 1F ': Bild2G).

3. Montering Embryon Att analysera vätskeflöde i KV

  1. För att analysera asymmetrisk vätskeflöde i KV globala MO, DFC-riktade MO eller äggula-riktade MO injicerade embryon, noggrant dechorionate ~ 20 embryon mellan 4-6 somit stadier (~ 11-12 HPF) med skarpa pincett.
  2. Bered 50 ml av 1% låg-smältpunkt agaros och alikvot i 5 ml rör som skall bibehållas som en vätska i en torr bad vid 42 ° C.
  3. Överför ett embryo till ett glas depression bild (United Scientific Supplies, Inc.) och ta bort så mycket av vattnet som möjligt. Immobilisera embryot genom tillsats av tillräckligt varm 1% låg-smältpunkt agaros att bara täcka embryot (alltför mycket agaros kan störa efterföljande avbildning). Som agarosen stelnar använder pincett för att placera embryot så att KV är vänd uppåt (dorsala utsikt) (Figur 1H). Montera 10 embryon med ett embryo per bild. Arbeta snabbt för att se till att alla injektioner i nästa steg är kompleted av 10 somit stadiet (14 HPF).

4. Injektion av Fluorescerande mikropärlor till KV

  1. Späd Fluoresbrite Multifuorescent 0,5 mikron diameter Mikrosfärer (Polysciences, Inc.) till 1:50 i sterilt vatten i en 1,5 ml Eppendorf-rör.
  2. Blanda 1:50 utspädning av mikropärlor ordentligt genom att trycka på röret och ladda 3 ul i en kapillär nål. Med samma microinjector för MO injektioner (t.ex. Harvard Apparatus PLI-90 Pico-injektor), bryta nålspetsen med pincett och justera injektion inställningarna för att ge minsta möjliga (<0,5 NL) injektion droppe.
  3. Under ett dissektionsmikroskop, rikta nålen med KV lumen monteras först embryot. Stick in nålen i lumen och injicera en liten volym (<0,5 NL) pärlor (Figur 1G). Ett litet nålspets och liten injektionsvolym är avgörande för att undvika skadlig KV.
  4. Injicera alla monterade embryon. När ett embryo har injected, en droppe sterilt vatten kan tillsättas ovanpå agaros för att hindra den från att torka ut. Under injektionerna kommer pärlorna hindra ofta nålen öppning. Detta kräver åter bryta nålspetsen och justera injektionsvolymen genom att modulera trycket eller tidsinställningen för mikroinjektion anordningen. Byt nålen om det blir trubbigt nog för att orsaka betydande skador under injektion.
  5. Skärm de injicerade embryon för framgångsrik leverans av pärlor i en upprätt fluorescerande mikroskop (t.ex. Zeiss AxioImager M1) med en 20X objektiv. Först avgöra om KV struktur är intakt med ljusfält belysning (figur 1J), och sedan använda fluorescens för att observera pärlorna. Välj embryon som pärlor är närvarande och rör sig inuti KV lumen. Kassera embryon med KV skada eller inga flytande kulor i KV. Det är lätt att missa KV och leverera pärlor till närliggande vävnad eller den underliggande äggula. Om det inte lyckades montera anoligare 10 embryon och upprepa injektionsproceduren.

5. Visualisering och analys av KV Vätskeflöde

  1. För varje vald embryo med pärlor inuti KV, tillsätt en droppe sterilt vatten för att täcka agaros och sedan observera KV under upprätt fluorescerande förening mikroskop med en 63X vatten doppa mål (figur 1I). Alternativt kan ett täckglas tillämpas för användning med icke-vatten doppa mål och / eller inverterade mikroskop.
  2. Använd en snabb kamera monterad på mikroskopet (t.ex. Zeiss AxioCamHSm) för att spela in en 10 sekunder film. Spela in både pärlorna med hjälp av fluorescerande kanalen (cirka 70 bilder / sek) och KV lumen med en brightfield eller differential interferens kontrast (DIC) kanal.
  3. Att visualisera alla pärla rörelser över tid, importera filmen av fluorescerande pärlor i ImageJ programvara (gratis nedladdning på http://rsb.info.nih.gov/ij/ ) ena skapa en maximal projektion av alla fluorescerande signaler i filmen. För att utföra den största projektionen i ImageJ, klicka på "Bild → Stacks → Z projekt." I "Z-projektet" fönstret projicera alla skivor med projektion typ av "Max intensitet". Denna bild kan överlagras på en DIC bild av KV där pärlorna avbildades (figurerna 3A-B).
  4. Rörelserna av enskilda pärlor kan spåras med hjälp ImageJ. Ett plugin ("Manuell spårning") kan laddas ned på http://rsbweb.nih.gov/ij/plugins/track/track.html . Öppna den fluorescerande pärlor filmen i ImageJ och kör manuell spårning funktionen. I fönstret för manuell spårning, kontrollera "visa parametrar" och parametrar ingång för "tidsintervall" och "x / y kalibrering". Manuellt välja pärlor som finns kvar i fokalplanet av filmen i ≥ 50 ramar och sedan spåra ≥ 5 kulor per embryo. Vägen och hastigheten av varje kula alstras av the programvara (figur 3 CD).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Scen-specifika MO injektioner ger en användbar metod för att analysera genfunktion i särskilda fack i embryot. Figur 1 visar ett flödesschema för injektion strategier som används för att testa genfunktion i DFC / KV celler och hur man introducerar fluorescerande pärlor att visualisera fluidflöde i KV. Fördelningen av fluorescerande MO i framgångsrika injicerade stadium-specifika embryon visas schematiskt i figurerna 1D-F och i levande embryon i figur 2., En misslyckad MO injektion i vilken MO förblir aggregeras i gulan cellen, visas i figur 2D.

Framgångsrikt injicerade embryon, väljs baserat på lokaliseringen av fluorescerande MO-kan monteras på de 4-6 somit stegen för leverans av fluorescerande mikropärlor till KV lumen (figur 1G-H) för att analysera vätskeflöde. Videomicroscopy används för att registrera pärla rörelser i KV (Figurerna 1I-J), som kan analyseras kvalitativt (fig 3A-B) eller kvantitativt (figur 3C-E) med ImageJ programvara. I en kontroll embryo med normala flödet följer pärlor moturs banor som kan visualiseras genom att göra en maximal projektion av fluorescerande pärlor positioner över tiden (figur 3A) eller genom att spåra individuella pärlor över tiden (figur 3C). För att demonstrera förlust av samordnad flöde injicerade vi embryon med MO till ÖVERVÄLDIGANDE Rho-kinas 2b (Rock2b), som vi tidigare har visat stör flödet 18. I Rock2b MO injicerade embryon, pärlor rör sig slumpmässigt i KV (figur 3B, D). ImageJ mjukvara användes för att beräkna hastigheten hos individuella pärlor spår. Den genomsnittliga hastigheten av 5 pärlorna från kontroll och Rock2b MO embryon visas i figur 3E.

es.jpg "src =" / files/ftp_upload/50038/50038fig1.jpg "/>
Figur 1. Översikt av steg-specifik MO injektioner och mikrokorn injektion i KV. (A) Injektion av fluorescerande MO (röd) i gulan vid 1-cellstadiet för global distribution av MO hela embryot. (B) DFC-riktade MO injektion vid 512-cell-stadiet att ladda MO i DFC / KV celler. (C) äggula-riktade MO injektion 30%-epiboly steg för att begränsa MO till äggulan. (DF) Schematisk representation av fördelningen av fluorescerande MO (röd) framgångsrikt injicerade embryon vid 75% epiboly steg (D, E, F) och 6 somit steget (D ', E', F ') efter steg- specifika injektioner. MO ackumuleras i DFC / KV cellhärstamning när den injiceras vid 512-cellstadiet (pilar i E, E '), men inte när de injiceras vid 30% epiboly (pilar i F, F'). (G) Injektion av fluorescerande mikropärlor (grön) till KV lumen. (H) En stöttaerly monterade embryo med KV (pil) uppåt för mikropärlor injektion. (I) Imaging pärlor rörelse i KV med en upprätt mikroskop. (J) Hög förstoring av en intakt KV lumen injiceras med mikropärlor. Embryonala stadier och ritningar embryo är baserade på ref. 28.

Figur 2
Figur 2. Val av embryon efter steg-specifika MO injektioner. (AC) Exempel på utvalda embryon vid 75% epiboly steg (8 HPF) i vilken fluorescerande MO (röd) har antingen införlivats i alla embryonala celler efter globala MO injektion (A), diffunderat genom gulan och DFCS (pil) efter DFC målinriktade MO injektion (B) eller kvar i äggula efter äggula riktad MO injektion (C). (D) Exempel på en utesluten embryo i vilken fluorescent MO aggregeras vid injektionsstället. (EG) Exempel på fluorescerande MO (röd) fördelning i utvalda embryon vid 4-somit steg (11,5 HPF). DIC bilder identifierar KV lumen (pil) i transgena Tg (Dusp6: d2EGFP) embryon som uttrycker GFP i KV celler 27. I den globala MO injicerade embryot, har MO observerades i KV och alla omgivande celler (E). I DFC riktade-MO injicerade embryo, MO samlokaliserade med GFP i de flesta KV celler och var också närvarande i underliggande äggula kärnor (F). I äggulan målinriktade embryo, har MO finns endast i äggula kärnor (G).

Figur 3
Figur 3. Kvalitativa och kvantitativa analyser av vätskeflöde i Kv. (AB) för kvalitativ analys av flöde, en maximal projektion av en 10 sek film visar rörelse av alla fluorescent mikropärlor injiceras i KV har överlagrad på en DIC bild av KV lumen i en global kontroll MO (A) eller Rock2b MO (B) injicerades embryot. (CE) att kvantifiera flöde, rörelse av individuella mikropärlor (n = 5) spårades i en kontroll embryo (C) och Rock2b MO injicerades embryon (D) och används för att beräkna en genomsnittlig hastighet vulst (E). Cirklar (CD) närma KV lumen gränser. Felstaplar (E) är en standardavvikelse.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Använda steg-specifika injektioner att rikta MO till DFC / KV cellhärstamning är en användbar metod för att studera cell-autonomi geners funktion och undvika pleiotropa fenotyper som orsakas av den globala gen knockdown. Dock kan dessa injektioner vara tekniskt utmanande. Injektion av MO mellan de 256-cell och 1.000-cell steg kan resultera i tre möjliga utfall: 1) MO förblir aggregeras vid injektionsstället, 2) Mo diffunderar hela gulan och går DFC / KV celler eller 3) i MO diffunderar i hela gulan och går in DFC / KV celler och andra embryonala celler. Därför väljer embryon som MO har flyttat enbart DFC / KV celler är ett viktigt steg i detta experiment. Det är viktigt att notera att MO kan ladda in alla DFC / KV celler men ofta går endast en delmängd av dessa celler 10. Orsakerna till denna mosaik inriktning fortfarande är oklara, men kan återspegla variationen i hur effektivt MO rör sig genom äggula och / eller tidpunkten för stängningen av individual broar mellan äggula och DFC stamfäder. Vi har inte funnit villkor som ökar inriktning effektiviteten, utan har förlitat sig på att välja embryon som de flesta KV cellerna har tagit upp MO. Den framgångsrika för att generera embryon med MO i de flesta DFC / KV celler vanligtvis ~ 20-30%, men det kan vara ganska varierande från dag till dag. Av denna anledning rekommenderar vi att injicera så många embryon som möjligt (≥ 100), och sedan noggrant välja ut embryon som har en lämplig fördelning av fluorescerande morfolino.

Kontrollexperiment är avgörande för tolkningen av resultaten av DFC riktade injektioner. En felpassning MO eller standard negativ kontroll MO (från Gene Verktyg, LLC) bör användas för att kontrollera icke-specifika effekter. Dessutom, eftersom DFC-riktade injektioner levererar MO till både äggula och DFC / KV cellhärstamning (figur 2F), är det viktigt att avgöra huruvida fenotyper i dessa embryon beror på förlust av gen kulInsatser i DFC / KV celler eller i äggula cellen. Jämföra fenotyper i DFC riktade embryon med äggula riktade embryon (figur 2F-G) ska identifiera DFC / KV cellspecifik påverkar. Naturligtvis kan vissa gener fungerar i både DFC / KV celler och äggula 16. Även om vi fokuserar på MO-medierade förlust av funktion analyser här kan DFC-riktade injektionsteknik och tillhörande experiment kontroll användas för att bedöma en vinst-of-funktion genom att injicera syntetisk mRNA överuttrycka ett särskilt protein i DFC / KV härstamning 17,22,24,29. En smart anpassning av denna metod som används DFC-riktad mRNA injektioner för att rädda den globala MO ÖVERVÄLDIGANDE endast i DFC / KV celler 30. Det bör dock noteras att inte alla mRNA injiceras på detta sätt resulterar i uttryck av det kodade proteinet i DFCS och celler KV, och viktiga kontroller bör ingå att bedöma nivån av proteinuttryck och distribution.

Framgångsrik leverans av mikrokorns in i den KV lumen att bedöma asymmetrisk flöde beror på att injicera kulorna vid optimala steg under den snabba utvecklingen av den transienta KV orgel. Vi börjar montering embryon vid 4-6 somit steg (~ 12 HPF) och sedan injicera mikrokulor i KV upp till 10 somit stadiet (14 HPF). Före 4 somit skede är lumen ofta alltför liten för att injicera, och i senare skeden (> 10 somiter) injektionen blir svår på grund av KV flyttar djupare in i embryot. En begränsning med denna teknik är som kräver KV lumen för att expandera till en storlek som framgångsrikt kan injiceras med mikropärlor. I de fall där MO ÖVERVÄLDIGANDE av en särskild gen stör allvarligt KV organisation och / eller minskar KV lumen storlek (översikt i ref. 31) kommer det att bli svårt, om inte omöjligt, att analysera flöde med detta tillvägagångssätt.

När man förbereder embryon för injektion av mikropärlor i KV, är det viktigt att montera embryot rakt längs den embryonala axeln med KV uppåt (figur 1H), Kan som embryo läge påverkar vinkeln att nålen går KV och vinkeln för imaging pärlor i KV. Det är också viktigt att använda en liten borrning injektionsnål och liten injektionsvolym av mikrokulor för att undvika skadlig KV. Vi rekommenderar att öva att utveckla en smidig insprutningsslag att sätta nålen i KV, släpp pärlorna och sedan snabbt dra tillbaka nålen från embryot. När förhållandena är optimala, kan vi lyckas leverera mikrokulor till ~ 50% (t.ex. n = 5/10) av de injicerade embryona.

Sammanfattningsvis steg-specifika MO injektioner och visualisering av mikrokorn i KV ger en möjlighet att studera funktionen av kandidatgener i LR cilierade celler.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Inga intressekonflikter deklareras.

Acknowledgments

Vi tackar Fiona Foley för utmärkt labb stöd och zebrafisk vård. Detta arbete stöddes en AHA predoctoral gemenskap GW (11PRE5730027) och NHLBI bidrag till HJY (R01HL66292) och JDA (R01HL095690).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Standard Control oligo-Lissamine tagged Gene Tools, LLC
Custom Rock2b morpholino oligo Gene Tools, LLC
Fluoresbrite Multifluorescent 0.5 micron Microspheres Polysciences, Inc. 24054

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Sutherland, M. J., Ware, S. M. Disorders of left-right asymmetry: heterotaxy and situsinversus. Am. J. Med. Genet. C Semin. Med. Genet. 151C (4), 307-317 (2009).
  2. Essner, J. J., Amack, J. D., Nyholm, M. K., Harris, E. B., Yost, H. J. Kupffer's vesicle is a ciliated organ of asymmetry in the zebrafish embryo that initiates left-right development of the brain, heart and gut. Development. 132 (6), 1247-1260 (2005).
  3. Nonaka, S., et al. Randomization of left-right asymmetry due to loss of nodal cilia generating leftward flow of extraembryonic fluid in mice lacking KIF3B motor protein. Cell. 95 (6), 829-837 (1998).
  4. Essner, J. J., et al. Conserved function for embryonic nodal cilia. Nature. 418 (6893), 37-38 (2002).
  5. Kramer-Zucker, A. G., et al. Cilia-driven fluid flow in the zebrafish pronephros, brain and Kupffer's vesicle is required for normal organogenesis. Development. 132 (8), 1907-1921 (2005).
  6. Schweickert, A., et al. Cilia-driven leftward flow determines laterality in Xenopus. Curr. Biol. 17 (1), 60-66 (2007).
  7. Tabin, C. J. The key to left-right asymmetry. Cell. 127 (1), 27-32 (2006).
  8. Cooper, M. S., D'Amico, L. A. A cluster of noninvolutingendocytic cells at the margin of the zebrafish blastoderm marks the site of embryonic shield formation. Dev. Biol. 180 (1), 184-198 (1996).
  9. Melby, A. E., Warga, R. M., Kimmel, C. B. Specification of cell fates at the dorsal margin of the zebrafish gastrula. Development. 122 (7), 2225-2237 (1996).
  10. Amack, J. D., Wang, X., Yost, H. J. Two T-box genes play independent and cooperative roles to regulate morphogenesis of ciliated Kupffer's vesicle in zebrafish. Dev. Biol. 310 (2), 196-210 (2007).
  11. Oteiza, P., Koppen, M., Concha, M. L., Heisenberg, C. P. Origin and shaping of the laterality organ in zebrafish. Development. 135 (16), 2807-2813 (2008).
  12. Amack, J. D., Yost, H. J. The T box transcription factor no tail in ciliated cells controls zebrafish left-right asymmetry. Curr. Biol. 14 (8), 685-690 (2004).
  13. Nasevicius, A., Ekker, S. C. Effective targeted gene 'knockdown' in zebrafish. Nat. Genet. 26 (2), 216-220 (2000).
  14. Bill, B. R., Petzold, A. M., Clark, K. J., Schimmenti, L. A., Ekker, S. C. A primer for morpholino use in zebrafish. Zebrafish. 6 (1), 69-77 (2009).
  15. Kimmel, C. B., Law, R. D. Cell lineage of zebrafish blastomeres. I. Cleavage pattern and cytoplasmic bridges between cells. Dev. Biol. 108 (1), 78-85 (1985).
  16. Arrington, C. B., Yost, H. J. Extra-embryonic syndecan 2 regulates organ primordia migration and fibrillogenesis throughout the zebrafish embryo. Development. 136 (18), 3143-3152 (2009).
  17. Caron, A., Xu, X., Lin, X. Wnt/beta-catenin signaling directly regulates Foxj1 expression and ciliogenesis in zebrafish Kupffer's vesicle. Development. 139 (3), 514-524 (2012).
  18. Wang, G., et al. The Rho kinase Rock2b establishes anteroposterior asymmetry of the ciliated Kupffer's vesicle in zebrafish. Development. 138 (1), 45-54 (2011).
  19. Aamar, E., Dawid, I. B. Sox17 and chordin are required for formation of Kupffer's vesicle and left-right asymmetry determination in zebrafish. Dev. Dyn. 239 (11), 2980-2988 (2010).
  20. Neugebauer, J. M., Amack, J. D., Peterson, A. G., Bisgrove, B. W., Yost, H. J. FGF signalling during embryo development regulates cilia length in diverse epithelia. Nature. 458 (7238), 651-654 (2009).
  21. Schneider, I., et al. Zebrafish Nkd1 promotes Dvl degradation and is required for left-right patterning. Dev. Biol. 348 (1), 22-33 (2010).
  22. Matsui, T., et al. Canopy1, a positive feedback regulator of FGF signaling, controls progenitor cell clustering during Kupffer's vesicle organogenesis. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 108 (24), 9881-9886 (2011).
  23. Shu, X., et al. Na,K-ATPase alpha2 and Ncx4a regulate zebrafish left-right patterning. Development. 134 (10), 1921-1930 (2007).
  24. Esguerra, C. V. Ttrap is an essential modulator of Smad3-dependent Nodal signaling during zebrafish gastrulation and left-right axis determination. Development. 134 (24), 4381-4393 (2007).
  25. Rosen, J. N., Sweeney, M. F., Mably, J. D. Microinjection of Zebrafish Embryos to Analyze Gene Function. J. Vis. Exp. (25), e1115 (2009).
  26. Yuan, S., Sun, Z. Microinjection of mRNA and Morpholino Antisense Oligonucleotides in Zebrafish Embryos. J. Vis. Exp. (27), e1113 (2009).
  27. Molina, G., et al. Zebrafish chemical screening reveals an inhibitor of Dusp6 that expands cardiac cell lineages. Nat. Chem. Biol. 5 (9), 680-687 (2009).
  28. Kimmel, C. B., Ballard, W. W., Kimmel, S. R., Ullmann, B., Schilling, T. F. Stages of embryonic development of the zebrafish. Dev. Dyn. 203 (3), 253-310 (1995).
  29. Schneider, I., Houston, D. W., Rebagliati, M. R., Slusarski, D. C. Calcium fluxes in dorsal forerunner cells antagonize beta-catenin and alter left-right patterning. Development. 135 (1), 75-84 (2008).
  30. Clement, A., Solnica-Krezel, L., Gould, K. L. The Cdc14B phosphatase contributes to ciliogenesis in zebrafish. Development. 138 (2), 291-302 (2011).
  31. Matsui, T., Bessho, Y. Left-right asymmetry in zebrafish. Cell Mol. Life Sci. , (2012).

Tags

Utvecklingsbiologi genetik Cellulär biologi neurovetenskap molekylärbiologi bioteknik biofysik Cilia zebrafisk, Gene ÖVERVÄLDIGANDE Tekniker vänster-höger asymmetri cilier Kupffer s vesikel djurmodell
Analys av geners funktion och Visualisering av Cilia-genererade vätskeflöde i Kupffer s vesikel
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Wang, G., Yost, H. J., Amack, J. D.More

Wang, G., Yost, H. J., Amack, J. D. Analysis of Gene Function and Visualization of Cilia-Generated Fluid Flow in Kupffer's Vesicle. J. Vis. Exp. (73), e50038, doi:10.3791/50038 (2013).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter