Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

Kupffer en veziküllü Gen Fonksiyonu ve Cilia Oluşturulan Akışkanın Görselleştirme Analizi

Published: March 31, 2013 doi: 10.3791/50038
Automatic Translation
1, 2, 1
1Department of Cell and Developmental Biology, State University of New York, Upstate Medical University, 2Department of Neurobiology and Anatomy, Eccles Institute of Human Genetics, University of Utah

Summary

Kupffer en veziküllü içinde Cilia üretilen sıvı akışı (KV) zebrafish embriyo sol-sağ desenlendirme denetler. Burada, KV hücrelerde özellikle gen fonksiyonu modüle bir teknik tarif. Ayrıca, sıvı akışını görselleştirmek için KV içine floresan boncuk sunmak için nasıl gösterir.

Abstract

Örneğin kalp, beyin ve bağırsak gibi iç organların normal işlevleri 1 için kritik olan sol-sağ (LR) asimetriler gelişebilir. Hareketli kirpikler fare, kurbağa, ve zebrafish 2-6 gibi omurgalı embriyolarının, LR asimetrisi kurma katılmaktadırlar. Bu 'LR kirpikler' organları 7 geliştirmek için LR desenlendirme bilgi sağlamak için düşünülmektedir sol lateral plaka mezoderm olarak kaskad sinyalizasyon korunmuş bir asimetrik Nodal (TGF-β süperailesi), tetiklemek için gerekli olan asimetrik akış oluşturur. Böylece, LR desenlendirme yatan mekanizmaları anlamak için, LR kirpikli hücrelerin organizasyonu, LR kirpikler ve sağlam asimetrik akış oluşturmak için yeteneklerini motilite ve uzunluğu düzenleyen genleri tanımlamak için gereklidir.

Zebrafish embriyo olarak, LR kirpikler 2,4,5 Kupffer en vesikül (KV) yer almaktadır. KV monociliated epitel hücreleri, tek bir tabaka oluşurBir sıvı dolu lümen içine aldığınız. Fate eşleme KV epiboly aşamaları sırasında 8,9 dorsal blastoderm kenar az göç dorsal haberci hücreleri (DFCS) olarak bilinen ~ 20-30 bir grup hücre elde edilir olduğunu göstermiştir. Erken somite aşamalarında, DFCS küme ve kirpikli epitel hücreleri içine ayırt embriyonun 10,11 tailbud KV oluşturur. Belirlemek ve izlemek için yeteneği DFCS-kombinasyon optik şeffaflık ve zebrafish KV LR kirpikli hücreleri incelemek için mükemmel bir model sistem embriyo-make zebrafish hızla gelişmesi ile.

İlginçtir, DFC / KV hücre soyunun ataları 4 saat sonrası fertilizasyon (HPF) ile sarısı hücresi arasındaki sitoplazmik köprüler kadar korumak, 2 hpf 8 sonrası yakın sarısı hücre ve diğer embriyonik hücreler arasında sitoplazmik köprüler oysa. Bu sitoplazmik köprü yararlanan biz morfolino oligonucle sunmak için bir sahne özgü enjeksiyon stratejisi geliştirdiDFCS ve devirme bu hücreler 12 bir hedef genin işlevi sadece otides (MO). Bu teknik, gen fonksiyonunun bir vahşi-tip embriyo bağlamında gelişen DFC / KV soy nakavt edildiği kimerik embriyolar oluşturur. KV asimetrik akış analiz etmek, biz KV lümeni ve videomicroscopy 2 kullanarak kayıt boncuk hareketin içine floresan mikroboncukları enjekte. Akışkan akışı kolaylıkla görülebilmektedir ve zamanla boncuk yerinden izleme ile belirlenebilir.

Burada sahne özgü DFC hedefli gen Knockdown tekniği ve akış görselleştirmek için KV içine floresan mikroboncuk enjeksiyon kullanılarak, biz KV gelişimi ve işlevi sırasında belirli bir genin rolü karakterize için etkili bir yaklaşım sağlayan bir protokol mevcut.

Protocol

Sahne Özgü Zebra balığı embriyo Enjeksiyonlar genel bakış

Bir hedef mRNA bağlamak ve bu transkript protein ekspresyonu bozmak antisens oligonükleotidler morfolino (MO), yaygın çalışmalar zebrafish 13,14 içinde (-kaybı fonksiyonu) gen devirme kullanılmaktadır. Gene Araçlar, LLC floresan mikroskopi kullanılarak enjekte edilen embriyolar MO tespit carboxyfluorescein (yeşil floresans yayar) veya lissamine (kırmızı floresans yayar) biriyle etiketlenmiş MOs sunmaktadır. Zebrafish farklı gelişim aşamalarında sarısı hücre içine MO enjekte ederek, bunun embriyo belirli bölümlerinde (Şekil 1A-F) MO sunmak mümkündür. MO 1-4 hücreli aşamasında (0-1 hpf) 32-hücreli aşamada 15 küresel knockdown kolaylaştırmak kadar devam sarısı ile bağlantıları aracılığıyla tüm embriyonik hücreler (Şekil 1A, D, D ') girer arasındaki sarısı içine enjekte. MO midblast sırasında sarısı içine enjekteula aşamaları (2.5-3 hpf) özellikle DFC / KV hücre soyu 12, diğer çoğu embriyonik hücre soylarının girmeden sitoplazmik köprüler 8 ve demonte gen işlevi aracılığıyla olasılıkla DFCS (Şekil 1B, D, E ') atalarıdır girebilirsiniz . Gen fonksiyonu DFC / KV ya da yumurta sarısı 12,16 de gerekli olup olmadığını test etmek için önemli bir kontrol olarak, kubbe sonra% 30 epiboly aşamaları (~ 4.5 HPF) arasına enjekte edilerek yumurta sarısı hücreye MO kısıtlamak için de mümkündür Tüm sitoplazmik köprüler (Şekil 1C, F, F ') kapattık. Bu enjeksiyonlar DFC / KV hücreleri 17-24 gen fonksiyonunu analiz etmek için birlikte kullanılmıştır. KV akışkan akışı değerlendirmek için, floresan mikroboncukları 6-10 somite aşamaları (12-14 hpf) ve hemen ardından videomicroscopy (Şekil 1G-J) kullanılarak görüntülendi. Arasındaki KV lümen içine enjekte edilir Microbeads kırmızı veya yeşil floresan (veya her ikisi) yayarlar mevcuttur, bu yüzden farklı kullanmak mümkündürgörüntü floresan mikroboncukları ve MO için kanalları.

1. Morpholinos evresi özel Enjeksiyon (MO)

Zebrafish embriyolar içine MO enjeksiyon daha önce 25,26 kanıtlanmıştır. Burada, kısaca sahne özgü MO enjeksiyonları açıklar. Tüm enjeksiyonlar sonrasında embriyolar bir Petri kabı aktarılır ve 28.5 de inkübe ° C

  1. Küresel MO enjeksiyonu: hemen döllenmeden sonra embriyolar toplayın ve bir enjeksiyon plaka içine yerleştirin. Bir kılcal iğne içine floresan MO yükleyin ve (örneğin, Harvard Apparatus PLI-90 Pico-enjektör) bir mikroenjektör üzerine iğne monte. Iğne ucu kırın ve 25,26 açıklandığı gibi 1 nl bir hacme sahip bir enjeksiyon damla oluşturmak için enjeksiyon ayarları (basınç ve / veya zaman) ayarlamak. Diseksiyon stereomikroskopta kullanarak, (Şekil 1A) sarısı içine MO 1 nl enjekte Deneme başına ≥ 50 embriyo. 4 hücreli erkeklere göre enjeksiyonları tamamlamak için hızlı çalışıne.
  2. DFC-hedefli MO enjeksiyon: 28.5 hemen döllenmeden sonra embriyolar toplayın ve inkübe ° C Embriyoların 256 hücreli evre (~ 2.5 hpf) ulaştığımda hızlı bir enjeksiyon plaka içine yerleştirin ve ardından (Şekil 256-hücre ve 1.000-hücre aşamaları arasındaki ≥ 100 embriyo sarısı içine floresan MO 1 nl enjekte 1B).
  3. Yolk hedefli MO enjeksiyon: 28.5 hemen döllenme ve inkübe sonra embriyolar toplayın ° C. Kubbe evre (~ 4 hpf) At, bir enjeksiyon plaka embriyolar yüklemek ve ardından kubbe ve% 30 epiboly aşamaları (Şekil 1C) arasındaki ≥ 100 embriyo sarısı floresan MO 1 nl enjekte.

2. Analiz için Injected Embriyolar seçme

  1. MO embriyolar (8 hpf)% 75-epiboly aşamaya enjekte zaman, floresan MO dağıtımı için bir floresan mikroskop altında döllenmemiş ve ölü embriyolar kaldırmak ve sonra ekran canlı embriyolarının. Sonra allow embriyolar 28.5 geliştirmek için seçilen ° C.
    1. Küresel MO enjeksiyonları için, eşit, embriyonik hücreler (; Şekil 2A Şekil 1D) boyunca floresans dağıttık embriyolar seçin.
    2. DFC-hedefli MO enjeksiyonları için, floresan MO sarısı boyunca yayılır ve dorsal blastoderm marjı (DFCS) (; Şekil 2B Şekil 1E) konsantre görünürse hangi embriyolar seçin. Bu aşamada, bu temel sarısında parlak floresan dolayı floresan DFCS görselleştirmek için zor olabilir. Floresan MO DFCS dışında embriyonik hücreler dahil ya kalır enjeksiyon yerinde (Şekil 2B) de araya getirdi hangi embriyoların dışlamak için dikkatli olun.
    3. Sarısı hedefli MO enjeksiyonları için, MO floresans eşit sarısı dağılmış ve herhangi bir embriyonik hücreler (; Şekil 2C Şekil 1F) görülmez olduğu embriyolar seçin. Yine, floresan MO kalır hangi embriyolar kaldırmakenjeksiyon yerinde toplanır.
  2. 2-4-somite aşamaları (~ 11 hpf) arasında, ekran embriyoların yüksek büyütme kullanarak bir floresan mikroskop altında ikinci kez. Ardından seçilen embriyolar 28.5 geliştirmek için izin ° C
    1. Küresel MO enjeksiyonları için seçilen embriyolar MO floresans eşit KV ve tüm embriyonik hücreler (; Şekil 2E Şekil 1D ') dağıtılır olmasını sağlamak.
    2. DFC-hedefli MO enjeksiyonları için, dikkatlice MO sadece KV hücrelerinde floresans ve yumurta sarısı (Şekil 1E ') sahip embriyolar seçin. 27, MO başarıyla KV hücreleri (Şekil 2F) teslim edildiği embriyoların belirlenmesinde yardımcı olabilir: örneğin Tg gibi KV hücrelerde ifade GFP (d2EGFP Dusp6) olduğunu Transgenik embriyolar. KV hücreler diğer embriyonik hücreler, MO floresan ile embriyolar atın.
    3. Sarısı hedefli MO enjeksiyonlar için, sarısı (Şekil 1F 'münhasıran MO floresans sahip embriyolar seçin: Şekil2G).

3. KV Akışkan Akışı Analiz için Montaj embriyolar

  1. Küresel MO KV asimetrik akış analiz etmek, MO veya sarısı hedefli MO enjekte edilen embriyolar DFC-hedefli, dikkatle dechorionate ~ keskin forseps ile 4-6 somite aşamaları (~ 11-12 hpf) arasında 20 embriyo.
  2. 42 kuru bir banyo içinde bir sıvı olarak muhafaza edilmesi 5 ml tüpler içine ° C'de% 1 düşük erime noktalı agaroz ve kısım 50 ml hazırlanması
  3. Bir cam depresyon slayt (Birleşik Bilimsel Malzemeleri A.Ş.) bir embriyo transferi ve mümkün olduğunca fazla su çıkarmak. Sadece (çok agaroz sonraki görüntüleme ile karışabilir) embriyo örtecek kadar ılık% 1 düşük erime noktası agaroz ekleyerek embriyo hareketsiz. Agaroz katılaşır gibi, bu embriyo konumlandırmak için forseps kullanın KV (Şekil 1H) (dorsal görünümü) kadar karşı karşıya. Slayt başına bir embriyo ile 10 embriyolar monte edin. Sonraki adımda tüm enjeksiyonlar compl sağlamak için hızlı bir şekilde çalışın10 somite aşaması (14 hpf) tarafından eted.

4. KV içine Floresan mikroboncuk Enjeksiyon

  1. 1.5 ml Eppendorf tüp içinde steril su içinde 1:50 Multifuorescent 0.5 mikron çaplı Mikroküreler (Polysciences, Inc) Fluoresbrite seyreltin.
  2. Tüp dokunarak iyice mikroboncuk 1:50 seyreltme karıştırın ve kılcal iğne içine 3 ul yükleyin. MO enjeksiyonları (örn. Harvard Apparatus PLI-90 Pico-enjektör) için kullanılan aynı mikroenjektör kullanarak, forseps ile iğne ucu kırmak ve olası en küçük (<0.5 nl) enjeksiyonu damla oluşturmak için enjeksiyon ayarlarını.
  3. Diseksiyon mikroskobu altında, ilk monte embriyonun KV lümenli iğne hizalayın. Lümenine iğne takın ve boncuklar küçük hacimli (<0.5 nl) (Şekil 1G) enjekte. Küçük bir iğne ucu ve küçük bir enjeksiyon hacmi zarar KV önlemek için kritik öneme sahiptir.
  4. Tüm monte embriyolar enjekte edilir. Bir embriyo injecte olmuştur kezd, steril bir su damlası kurumasını önlemek için agaroz üzerine ilave edilebilir. Enjeksiyonlar sırasında, boncuklar sık ​​iğne açılış engel olacaktır. Bu iğne ucu yeniden kırma ve mikroenjeksiyon aparatı modüle basınç ya da zaman ayarı ile enjeksiyon hacmi ayarlanması gerekir. Bu enjeksiyon sırasında önemli ölçüde zarar için yeterli künt hale gelirse iğneyi değiştirin.
  5. Ekranı dik floresan bileşik mikroskop (örneğin Zeiss AxioImager M1) altında boncuk başarılı teslimat için enjekte edilen embriyolar bir 20X objektif kullanılarak. İlk olarak, KV yapı aydınlık alan aydınlatma (Şekil 1J) kullanılarak bozulmamış olup olmadığını belirlemek ve daha sonra boncuklar gözlemlemek için floresan kullanır. Boncuk bugünü ve KV lümeni içinde hareket olduğu embriyolar seçin. KV hasar veya KV hiçbir yüzen boncuklar ile embriyolar atın. Bu KV özledim ve yakınlardaki doku veya altta yatan sarısı boncuk teslim etmek kolaydır. Montaj ano, başarısız olursa10 embriyolar ther ve enjeksiyon işlemi tekrarlayın.

5. KV Akışkanın Görselleştirme ve Analiz

  1. KV içinde boncuklar ile seçilen her embriyo için agaroz kapağı ve sonra 63X su daldırma objektif (Şekil 1I) kullanarak dik floresan bileşik mikroskop altında KV gözlemlemek için steril bir damla su ekleyin. Alternatif olarak, bir lamel olmayan su daldırma hedef ve / veya ters mikroskop ile birlikte kullanım için de uygulanabilir.
  2. 10 sn film kaydetmek için (örn. Zeiss AxioCamHSm) mikroskop üzerine monte edilmiş yüksek hızlı kamera kullanın. Bir aydınlık veya diferansiyel girişim kontrast (DIC) kanalı kullanılarak floresan kanal (yaklaşık 70 kare / sn) ve KV lümen kullanarak boncuklar hem kaydedin.
  3. Zamanla tüm boncuk hareketleri görselleştirmek için, ImageJ yazılım (ücretsiz indir içine floresan boncuk film almak http://rsb.info.nih.gov/ij/ ) birnd filmde tüm floresan sinyallerin maksimum projeksiyon oluşturun. ImageJ yılında maksimum projeksiyon gerçekleştirmek için, tıklayın "Görüntü → Yığınları → Z projesi." "Z projesi" penceresinde, "Max yoğunluğu" projeksiyon tipi ile tüm dilimleri proje. Bu görüntü boncukları (Şekil 3A-B) görüntülü edildiği KV bir DIC görüntü üzerine yerleştirilebilir.
  4. Bireysel boncuk hareketleri ImageJ kullanılarak izlenebilir. Bir eklenti ("Manuel İzleme") indirilebilir http://rsbweb.nih.gov/ij/plugins/track/track.html . ImageJ yılında floresan boncuk film açın ve Manuel İzleme işlevini çalıştırın. Manuel Takibi penceresinde, "zaman aralıkları" ve "x / y kalibrasyon" için "show parametreleri" ve giriş parametrelerini kontrol edin. Elle ≥ 50 kare için filmin odak düzlemi kalır boncuk seçin ve ardından embriyo başına ≥ 5 boncuk izleyebilirsiniz. Her boncuk yolu ve hızı inci tarafından oluşturulane yazılımı (Şekil 3 CD).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Sahne özgü MO enjeksiyonlar embriyonun belirli bölümlerinde gen fonksiyonlarını analiz için kullanışlı bir yaklaşım sağlar. Şekil 1 akış görselleştirmek için floresan boncuk tanıtmak DFC / KV hücrelerinde ve nasıl gen işlevi sınamak için kullanılan enjeksiyon stratejilerinin bir akış şeması sunuyor KV. Başarılı bir aşama özgü enjekte edilen embriyolar floresan MO dağılımı Şekil 1B-F ve Şekil 2 'de canlı embriyolar şematik olarak gösterilmektedir. Başarısız bir MO enjeksiyon, yumurta sarısı hücre içinde toplanmış MO kalır, Şekil 2B'de gösterilmiştir;.

Başarıyla enjekte edilen embriyolar seçilmiş floresan lokalizasyonu MO-can sıvı akışını analiz KV lümen (Şekil 1G-H) içine floresan mikroboncuk teslimat için 4-6 somite aşamada monte edilebilir dayanmaktadır. Videomicroscopy KV boncuk hareketleri (Şekil 1I-J), kayıt için hangi nitel analiz (Şekil 3A-B) veya nicel (Şekil 3C-E) ImageJ yazılımı kullanılarak yapılabilir. Normal akış kontrol embriyoda boncuk zamanla floresan boncuk pozisyonları maksimum projeksiyon (Şekil 3A) yaparak veya zaman (Şekil 3C) üzerinden tek tek boncuk izleme ile görülebilmesi yolları tersine takip. Koordineli akış kaybı göstermek için, biz daha önce akış 18 bozan göstermiştir knockdown Rho kinaz 2b (Rock2b) için MO ile embriyolar enjekte. Rock2b MO enjekte embriyolarda, boncuk KV (Şekil 3B, D) rastgele hareket. ImageJ yazılım bireysel boncuk parçaların hızını hesaplamak için kullanıldı. Kontrol ve Rock2b MO embriyolar 5 boncuk ortalama hız Şekil 3E 'de gösterilmiştir.

es.jpg "src =" / files/ftp_upload/50038/50038fig1.jpg "/>
Şekil 1. KV içine sahne özgü MO enjeksiyonları ve microbead enjeksiyon Bakış. Embriyo genelinde MO global dağıtım için 1-hücreli aşamada yumurta sarısı içerisine floresan MO (kırmızı) (A) Enjeksiyon. (B) DFC / KV hücrelere MO yüklemek için 512-hücreli aşamada MO enjeksiyon DFC-hedeflenmiş. (C) sarısı MO kısıtlamak için% 30-epiboly aşamada MO enjeksiyon Yolk hedefli. '(E', F 'aşağıdaki (DF) 75% epiboly aşaması (D, E, F) ve 6 somite evre D) başarıyla enjekte edilen embriyolar floresan MO (kırmızı) dağılımının şematik' sahne- Belirli enjeksiyonları. '(F oklar, F) epiboly% 30 enjekte edildiğinde değil, 512-hücreli evre (E, E oklar)' de enjekte edildiğinde MO DFC / KV hücre soyu birikir. KV lümenine floresan mikroboncuk (G) Enjeksiyon (yeşil). (H) A propKV (ok) microbead enjeksiyon için yukarı bakacak şekilde çevrilir monte embriyo. KV (I) Görüntüleme boncuklar hareket dik bir mikroskop kullanarak. Mikroboncukları enjekte intakt KV lümeninin (J) Yüksek büyütmeli. Embriyonik aşamaları ve embriyo çizimleri ref dayanmaktadır. 28.

Şekil 2,
Şekil 2. Sahne özgü MO enjeksiyonları takiben embriyo seçimi. Floresan MO (kırmızı) ya DFC takip sarısı ve DFCS (ok) tarafından yayılır küresel MO enjeksiyon (A) izleyen tüm embriyonik hücreler, dahil olan hangi% 75 epiboly evre (8 hpf) de seçilen embriyoların (AC) Örnekler hedefli MO enjeksiyon (B) veya sarısı hedefli MO enjeksiyon (C) takiben sarısı kaldı. Yılında fluo dışlanmış bir embriyo (D) Örnekrescent MO enjeksiyon yerinde toplanır. 4-somite aşamalı (11.5 hpf) seçilen embriyolar floresan MO (kırmızı) dağıtım (EG) Örnekler. DIC görüntüleri transgenik Tg de KV lümen (ok) (Dusp6: d2EGFP) tanımlamak embriyolar KV hücreleri 27 ekspres GFP. Küresel MO enjekte embriyo olarak, MO KV ve tüm çevredeki hücreleri (E) gözlenmiştir. DFC-hedefli MO enjekte embriyo olarak, MO çoğu KV hücreleri GFP ile eş lokalize ve sarısı çekirdekleri (F) altta yatan mevcuttu. Sarısı hedefli embriyoda MO sarısı çekirdekler (G) münhasıran bulundu.

Şekil 3
Şekil 3,. KV akışkan akışının nitel ve nicel analizleri. (AB) akış kalitatif analizi, tüm fluoresc bir 10 sn filmi gösteren bir hareket maksimum projeksiyon içinKV enjekte ent mikroboncukları küresel bir kontrol MO (A) veya Rock2b MO (B) enjekte embriyo KV lümen bir DIC resmin üzerine bindi. (CE) (n = 5), bir kontrol embriyo (C) ve Rock2b MO enjekte embriyo (D) olarak izlenir ve bir ortalama boncuk hızı (E) hesaplamak için kullanılan özel mikroboncuk akımı, hareket ölçmek için. Circles (CD) yaklaşık KV lümen sınırları. Hata çubukları (E) bir standart sapmayı temsil etmektedir.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

DFC / KV hücre soyu için MO hedeflemek için sahne özel enjeksiyonlar kullanarak gen fonksiyonu hücre özerklik incelemek ve küresel gen demonte neden pleiotropik fenotipleri önlemek için faydalı bir yaklaşımdır. Ancak, bu enjeksiyonları teknik olarak zor olabilir. 256 hücreli ve 1000-hücre aşamaları arasında MO enjeksiyon üç olası sonuçlara neden olabilir: 1) MO sarısı boyunca MO yayılır) enjeksiyon yerinde, 2 toplanır kalır ve DFC / KV hücreleri veya 3) MO girer sarısı boyunca yayılır ve DFC / KV hücreleri ve diğer embriyonik hücrelerin içine girer. Bu nedenle, MO DFC / KV hücreleri münhasıran taşındı hangi embriyoların seçiminde bu deneyde önemli bir adımdır. Bu MO Tüm DFC / KV hücre içine yükleyebilirsiniz dikkat etmek önemlidir ama genellikle bu hücrelerin 10 yalnızca bir alt kümesini girer. Hedefleme bu mozaik altında yatan nedenleri bilinmemektedir, ama sarısı ve / veya ind kapanma zamanının yoluyla ne kadar verimli MO hamle değişkenliği yansıtıyor olabilirsarısı ve DFC ataları arasında ividual köprüler. Biz şartları bulamadık verimliliği artıran hedefleme, daha ziyade KV hücrelerinin çoğu MO almış olan embriyoların seçiminde yararlanmıştır. DFC / KV hücrelerin çoğunluğu ile MO embriyo üretmek için başarı oranı genellikle% 20-30 ~, ama bu günden güne oldukça değişken olabilir. Bu nedenle, mümkün olduğunca çok sayıda embriyo (≥ 100) olarak enjekte tavsiye ve sonra dikkatlice floresan morfolino dağılımının uygun olması embriyoların seçiminde.

Kontrol deneyleri DFC hedefli enjeksiyonu sonuçlarını yorumlamak için hayati önem taşımaktadır. Bir uyumsuzluk MO veya standart negatif kontrol MO (Gen Araçlar, LLC) non-spesifik etkileri kontrol etmek için kullanılmalıdır. DFC hedefli enjeksiyonlar sarısı ve DFC / KV hücre soyu (Şekil 2F) hem MO teslim tarihi ek olarak, bu embriyolar fenotipleri gen eğlenceli kaybı nedeniyle olup olmadığını belirlemek için önemlidirDFC / KV hücreleri veya yumurta sarısı hücre şeklinde gösterilmektedir. Sarısı hedefli embriyolar (Şekil 2F-G) ile DFC hedefli embriyolar fenotipleri karşılaştırma DFC / KV hücre spesifik etkiler belirleyecektir. Tabii ki, bazı genler DFC / KV hücreleri ve sarısı 16 hem de işlev görebilir. Burada MO-aracılı kayıp fonksiyon-analizleri odak rağmen, DFC-hedefli enjeksiyon tekniği ile ilişkili kontrol deneyleri DFC / KV belirli bir protein için overexpress sentetik mRNA enjekte edilmesiyle bir kazanç fonksiyon-değerlendirmek için de kullanılabilir soy 17,22,24,29. Bu yaklaşımın bir akıllı adaptasyon kullanılan DFC hedefli sadece DFC / KV hücrelerinde 30 küresel MO knockdown kurtarmak için mRNA enjeksiyonları. Bununla birlikte, DFCS ve KV hücreleri, ve önemli kontroller olarak kodlanmış protein ifadesi bu şekilde sonucu olarak enjekte tüm mRNA ekspresyonu ve protein dağıtımı seviyesini belirlemek için dahil edilmesi gerektiği not edilmelidir.

Microbead başarıyla teslimasimetrik akış değerlendirmek için KV lümenine ler geçici KV organın hızlı gelişimi sırasında optimal aşamalarında boncuk enjekte bağlıdır. Biz 4-6 somite aşamaları (~ 12 hpf) montaj embriyolar başlar ve daha sonra 10 somite aşaması (14 hpf) kadar KV içine mikroboncukları enjekte. Önceki 4 somite aşamasına, lümen genellikle enjekte için çok küçük olduğunu ve daha sonraki aşamalarda (> 10 Somitlerin) de enjeksiyon nedeniyle KV embriyo derinliklerine hareket etmek zorlaşır. Bu tekniğin bir sınırlama KV lümen başarıyla mikroboncukları enjekte edilebilir bir boyuta genişletmek için gerektirmesidir. Durumlarda nerede bir gen MO knockdown ciddi KV organizasyon ve / bozan veya KV lümen boyutu (ref gözden. 31) bu yaklaşımı kullanarak test akışı, imkansız değilse, zor olacaktır azaltır.

KV içine mikroboncuk enjeksiyon için embriyolar hazırlanırken, düz KV (Şekil 1H yukarı bakacak embriyonik eksen boyunca embriyo monte etmek önemlidir), Embriyo pozisyon olarak iğne KV ve KV görüntüleme boncuk açı girdiği açılı etkileyebilir. Zarar KV önlemek için bir küçük delikli mikro-enjeksiyon iğne ve enjeksiyon hacmi küçük kullanmak için de önemlidir. Biz KV içine iğne eklemek için düzgün bir enjeksiyon inme geliştirmek için pratik tavsiye, boncuk bırakın ve daha sonra hızlı bir embriyodan iğne çekin. Koşulları uygun olduğunda, biz başarıyla enjekte embriyo ~ 50% (örneğin n = 5/10) mikroboncukları teslim edebiliyoruz.

Özetle, sahne özgü MO enjeksiyonları ve KV mikroboncuk görselleştirme LR kirpikli hücreleri aday genlerin işlevini incelemek için bir fırsat sağlar.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Çıkar çatışması ilan etti.

Acknowledgments

Biz mükemmel laboratuvar desteği ve zebrafish bakımı için Fiona Foley ederim. Bu eser bir GW AHA predoctoral dostluk (11PRE5730027) ve HJY (R01HL66292) ve JDA (R01HL095690) için NHLBI hibe desteklenmiştir.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Standard Control oligo-Lissamine tagged Gene Tools, LLC
Custom Rock2b morpholino oligo Gene Tools, LLC
Fluoresbrite Multifluorescent 0.5 micron Microspheres Polysciences, Inc. 24054

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Sutherland, M. J., Ware, S. M. Disorders of left-right asymmetry: heterotaxy and situsinversus. Am. J. Med. Genet. C Semin. Med. Genet. 151C (4), 307-317 (2009).
  2. Essner, J. J., Amack, J. D., Nyholm, M. K., Harris, E. B., Yost, H. J. Kupffer's vesicle is a ciliated organ of asymmetry in the zebrafish embryo that initiates left-right development of the brain, heart and gut. Development. 132 (6), 1247-1260 (2005).
  3. Nonaka, S., et al. Randomization of left-right asymmetry due to loss of nodal cilia generating leftward flow of extraembryonic fluid in mice lacking KIF3B motor protein. Cell. 95 (6), 829-837 (1998).
  4. Essner, J. J., et al. Conserved function for embryonic nodal cilia. Nature. 418 (6893), 37-38 (2002).
  5. Kramer-Zucker, A. G., et al. Cilia-driven fluid flow in the zebrafish pronephros, brain and Kupffer's vesicle is required for normal organogenesis. Development. 132 (8), 1907-1921 (2005).
  6. Schweickert, A., et al. Cilia-driven leftward flow determines laterality in Xenopus. Curr. Biol. 17 (1), 60-66 (2007).
  7. Tabin, C. J. The key to left-right asymmetry. Cell. 127 (1), 27-32 (2006).
  8. Cooper, M. S., D'Amico, L. A. A cluster of noninvolutingendocytic cells at the margin of the zebrafish blastoderm marks the site of embryonic shield formation. Dev. Biol. 180 (1), 184-198 (1996).
  9. Melby, A. E., Warga, R. M., Kimmel, C. B. Specification of cell fates at the dorsal margin of the zebrafish gastrula. Development. 122 (7), 2225-2237 (1996).
  10. Amack, J. D., Wang, X., Yost, H. J. Two T-box genes play independent and cooperative roles to regulate morphogenesis of ciliated Kupffer's vesicle in zebrafish. Dev. Biol. 310 (2), 196-210 (2007).
  11. Oteiza, P., Koppen, M., Concha, M. L., Heisenberg, C. P. Origin and shaping of the laterality organ in zebrafish. Development. 135 (16), 2807-2813 (2008).
  12. Amack, J. D., Yost, H. J. The T box transcription factor no tail in ciliated cells controls zebrafish left-right asymmetry. Curr. Biol. 14 (8), 685-690 (2004).
  13. Nasevicius, A., Ekker, S. C. Effective targeted gene 'knockdown' in zebrafish. Nat. Genet. 26 (2), 216-220 (2000).
  14. Bill, B. R., Petzold, A. M., Clark, K. J., Schimmenti, L. A., Ekker, S. C. A primer for morpholino use in zebrafish. Zebrafish. 6 (1), 69-77 (2009).
  15. Kimmel, C. B., Law, R. D. Cell lineage of zebrafish blastomeres. I. Cleavage pattern and cytoplasmic bridges between cells. Dev. Biol. 108 (1), 78-85 (1985).
  16. Arrington, C. B., Yost, H. J. Extra-embryonic syndecan 2 regulates organ primordia migration and fibrillogenesis throughout the zebrafish embryo. Development. 136 (18), 3143-3152 (2009).
  17. Caron, A., Xu, X., Lin, X. Wnt/beta-catenin signaling directly regulates Foxj1 expression and ciliogenesis in zebrafish Kupffer's vesicle. Development. 139 (3), 514-524 (2012).
  18. Wang, G., et al. The Rho kinase Rock2b establishes anteroposterior asymmetry of the ciliated Kupffer's vesicle in zebrafish. Development. 138 (1), 45-54 (2011).
  19. Aamar, E., Dawid, I. B. Sox17 and chordin are required for formation of Kupffer's vesicle and left-right asymmetry determination in zebrafish. Dev. Dyn. 239 (11), 2980-2988 (2010).
  20. Neugebauer, J. M., Amack, J. D., Peterson, A. G., Bisgrove, B. W., Yost, H. J. FGF signalling during embryo development regulates cilia length in diverse epithelia. Nature. 458 (7238), 651-654 (2009).
  21. Schneider, I., et al. Zebrafish Nkd1 promotes Dvl degradation and is required for left-right patterning. Dev. Biol. 348 (1), 22-33 (2010).
  22. Matsui, T., et al. Canopy1, a positive feedback regulator of FGF signaling, controls progenitor cell clustering during Kupffer's vesicle organogenesis. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 108 (24), 9881-9886 (2011).
  23. Shu, X., et al. Na,K-ATPase alpha2 and Ncx4a regulate zebrafish left-right patterning. Development. 134 (10), 1921-1930 (2007).
  24. Esguerra, C. V. Ttrap is an essential modulator of Smad3-dependent Nodal signaling during zebrafish gastrulation and left-right axis determination. Development. 134 (24), 4381-4393 (2007).
  25. Rosen, J. N., Sweeney, M. F., Mably, J. D. Microinjection of Zebrafish Embryos to Analyze Gene Function. J. Vis. Exp. (25), e1115 (2009).
  26. Yuan, S., Sun, Z. Microinjection of mRNA and Morpholino Antisense Oligonucleotides in Zebrafish Embryos. J. Vis. Exp. (27), e1113 (2009).
  27. Molina, G., et al. Zebrafish chemical screening reveals an inhibitor of Dusp6 that expands cardiac cell lineages. Nat. Chem. Biol. 5 (9), 680-687 (2009).
  28. Kimmel, C. B., Ballard, W. W., Kimmel, S. R., Ullmann, B., Schilling, T. F. Stages of embryonic development of the zebrafish. Dev. Dyn. 203 (3), 253-310 (1995).
  29. Schneider, I., Houston, D. W., Rebagliati, M. R., Slusarski, D. C. Calcium fluxes in dorsal forerunner cells antagonize beta-catenin and alter left-right patterning. Development. 135 (1), 75-84 (2008).
  30. Clement, A., Solnica-Krezel, L., Gould, K. L. The Cdc14B phosphatase contributes to ciliogenesis in zebrafish. Development. 138 (2), 291-302 (2011).
  31. Matsui, T., Bessho, Y. Left-right asymmetry in zebrafish. Cell Mol. Life Sci. , (2012).

Tags

Gelişimsel Biyoloji Sayı 73 Genetik Hücre Biyolojisi Nörobilim Moleküler Biyoloji Biyomühendislik Biyofizik Cilia Zebra balığı, Sol-sağ asimetri kirpikler Kupffer en veziküllü hayvan modeli
Kupffer en veziküllü Gen Fonksiyonu ve Cilia Oluşturulan Akışkanın Görselleştirme Analizi
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Wang, G., Yost, H. J., Amack, J. D.… More

Wang, G., Yost, H. J., Amack, J. D. Analysis of Gene Function and Visualization of Cilia-Generated Fluid Flow in Kupffer's Vesicle. J. Vis. Exp. (73), e50038, doi:10.3791/50038 (2013).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter