واحدة جزيء التصوير من تنظيم الجينات Published: March 15, 2013 doi: 10.3791/50042

DOI

Automatic Translation

• English (Original)
• العربية (Arabic)
• 中文 (Chinese)
• dansk (Danish)
• Nederlands (Dutch)
• français (French)
• Deutsch (German)
• עברית (Hebrew)
• हिंदी (Hindi)
• italiano (Italian)
• 日本語 (Japanese)
• 한국어 (Korean)
• norsk (Norwegian)
• português (Portugese)
• русский (Russian)
• español (Spanish)
• svenska (Swedish)
• Türkçe (Turkish)

Zach Hensel¹, Xiaona Fang^1,2,3, Jie Xiao¹

¹Department of Biophysics and Biophysical Chemistry, Johns Hopkins University School of Medicine, ²Changchun Institute of Applied Chemistry, Chinese Academy of Sciences, ³Department of Physics, Jilin University

Summary

وصفنا طريقة المجهر مضان، شركة متعدية تنشيط من قبل انشقاق (CoTrAC)، لإنتاج صورة جزيئات البروتين في الخلايا الحية مع واحدة جزيء الدقة دون احداث بلبلة وظيفة البروتين. وقد استخدم هذا الأسلوب لمتابعة ديناميات التعبير العشوائية من عامل النسخ، وقامع λ CI

Abstract

وصفنا طريقة المجهر مضان، شركة متعدية تنشيط من قبل انشقاق (CoTrAC) لإنتاج صورة جزيئات البروتين في الخلايا الحية مع واحدة جزيء الدقة دون احداث بلبلة وظيفة البروتين. هذا الأسلوب يجعل من الممكن لحساب عدد جزيئات البروتين التي تنتج في خلية واحدة خلال متتابعة، ويندوز غضون خمس دقائق. يتطلب المجهر مضان مع الإثارة ليزر كثافة قوة كيلوواط 0،5 حتي 1 ~ / سم ^2، وهي حساسة بما فيه الكفاية للكشف عن جزيئات البروتين واحد الفلورية في الخلايا الحية. مراسل الفلورية المستخدمة في هذا الأسلوب يتكون من ثلاثة أجزاء: سلسلة استهداف الغشاء، وهي سريعة النضج، بروتين فلوري الصفراء وتسلسل الاعتراف البروتيني. وتنصهر translationally مراسل لمحطة-N من البروتين من الفائدة. تزرع الخلايا على مرحلة المجهر التحكم في درجة حرارته. كل خمس دقائق، وتصوير جزيئات نيون داخل الخلايا (وشارك في وقت لاحقمن خلال تحليل الصور unted مضان) وبعد ذلك photobleached بحيث يتم عد البروتينات حديثا فقط ترجمت في قياس المقبل.

ويمكن تحليل الصور مضان الناتجة عن هذه الطريقة عن طريق الكشف عن البقع الفلورية في كل صورة، وتكليف لهم لخلايا فردية ومن ثم تعيين الخلايا لالأنساب الخلية. يتم حساب عدد من البروتينات التي تنتج داخل نافذة الوقت في خلية معينة بقسمة كثافة مضان متكاملة من البقع من جزيئات الشدة متوسط ​​الفلورسنت واحدة. استخدمنا هذا الأسلوب لقياس مستويات التعبير في حدود 0-45 الجزيئات في واحدة 5 دقائق الوقت في Windows. تمكين هذه الطريقة لقياس الضوضاء لنا في التعبير عن CI قامع λ، ولها العديد من التطبيقات المحتملة الأخرى في بيولوجيا الأنظمة.

Protocol

1. سلالة الهندسة سير العمل

1. إدراج تسلسل الترميز (أ) تسلسل غشاء الترجمة، (ب). بروتين سريع النضج والفلورسنت (ج) تسلسل الاعتراف البروتيني N-محطة لوالإطار مع بروتين من الفائدة (على سبيل المثال عامل النسخ) كنا الغشاء استهدفت ^TSR-2 و فينوس مراسل تنصهر إلى البروتيني تسلسل الاعتراف اليوبيكويتين (UB) لحساب عدد من عاثية أعرب λ قامع جزيئات البروتين CI. تفاصيل عن الكيفية التي شيدت البروتين الانصهار TSR-فينوس-UB-CI، لتحل محل البرية من نوع الترميز CI المنطقة وإدماج بناء في E. ويرد وصف كروموسوم القولونية باستخدام λ الأحمر إعادة التركيب ^3، بالتفصيل في المرجع. 1.
2. التحقق من جميع تعديلات من قبل التسلسل.
3. تحويل ترميز البلازميد والبروتيني محددة لتسلسل الاعتراف المستخدمة أعلاه الى سلالة التعبير عن بروتين الفلورية ومراسل من الفائدةفي الانصهار متعدية. استخدمنا البروتيني Ubp1، الذي يشق مباشرة بعد محطة بقايا C-اليوبيكويتين ^4.

2. خلايا الثقافة وإعداد نموذج

1. اختيار واحد E. مستعمرة بكتيريا من الاهتمام من لوحة أجار يشوبه طازجة على 1 مل سائل الإعلام M9 الحد الأدنى من ⁵ تستكمل مع الأحماض الأمينية MEM 1X والمضادات الحيوية المناسبة. احتضان في درجة الحرارة المطلوبة في شاكر طويلة بما فيه الكفاية للوصول إلى OD _600> 1.0 (الكثافة البصرية في 600 نانومتر).
2. تمييع الثقافة في 1 مل المتوسطة M9 جديدة مع المضادات الحيوية المناسبة لOD _​​600 = 0.02. احتضان شاكر في في درجة حرارة مناسبة. ويمكن زيادة الكثافة الخلوية الأولية إذا لزم الأمر لدرجات الحرارة المنخفضة النمو.
3. عندما OD ₆₀₀ = 0،2-0،3 (عند 37 درجة مئوية مع زراعة الخلايا الأولية في OD ₆₀₀ = 0.02، هذا سيستغرق ساعة 3-4)، البدء في إعداد جيل الاغاروز وحة (الخطوة 3).
4. الخلايا على استعداد للتصوير عندما OD
5. 1 ثقافة مل نقل المحتضنة في أنبوب مل ميكروسنتريفوج 1.5، الطرد المركزي في 10،000 XG لمدة 1 دقيقة في ميكروسنتريفوج الفوق.
6. تجاهل طاف وإضافة 1 مل M9 المتوسطة الطازجة و resuspend بيليه بلطف.
7. الطرد المركزي في 10000 x ج لمدة 1 دقيقة.
8. كرر الخطوة 1.6 و 1.7. تجاهل طاف.
9. إعادة تعليق بلطف وسائل الاعلام في 1 مل M9. ويمكن استخدام خلايا مباشرة للتصوير المجهر المخفف أو 10 - لأضعاف-100 لضمان الكثافة المنخفضة خلية للتصوير timelapse. نلاحظ أن كثافة منخفضة الخلية مهمة للتصوير timelapse الموسعة. وختم غرفة التصوير (الخطوة 4) أثناء التجربة. بسبب النمو المتسارع للخلايا، ويمكن تركيزات عالية من الخلايا الأولية تستنفد الأكسجين بشكل كبير داخل غرفة بعد نمو متواصل في لوحة هلام، والحد من الفلورسنت النضج البروتين والتي تؤثر في نمو الخلايا.

3. إعداد الحل الاغاروز

1. وزن 10-20 ميلي غرامذوبان منخفضة درجة الحرارة الاغاروز في أنبوب microcentrifuge 1.5 مل.
2. إضافة مناسبة المتوسطة M9 حجم الحد الأدنى من المضادات الحيوية دون حل لجعل الاغاروز 3٪.
3. تسخين الحل الاغاروز لمدة 30 دقيقة في 70 درجة مئوية لإذابة، عكس الأنبوب للتأكد من أن الحل هو ذاب تماما ومتجانسة. يمكن سكب هلام لوحة في هذه المرحلة (الخطوة 4) أو يمكن تخفيض درجة الحرارة إلى 50 ° C واحتجز لعدة ساعات لاستخدامها لاحقا.

4. إعداد لوحة جل في الدائرة

1. حوالي 50 دقيقة قبل التصوير، وشطف شريحة Microaqueduct بالماء.
2. شطف الزجاج غطاء تنظيفها 1 (باستخدام طريقة التنظيف صارمة مثل التي وصفت في ⁶⁾ وMicroaqueduct الشريحة مع الماء المعقم والجافة التي تهب مع الهواء المضغوط.
3. وضع طوقا المطاط على الشريحة Microaqueduct بحيث يغطي مداخل ومنافذ على الجانب كوب من الشريحة Microaqueduct (يمكن تعديل هذه لتقديم الطلبات فيالذي perfused وسائل الإعلام من خلال العينة). تطبيق 50 ميكرولتر حل الاغاروز (الخطوة 3) إلى وسط الشريحة Microaqueduct.
4. تتصدر حل الاغاروز مع تنظيفها، والزجاج غطاء الجافة.
5. السماح للحل الاغاروز الوقوف في درجة حرارة الغرفة لمدة 30 دقيقة.
6. وفي الوقت نفسه، يعد عينة الخلية (الخطوة 2).
7. تقشر بعناية والزجاج غطاء من أعلى منصة هلام. إضافة ميكرولتر 1،0 زراعة الخلايا غسلها إلى الأعلى لوحة هلام. انتظر دقيقة 2 ~ للثقافة لتمتصه لوحة هلام. من المهم عدم الانتظار طويلا حتى يتسنى للسادة هلام overdries، ولكن لفترة كافية من الالتزام بشكل صحيح الخلايا إلى لوحة هلام. والوقت المثالي انتظار تختلف مع درجة الحرارة والرطوبة.
8. أثناء انتظار، تجف آخر الزجاج غطاء precleaned.
9. تغطية العينة مع غطاء زجاجي جديدة ضمان الانحياز جيدا الزجاج غطاء الشريحة وMicroaqueduct.
10. تجميع غرفة درجة حرارة النمو تسيطر عليها باتباع إرشادات الشركة المصنعة.ويمكن الآن أن تستخدم للتصوير في المجهر (الخطوة 5).

5. التصوير واقتناء أفلام Timelapse

1. بدوره على الليزر والمجهر باتباع إرشادات الشركة المصنعة (مثل الليزر قد تحتاج إلى استعد للساعة 0.5 ~ قبل التجربة).
2. قفل الدائرة تجميعها لإدراج المرحلة على المجهر. تعيين درجة حرارة غرفة النمو وسخان الهدف عند 37 ° C درجة الحرارة أو غيرها من النمو المنشود.
3. إذا التصوير فوق درجة حرارة الغرفة، سيتم التركيز أو هلام وسادة الانحراف عادة بشكل ملحوظ لدقيقة 15 ~ بعد التحول درجة الحرارة الأولية. في الممارسة العملية، استخدم هذا الوقت للعثور على مناطق المصالح وتعديل النصوص التصوير اللازمة لتجربة.
4. العثور على خلايا المجهر وتخزين موقف كل خلية بعد ذلك تركز داخل منطقة محددة مسبقا التصوير والانحياز. ولا يمكن تصوير أكثر من خلية واحدة في كل مرة نافذة الصورة الاستحواذ. لtimelapse التصوير أكثر مأي أجيال، وضمان أن يتم فصل الخلايا في البداية المصورة من الخلايا الأخرى بما لا يقل عن بضع مئات من ميكرومتر حتى أن المستعمرات الأخرى لن تدخل المنطقة خلال التصوير النمو.
5. ضبط كثافة الليزر الإثارة بحيث تقريبا كل photobleach جزيئات الفلورية في غضون 6 التعرض (الشكل 5).
6. باستخدام برنامج نصي التصوير الآلي / مجلة، الحصول على البيانات باستخدام خوارزمية timelapse هو موضح في سير العمل التجريبي في الشكل 3.

Representative Results

وتظهر نتائج نموذجية من تجربة تتبع CoTrAC إنتاج CI قامع λ في أرقام 4 و 5. في هذه التجربة، تم تصوير 12 المستعمرات على فترات 5 دقائق. في كل نقطة زمنية، وautofocused أولا مستعمرة مركزية والتصوير داخل المنطقة. المقبل، وتركز على موقف تخزين / تركيزا وتم الحصول عليها صورة brightfield. وtranslocated ثم المرحلة من 0.5 ميكرومتر ~ على طول محور Z-الانتقال من الطائرة brightfield التنسيق إلى الطائرة التي تفصل بين شطري الخلايا (دون المرحلة التباين أو الفرق المقابل تدخل (DIC) البصريات، يمكن تصوير الأجسام شبه شفافة قليلا في خارج التركيز الطائرات ^8). وأخيرا، تم الحصول عليها ست صور على فترات ثانية 1، ولكل منها التعرض ميللي ثانية 100 (الشكل 5 يظهر نقطة واحدة مثل هذا الوقت). وتكرر هذا لجميع الخلايا في كل نقطة زمنية. لأن تقريبا كل الجزيئات photobleached فينوس في كل timepoint، وfluoresالبقع المائة في أرقام 4 و 5 تتوافق مع الجزيئات التي نضجت فينوس (أصبح الفلورسنت) في 5 دقائق الماضية. جزيئات الزهرة تنضج بسرعة في الجسم الحي مع عمر نصف دقيقة 2-7 ~ ^{1، 2، 7} و الانقسام من Ubp1 فعال جدا ^{4 و 9.} ولذلك، يمكن عدد جزيئات البروتين أنتجت منذ القياس بدقة الاستدلال مشاركة من عدد من الجزيئات فينوس تحسب على الغشاء.

الشكل 1. باستخدام CoTrAC لحساب تعبير عن جزيئات واحد عامل النسخ. (1) ويعبر عن مراسل TSR بما في ذلك تسلسل غشاء توطين وسريعة النضج فينوس YFP، واليوبيكويتين (UB) في الانصهار متعدية مع عامل النسخ من promotإيه ينظمها عامل النسخ. (2) والبروتيني Ubp1 شارك في translationally يشق على ببتيد الوليدة بعد بقايا C-UB المحطة الطرفية. (3) ومراسل TSR-فينوس-UB يموضع لغشاء حيث يمكن الاعتماد عليه في واحد جزيء المستوى. (4) وعامل النسخ يمكن تنظيم التعبير الخاصة بها. طريقة الكرتون.

الشكل 2. توضع العينة في غرفة التخطيطي المستخدمة في التجارب CoTrAC. خلايا بين سادة هلام الاغاروز والزجاج غطاء. وتعقد Microaqueduct الشريحة وموضوعية عند درجة حرارة ثابتة باستخدام وحدة تحكم إلكترونية. تحضير العينة.

الشكل 3. سير العمل لتجربة نموذجية CoTrAC. التجاربالعقلية سير العمل.

الشكل 4. وتظهر البيانات timelapse نموذجية من تجربة CoTrAC. صور من مستعمرة واحدة على فترات 25 دقيقة. في هذه التجربة، تم الحصول على بيانات كل 5 دقائق من 12 مستعمرات مختلفة. (A) الصور Brightfield. (B) صورة فينوس مضان (YFP) (خلفية طرح المتوسط ​​لحساب التغير في مجال التصوير خلفية كامل مع مرور الوقت). (C ) يظهر صورة التراكب توطين قطب من الجزيئات مراسل TSR-فينوس-UB وعدم التجانس في عدد الجزيئات تنتج في 5 دقائق وقت النوافذ في خلايا مختلفة (مقلوب brightfield الصورة والصورة هي فينوس ممر الموجة تصفية). اضغط ساعةيحرث لمشاهدتها بشكل اكبر الرقم.

الشكل 5. نموذجية البيانات من نقطة مرة واحدة في تجربة CoTrAC. (A) فينوس (YFP) الصور مضان. تم الحصول عليها ستة 100 ميللي ثانية التعرض في بداية كل فترة دقيقة الوقت 5. تم فصل كل من التعرض بمقدار 900 ميللي ثانية 6 لإتاحة الوقت للجزيئات الزهرة الداكنة التي تراجعت عابر من أن تصبح الفلورسنت. (B) للتحليل، وطرح صورة 6 من الصورة 1 إلى تصحيح لجزيئات غير مقصورة الخلفية وتألق ذاتي. وقد تمت ترجمة هذه البقع في الصورة لخلية معينة الأنساب وكميا من حدتها مضان متكاملة. (C) ومضان متوسط ​​المتكاملة للمستعمرة في A يتم رسم أكثر من 6 صور (حتىخط الغطاء). تركيب هذا الخط إلى تسوس الأسي بالإضافة إلى تعويض ثابت (خط متقطع) يعطي تسوس نصف الوقت من 1 ثانية. في هذه التجربة، والزهرة جزيئات photobleach بسرعة أكبر بكثير من تألق ذاتي الخلوية، لذلك هذا يعني أن photobleached ما يقرب من نصف العدد الإجمالي للجزيئات فينوس في كل إطار. Photobleaching التقدم في نقطة زمنية واحدة.

Discussion

يمكن للطريقة CoTrAC يمكن تعميمها لقياس إنتاج بروتينات أخرى حيث N-C-التقليدية أو محطة اندماج بروتين فلوري قد وقف نشاط البروتين. استراتيجية CoTrAC ثلاثة مزايا فريدة على الطرق الحالية. الأولى، وشارك في متعدية الانصهار يضمن أن يتم إنتاج جزيء واحد لمراسل الفلورسنت لكل جزيء من البروتين من الفائدة، مما يسمح عد دقيق لإنتاج البروتين في الوقت الحقيقي. ثانيا، مراسل غشاء استهداف TSR-فينوس تمكين الكشف عن جزيء واحد من الصحفيين الفلورسنت، مما يتيح الكشف عن البروتينات التي أعرب عنها في مستويات منخفضة جدا. الثالث والأهم من ذلك، شارك في الانقسام متعدية لمراسل الفلورسنت يسمح للبروتين من الفائدة على الحفاظ على شبه البرية من نوع تسلسل وظيفة التي تستخدم عادة اليوبيكويتين كتسلسل البروتيني الاعتراف في E. القولونية والبروتينات المستهدفة تختلف فقط من سلاسل الببتيد بهم من النوع البري في أن N-N أول محطة </ م يتم تغيير>-فورميل ميثيونين لميثيونين.

عند استخدام الأسلوب CoTrAC، ومن المهم أن نأخذ في الاعتبار أن طريقة CoTrAC يقيس عدد جزيئات البروتين المنتجة في كل نافذة الوقت 5-دقيقة، والذي يختلف من قياس عدد جزيئات البروتين موجودة في كل خلية (أي البروتين التركيز). معظم حيدة الخلية التعبير الجيني مضان فحوصات قياس تركيز البروتين، والذي هو نتيجة متوازنة من البروتين وتدهور الإنتاج. ولذلك، لا بد من النظر في معدل التدهور من البروتين من الفائدة بعناية إذا تم استخدام قياس تركيز البروتين لاستنتاج المعلومات الإنتاج. وعلاوة على ذلك، وتركيز البروتين يخضع لتقلبات الناجمة عن تقسيم من البروتين بين الخلايا الوليدة اثنين في انقسام الخلايا، والتي قد تكون كبيرة لمحدودي التعبير على مستوى البروتينات وتفسيرها عن طريق الخطأ على أنها ناتجة من ديناميات إنتاج البروتين. يمكن أن تكون طريقة CoTrAC موديfied لقياس تركيز البروتين من خلال عدم photobleaching جزيئات مراسل المنتجة حديثا، ولكن يجب أن يتم ذلك مع تدقيق إضافي. يجب على المرء أن تحقق من أن معدلات تدهور مراسل الفلورسنت والبروتين من الفائدة متشابهة، والتي يتم تقسيم كل من هم بالمثل في الخلايا ابنة في الثانية على انقسام الخلايا، حتى يتسنى للتركيز لمراسل الفلورسنت التي تعكس من البروتين من الفائدة.

نلاحظ أنه في حين أن CoTrAC لا يغير تسلسل البروتين، إضافة الجين مراسل تغيير تسلسل مرنا. قد يكون ذلك، النسخ والترجمة ديناميكية و / أو معدلات تدهور مرنا نص مضطرب. إذا تم استخدام أسلوب CoTrAC لمراقبة إنتاج البروتين في سياق من النوع البري، من المهم للمقارنة بين مستويات التعبير من البروتين المستهدف سواء في تسلسل من النوع البري والانصهار مع CoTrAC علامة فلوري (على سبيل المثال في المرجع .. 1 قارنا CI التعبير في الإنشاءات CoTrAC لدينار إلى أنه في مستذيب من النوع البري). نناقش أدناه الاعتبارات اللازمة لتعميم أسلوب CoTrAC.

أولا، نحن مناقشة إمكانية استخدام تسلسل غير TSR-فينوس-UB. المتطلبات العامة هي: (1) يجب أن تكون مترجمة لمراسل لبعض الموقف داخل الخلية بحيث لا منتشر بسرعة (مع TSR للصحفيين هي في القطبين الخلية ^1). هذا ضروري لواحدة جزيء الكشف عن جزيء بروتين فلوري والإشارة من جزيء بروتين فلوري نشرها بسرعة وعادة ما لا يكون للكشف أعلاه خلفية الخلية autofluorescent، (2)، وبروتين فلوري يجب أن يكون مشرقا بما فيه الكفاية ليتم الكشف عن على واحدة جزيء المستوى ويجب أن تنضج (تصبح الفلورسنت) بسرعة كافية لتطبيق المطلوب (فينوس هو البروتين أسرع تستحق الفلورسنت حتى الآن ^7)، (3)، ويجب أن photobleached البروتين الفلوري بعد الكشف بحيث البروتينات الفلورية يمكن أن يكون حديثا ديtected في نقاط وقت لاحق (البروتينات الفلورية التي تقاوم بشكل مفرط لphotobleaching غير مرغوب فيها والتعرض ليزر المفرط يمكن أن يسبب التحف الضيائية)، (4)، وتسلسل الاعتراف البروتيني لا يمكن مغادرة أي الأحماض المتبقية الأمينية على البروتين من الفائدة التي سوف التشويش وظائفه (Ubp1 يشق مباشرة بعد بقايا UB-كربوكسي محطة، دون ترك أي مخلفات إضافية على الإطلاق).

الثاني، لا بد من التحقق من أن يتم التعبير بشكل صحيح ومراسل المشقوق. يجب فصل الانقسام بروتين مراسل من البروتين من الفائدة تكون فعالة، ويمكن قياس الكفاءة باستخدام البقع الغربية الانقسام ضد مراسل والبروتين من الفائدة أو كليهما، JL (الأجسام المضادة متاحة تجاريا للكثير من البروتينات الفلورية مثل الأجسام المضادة لمكافحة GFP 8 من Clontech، الذي يربط فينوس في طخة غربية). ينبغي للمرء التأكد من أن يتم الكشف عن أي البروتين الانصهار في uncleaved البقع ضد لست] من الخلايا معربا عن الانصهارالبروتين عند مستويات أعلى من تلك المتوقعة في التجارب CoTrAC. أيضا، يجب أن يكون أنتجت مراسل والبروتين من الفائدة عند نسبة 1:1 بعد الانقسام. يمكن التحقق من ذلك عن طريق قياس شدة الفرق المشقوق في مكافحة مراسل والمضادة للبروتين في المصالح البقع الغربية تطبيع من قبل عصابات من شدة uncleaved في سلالات تفتقر البروتيني. إذا مراسل والبروتين من الفائدة موجودة في نسبة 1:1 بعد الانقسام، ثم:

نلاحظ أنه منذ الغربية البقع قياس تركيز البروتين، ونسبة الناتج سوف تنحرف من 1:1 مراسل وإذا كان البروتين من الفائدة تظهر معدلات التحلل مختلفة بعد الانقسام.

الثالثة، ينبغي للمرء أن تحقق من أن يسلك البروتين في المصالح وظائفه المتوقعة بعد الانقسام. وجود لمراسل بناء الانصهار الكبيرة و / أو الترجمة إلى غشاء الخلية من المتوقع أن تعطيل أهم العوامل النسخ (وكان كاظمة λ CI المشتركغير نشط mpletely دون Ubp1 التعبير في تجاربنا ^1). يجب تحويل البلازميد البروتيني، معربا عن تفعيل بروتين من الفائدة بمقدار البروتين تحريرها من علامة الانصهار متعدية الضخمة. هذه الظاهرة يؤدي إلى تطبيقات أخرى CoTrAC ممكن. وقد استخدم الانقسام في محطة للكربوكسي UB من Ubp1 لفضح غير قانوني الأمينية الأحماض الأمينية محطة لتوضيح البكتيرية N-نهاية حكم تدهور البروتين ^9. إذا الانصهار لمراسل كبيرة الأغشية المرتبطة بها، يثبط نشاط عامل النسخ (أو البروتين الأخرى مثل إنزيم)، يمكن أن تسترد نشاطها بسرعة عن طريق التعبير البروتيني حمل. ويمكن استخدام CoTrAC لغاية بسرعة "تشغيل" مجموعة من عوامل النسخ الموجودة مسبقا عن طريق إزالة / إضافة مثبط / شارك في المنشط أو الشروع في ذلك التعبير البروتيني أو النشاط. وأخيرا، قد التعبير لمراسل الفلورسنت التشويش خلية علم وظائف الأعضاء، وينبغي التأكد من أن خصائص مثل خليةدورة الزمن تتأثر؛ في التجربة الموضحة في المرجع. 1، استخدمنا البروتين TSR كتسلسل غشاء توطين بسبب TSR بالفعل بروتين الغشاء أعرب للغاية وزيادة طفيفة في التعبير TSR من غير المتوقع أن تؤثر على سلوك الخلية.

الرابع، عند استخدام تسلسل مراسل غير ناقش تحديدا TSR-فينوس-UB، ينبغي أيضا البروتوكول التصوير المطابق تعديلها حسب الحاجة. على سبيل المثال، سوف البروتينات الفلورية مختلفة تتطلب بروتوكولات الإضاءة المختلفة لتحقيق توازن جيد بين الكشف عن جزيئات البروتين بكفاءة الفلورسنت، والضيائية من التعرض الليزر وphotobleaching. ومن الناحية المثالية، ينبغي أن تكون الإثارة الليزر في ذروة الامتصاص للبروتين فلوري في المختارة؛ الذروة الإثارة يتطلب شدة الإثارة أعلى (وبالتالي ارتفاع الضيائية والخلفية تألق ذاتي) لتحقيق نفس الانبعاثات بروتين فلوري وخصائص photobleaching. أيضا،يمكن تعديل التردد التصوير ليكون أبطأ أو أسرع من 5 دقائق اعتمادا على التسامح من الخلايا إلى الضيائية من التعرض الليزر. في تجاربنا، 12 E. منفصلة تم تصوير كل المستعمرات القولونية 5 دقائق ومتابعتهم لمدة 7-8 قبل خلية دورات مراقبة عيوب كبيرة الضيائية ^1.

أخيرا، وبعد مرور الزمن أفلام من إنتاج بروتين يتم الحصول في التجربة CoTrAC (أمثلة تبين في أرقام 4 و 5)، فلوري التعبير البروتين يحتاج إلى كمية عن طريق الكشف عن البقع الفلورية المقابلة لواحد أو أكثر الجزيئات، وتكليف لجزيئات الخلايا الفردية و تتبع الأنساب الخلية. وقد وصفت ونحن روتين مخصصة لدراسة مطلب λ الإنتاج CI كاظمة ^1. لفترة وجيزة، يجب على المرء أولا تحديد الخطوط العريضة للخلايا فردية والنقاط الزمنية المقابلة لانقسام الخلايا في الصور brightfield في حين تتبع الأنساب الخلية من خلال إطار الصورة اللاحقةق. وجدنا أن الوقت 5 دقائق الفاصلة كانت قصيرة بما فيه الكفاية أن خلية في إطار واحد يقابل عادة إلى الخلية في الإطار السابق الذي تقاسم مع أكثر بكسل في صورة مجزأة. في الحالات التي لوحظت تحولات كبيرة في بعض الأحيان من المستعمرات بين إطارين لاحقة، كان مطلوبا من الاحالة دليل على الخلايا الفردية الأنساب. المقبل، ويحتاج المرء لتحديد المواقع وقياس الفلورسنت حدتها. وجدنا أن يمكن تحديد البقع الفلورية من (1) ممر الموجة تصفية الصورة مضان لإزالة التردد المنخفض خلفية مضان (على سبيل المثال تألق ذاتي) وضوضاء عالية التردد، (2) العتبة الصورة يعتمد على كثافة مضان و (3) تحديد الأجسام أكبر من بضع بكسل في الصورة thresholded. وتناسب الكائنات في الصورة thresholded إلى وظيفة جاوس 2-الأبعاد بالإضافة إلى خلفية ثابتة، ونقل كثافة متكاملة من بقعة بوصفها نتاجا لاتساع ائقا والتباين.في تجاربنا، TSR-متعددة فينوس-UB للصحفيين في كثير من الأحيان مترجمة شارك في القطبين في الخلية، وخلق بؤر التي كانت أكثر إشراقا من تلك التي من جزيئات TSR-فينوس واحد. تم تحديد عدد من الجزيئات داخل فينوس بقعة واحدة بقسمة كثافة متكاملة من بقعة من كثافة مضان من جزيء واحد فينوس، الذي كميا باستخدام منخفضة المستوى سلالة التعبير التي تحتوي على بقع نادرا أكثر من بروتين فلوري جزيء. ويمكن قياس هذا تكميل مع القياسات في المختبر من الجزيئات واحدة بروتين فلوري انضمت إلى شريحة زجاجية. لقد وجدنا أن البروتين الفلوري خصائص متشابهة إلى حد كبير في الجسم الحي في المختبر وفي النظم مع ظروف مماثلة عازلة.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Agarose (Low melting temperature)	Lonza	50100
Milli-Q H2O
5×M9 salts			Following recipe described in 9
20% glucose
MgSO4
CaCl2
50×MEM amino acid solution	Invitrogen	11130-051
Temperature-Controlled Growth Chamber Stage adaptor	Bioptechs	FCS-2
Objective Heater	Bioptechs	Model depends on microscope objective
Microaqueduct Slide	Bioptechs	130119-5
Micro cover glasses	VWR	40CIR-1	Can be difficult to source; also available from Bioptechs
Cover glass/slide gasket	Bioptechs	FCS2 0.75 mm
Fluorescence Microscope	Various	Example setup: Coherent Innova 308C Argon-ion laser, Olympus IX-81 microscope, Olympus PlanApo 100X NA 1.45 objective, Metamorph software	Must have laser excitation, automated xyz stage, automation software capable of scripted imaging and autofocus, optics capable of resolving single fluorescent proteins
EM-CCD Camera	Various	Example setup: Andor Ixon DU-898	Must have sufficiently low noise to detect single fluorescent proteins above background