Summary
我们描述的荧光显微镜法,共翻译激活由裂解(CoTrAC),对图像的生产与单分子的精确度不扰动的蛋白质的功能的情况下,在活细胞中的蛋白质分子。此方法已被用于按照随机表达动力学的一种转录因子,λ阻遏CI
Abstract
我们描述的荧光显微镜法,共翻译激活由裂解(CoTrAC)图像与单分子的精确度不扰动的蛋白质的功能的情况下,在活细胞中的蛋白质分子的生产。此方法使得能够顺序,五分钟的时间窗期间在一个小区中产生的蛋白质分子的数目进行计数。它需要一个与激光激发功率密度为约0.5至1千瓦/厘米2,这是足够敏感的检测单一的荧光蛋白在活细胞中的分子的荧光显微镜。在此方法中所使用的荧光报道,由三部分组成:膜击靶序列,一个快速成熟的,黄色荧光蛋白和蛋白酶识别序列。记者感兴趣的蛋白质的N-末端的翻译融合。细胞生长在一个温度控制的显微镜载物台上。每五分钟后,细胞内的荧光分子成像(以及后来的合作unted通过分析荧光图像),并随后photobleached让只有新翻译的蛋白质在接下来的测量计数。
,此方法产生的荧光图像,可以通过检测在每个图像中,将它们分配到单个细胞的荧光斑点,然后分配的细胞谱系的细胞进行分析。的数目计算出一个时间窗口内的一个给定的细胞产生的蛋白质的是,集成的斑点的荧光强度除以由单个荧光分子的平均强度。我们用这种方法测量的0-45的分子在单5分钟时间窗的范围中的表达水平。这种方法使我们能够测量噪声的λ阻遏CI的表达,并在系统生物学中有许多其他潜在的应用。
Protocol
1。应变工程工作流程
- 插入序列编码(一)的膜定位序列,(b)一种快速成熟的荧光蛋白和(c)的蛋白酶识别序列的N-末端和在帧与感兴趣的蛋白质( 例如,一个转录因子)。我们采用针对性的TSR-金星记者2膜,并融合到的蛋白酶识别序列的泛素(Ub)表达λ噬菌体阻遏CI蛋白质分子的数量进行计数。我们如何构建的融合蛋白TSR-金星-泛素CI,CI编码区取代了野生型和将构建到E.详细信息大肠杆菌染色体λRed重组3,详细描述在文献。 1。
- 确认所有修改测序。
- 变换特定于上面使用到的菌株表达的荧光报道和兴趣蛋白质的识别序列的质粒编码的蛋白酶在翻译融合。我们使用的的蛋白酶Ubp1,立即裂解后的C-末端泛素残基4。
2。培养细胞和制备样品
- 选择一个E.大肠杆菌菌落兴趣的新鲜条琼脂平板上为1毫升的M9媒体5辅以,与1X MEM氨基酸和适当的抗生素。在所需温度下在摇床上孵育足够长,达到OD 600> 1.0(在600nm处的光密度)。
- 稀释为1毫升新鲜的M9培养基中的文化与适当的抗生素OD 600 = 0.02。在适当的温度下,在振动机中孵育。如果需要的话,可以提高低温生长的初始细胞密度。
- 当OD 600 = 0.2-0.3(在37℃下的初始细胞培养在OD 600 = 0.02,这将需要3-4小时),开始制备琼脂糖凝胶垫(步骤3)。
- 该细胞是准备用于成像当OD
- 转移至1.5 ml离心管中,离心分离机在台式的离心10000×g离心1分钟1毫升孵育文化。
- 弃上清,加入1毫升新鲜的M9培养基中,并轻轻悬浮颗粒。
- 以10,000 xg离心1分钟。
- 重复步骤1.6和1.7。弃上清。
- 轻轻重悬在1毫升M9培养基。细胞可直接用于显微镜成像或稀释的10 - 100倍,以确保低细胞密度为间隔拍摄成像。请注意,低细胞密度是重要的用于扩展“延时成像。的摄像室(步骤4)在实验过程中被密封。由于指数生长的细胞中,高的初始细胞浓度可以显著耗尽室内的氧气后长时间生长在凝胶垫,减少荧光蛋白的成熟,并影响细胞的生长。
3。准备的琼脂糖解
- 称取10〜20毫克低熔点温度琼脂糖成1.5毫升微量离心管中。
- 添加适当的音量M9基本培养基,无抗生素,3%的琼脂糖溶液。
- 琼脂糖溶液加热30分钟,在70℃以熔化,反相的管,以确保该溶液是完全熔化和均匀。凝胶垫可倾在这一点上(步骤4)中,或可以将温度降低至50℃,并保持几个小时以供以后使用。
4。准备在会议厅凝胶垫
- 约50分钟在成像之前,漂洗Microaqueduct的的幻灯片水。
- 含漱1清洗玻璃盖(使用严格的清洗方法所描述的,如在6),并通过用压缩空气吹Microaqueduct用无菌水和干滑动。
- 放置的橡胶垫圈,以便它涵盖上Microaqueduct幻灯片的滑动的Microaqueduct(玻璃侧的入口和出口上,这可以应用在修改通过媒体灌注样品)。应用50μl琼脂糖溶液(步骤3)的中心的Microaqueduct幻灯片。
- 顶部的琼脂糖溶液清洁,干燥的玻璃盖。
- 让琼脂糖溶液在室温下放置30分钟。
- 同时,制备细胞样品(步骤2)。
- 小心地剥离从凝胶垫的顶部的盖玻璃。加入1.0微升的洗涤过的细胞培养物的凝胶垫的顶部。等待〜2分钟,被吸收的凝胶垫的文化。重要的是不要等了这么久,的凝胶垫overdries,但足够长的细胞被正确地坚持以硅胶垫。理想的等待时间会随温度和湿度。
- 在等待过程中,干其他预清洗玻璃盖。
- 量的样品,用新的玻璃盖,确保的盖玻璃和Microaqueduct的滑动以及对齐。
- 组装的温度控制的生长室中,按照生产商的说明。现在它可以被用于显微镜(步骤5)的成像。
5。间隔拍摄电影的成像和收购
- 打开后,制造商的说明( 例如,激光可能需要加热的〜0.5小时,在实验前)上的激光和显微镜。
- 锁定组装室,舞台上插入的显微镜。生长室的温度设置在37℃下或其他所需的生长温度和物镜加热器。
- 如果在室温以上的成像,焦点或凝胶垫通常会漂移显著〜15分钟后,初始温度换档。在实践中,利用这段时间找到地区的利益和修改成像脚本,作为必要的实验。
- 查找在显微镜上的细胞,并使其居中一个预定义的和对准的摄像区域内存储的位置后,每一个电池单体。多于一个小区可以被成像在每个图像中采集时间窗口。为间隔拍摄成像以上米任何世代,确保成像的细胞最初来自其他细胞分离由至少几百μm,以便其他菌落在生长过程中,将不进入摄像区域。
- 调整激光激发强度,因此,几乎所有的荧光分子光漂白剂在6曝光( 图5)。
- 使用自动成像脚本/日记,获得延时“的数据,使用在图3中的工作流程中的实验中描述的算法。
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Representative Results
从CoTrAC跟踪生产的λ阻遏CI实验的典型结果示于图4和图5。在这个实验中,12个菌落成像以5分钟的间隔。在每个时间点,菌落第一自动对焦和集中的摄像区域内。接下来,中心/中心的位置,存储和一个亮场图像被收购。然后阶段易位〜0.5微米,从明场焦平面沿z轴移动的平面等分的细胞(无相位对比或微分干涉相差(DIC)的光学,半透明的对象可以被成像在稍外的聚焦平面8)。最后,六个具有100毫秒的曝光( 图5示出了一个这样的时间点)在1秒的时间间隔,每个图像获得。这是在每个时间点的所有细胞重复。因为几乎所有的的金星分子photobleached在每个时间点,荧光%的点在图4和图5对应到到期(成为此荧光)在过去的5分钟之内的金星分子。金星分子在体内的半衰期由Ubp1〜2-7分钟1,2,7和卵裂迅速成熟是非常有效的4,9。因此,自上次测量产生的蛋白质分子的数目可以被准确地推断出金星分子的数目在膜上计数。
图1。使用CoTrAC(1)计算单个转录因子分子的表达。有记者表示,包括膜定位序列TSR,快速成熟的YFP金星,以及泛素(Ub)与转录因子的翻译融合从promot呃由转录因子调节,(2)蛋白酶Ubp1合作平移切割后的新生多肽的C-末端的泛素残基(3)TSR-金星-泛素记者定位到膜上,在这里它可以在单一的计数分子水平上。(4)转录因子能调节自己的表达。方法卡通片。
图2。示意图CoTrAC实验所用的样品室。细胞置于琼脂糖凝胶垫和玻璃盖之间。 Microaqueduct的幻灯片和目标被保持在一个固定的温度下使用的电子控制器。样品制备。
图3。工作流程一个典型的CoTrAC实验。实验精神的工作流程。
图4。在25分钟的时间间隔的典型的的时光倒流数据从CoTrAC实验。从一个单一的殖民地的图像显示。在这个实验中,获得的数据每5分钟从12个不同的殖民地。(A)(B)明场图像。金星(YFP)的荧光图像(减去平均背景变化随着时间的推移,整个成像领域的背景)。(C )覆盖的图像显示了极本土化的TSR-金星的泛记者分子和非均质性分子的数量在5分钟的时间窗口,在不同的细胞(亮场图像反转和维纳斯图像带通滤波)。 点击Ĥ趁着查看大图。
图5。典型的数据从一个单一的时间点在CoTrAC实验。(A)金星(YFP)的荧光图像。六个100毫秒曝光获得在每5分钟的时间间隔的开始。 6曝光分离900毫秒,以便有时间短暂的黑暗金星分子眨了眨眼,成为荧光。(B)有关人士分析,图像6图像1减去纠正未漂白分子和荧光背景。在此图像中的斑点定位到特定的细胞系,并通过其集成的荧光强度定量。(C)的平均综合荧光的殖民地,在一个超过6绘制图像(所以盖线)。这条线拟合一个指数衰减,加上一个常数偏移量(虚线)给半衰减时间为1秒。在这个实验中,金星分子光漂白剂更快速地比细胞自体荧光,所以这意味着在每帧中,大约有一半的金星分子总数photobleached。在一个单一的时间点的漂白进步。
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Discussion
CoTrAC方法可以推广到测量生产的常规的N-或C-末端的荧光蛋白融合的其它蛋白质,可能会破坏蛋白质的活性。 CoTrAC战略有三个独特的优势,目前的方法。首先,合作翻译融合确保为每个感兴趣的蛋白质分子的,一个分子中的荧光报道产生,允许实时蛋白质生产的准确计数。其次,膜 - 定位记者TSR-金星使荧光记者的单分子检测,从而能够检测在非常低的水平表达的蛋白质。第三和最重要的是,中的荧光报道的共同平移裂解允许感兴趣的蛋白质保留其接近野生型序列和功能通常使用泛素作为蛋白酶的识别序列在大肠杆菌大肠杆菌 ,靶蛋白的唯一区别在于,第一N 端子 N从它们的野生型肽序列</ em>的-甲酰基-甲硫氨酸被改变为蛋氨酸。
当使用CoTrAC方法,重要的是要记住的CoTrAC方法测量产生的蛋白质分子的数目在每5分钟的时间窗口,这是不同于测量每个细胞的存在的蛋白质分子的数目( 即蛋白浓度)。单细胞荧光的大部分基因表达测定蛋白质浓度,这是蛋白质的生产和退化的平衡结果。因此,感兴趣的蛋白质的降解率,必须仔细考虑的浓度测量,如果被用来推断蛋白质的生产信息。此外,蛋白质浓度的波动所造成的蛋白质之间的两个子细胞在细胞分裂,这可能是显着为级低表达的蛋白质,并错误地解释为所产生的蛋白质的生产动态分区是受。 CoTrAC方法可修改田间测量蛋白浓度不漂白新记者分子,但必须做额外的审查。必须确认的荧光报道和感兴趣的蛋白质的降解率是类似的,它们都类似的细胞分裂成两个子细胞时分配,使感兴趣的蛋白质的荧光报告基团的浓度反映。
我们注意到,而CoTrAC不改变蛋白质序列,另外的报告基因的mRNA序列改变。因此,转录和翻译的动态和/或mRNA转录的降解率可能会感到不安。 ,如果CoTrAC方法是用来观察在野生型背景下的蛋白质的生产,它是重要的目标蛋白的表达水平进行比较,无论是在其野生型序列和与CoTrAC荧光融合标记( 例如,在文献1中,我们比较CI表达我们CoTrAC建筑业吨中的野生型的溶素原)。下面我们讨论考虑必要的归纳CoTrAC方法的。
首先,我们讨论了的使用序列以外TSR-金星UB的可能性。总的要求是:(1)记者必须在细胞内的定位到某个位置,因此它不会快速扩散(TSR,记者在细胞两极1)。这是必要的单分子检测一个荧光蛋白分子作为一个快速扩散荧光蛋白分子的信号将通常不被检测细胞的自身荧光背景以上;(2),的荧光蛋白质必须是足够亮以被检测到的上单分子水平上,并且必须成熟(成为荧光灯)足够快的速度为所需的应用程序(金星是最快的成熟的荧光蛋白日期7),(3)中,荧光蛋白,必须photobleached检测后,使新的荧光蛋白质可以去tected在随后的时间点(不希望过度的激光曝光的荧光蛋白质,过于抗光漂白可能会导致光毒性工件),(4),的蛋白酶识别序列不能留下任何残留的氨基酸对感兴趣的蛋白质,将扰动其功能(Ubp1切割后立即泛素残基的羧基末端,不留下任何额外的残基在所有)。
第二,必须验证正确表达和切割记者。分离记者从感兴趣的蛋白质的蛋白水解分裂位必须是有效的切割效率的测量可以使用Western印迹对记者,感兴趣的蛋白或两者(抗体是市售的许多荧光蛋白如抗GFP抗体JL-自Clontech公司,它结合金星在Western blot检测)。应确保没有未裂解的融合蛋白质印迹对表达融合的细胞裂解物的被检测蛋白质在更高的,高于预计在CoTrAC实验的层次。此外,记者和兴趣蛋白质的必须产生裂解后按1:1的比例。这可以通过测量反记者和抗蛋白质的利益的强度归一化的未裂解的带的缺乏蛋白酶的菌株的Western印迹中的解理的频带的强度检查。如果记者和兴趣蛋白质的裂解后按1:1的比例存在的,则:
请注意,由于Western印迹测量蛋白质浓度,所得到的比率会偏离从1:1,如果记者和感兴趣的蛋白质裂解后表现出不同的降解率。
第三,应验证蛋白的切割后表现出其预期的功能。的存在下的大记者构建到细胞膜的融合和/或本地化预期灭活大多数转录因子(λ阻遏CI为共同mpletely没有Ubp1表达在我们的实验1)处于非活动状态。蛋白酶表达质粒的转化激活蛋白的从庞大的翻译融合标签中解放出来的蛋白质。这种现象产生其他可能CoTrAC应用。已被用于在泛素羧基末端通过Ubp1的裂解,以露出非规范的氨基末端氨基酸澄清第9蛋白质降解细菌的N-端规则。如果融合到一个大的,膜相关的记者灭活一种转录因子(如酶或其它蛋白质),可以迅速恢复其活性通过诱导蛋白酶的表达。 CoTrAC可用于非常迅速地“打开”通过删除/添加的抑制剂/共活化剂,或以其他方式发起蛋白酶的表达或活性的转录因子的一个预先存在的池。最后,表达的荧光报道可能扰乱细胞的生理和应确保的属性如细胞周期时间不受影响;文献所描述的实验。 1,我们使用了TSR TSR蛋白的膜定位序列,因为已经是一个高表达的膜蛋白和TSR表达小幅增加,预计不会影响细胞的行为。
第四,当记者使用序列以外的具体讨论的TSR-金星-泛素,相应的成像协议应也可以根据需要进行修改。例如,不同的荧光蛋白将要求不同的照明协议,以实现有效地检测从激光曝光的荧光蛋白质分子,光毒性和光漂白之间的良好平衡。在理想的情况下,激光激发应该是在所选择的荧光蛋白的吸光度峰;非高峰激发需要更高的激励强度(和因此更高的光毒性和自发荧光背景)来达到同样的荧光蛋白的发射和光漂白特性。另外,成像频率可以被修改,以慢于或快于5分钟,这取决于细胞的耐受性的激光曝光的光毒性。在我们的实验中,12个独立的E.大肠杆菌菌落成像,每隔5分钟,其次为7-8细胞周期观察大量的光毒性缺陷1。
最后,时间推移电影后的蛋白质生产中获得在CoTrAC实验( 图4和图5所示的例子中),荧光蛋白的表达,需要通过检测对应于一个或多个分子的荧光点,分配到单个细胞的分子,并进行量化跟踪的细胞系。我们已经描述了一个自定义的Matlab例程,,研究λ阻遏CI生产1。简单地说,一个人必须首先确定单个细胞和亮场图像中的细胞分裂的时间点对应的轮廓,而通过后续的图像帧跟踪的细胞系第我们发现,在5分钟的时间间隔是足够短的,通常在一帧中的小区前一帧中与它共享大多数在一个分段的图像的像素相对应的单元格。在两个连续帧之间的菌落偶尔的大转变的情况下,观察他们的宗族,手动分配的单个细胞是必要的。接着,一个需要,以确定荧光斑点和量化它们的强度。我们发现,荧光斑点可确定的(1)带通滤波以除去低频荧光背景的荧光图像( 例如,自体荧光)和高频噪声,(2)基于荧光强度的阈值的图像和(3)识别物体大于一个阈值图像中的像素。适合的阈值处理的图像中的对象到一个2维高斯函数加上一个恒定的背景,并当场作为拟合的振幅和方差的产物的积分强度。在我们的实验中,多个TSR-的金星UB记者经常共同定位于细胞两极,点比那些从单TSR金星分子的,美好的。金星分子内一个点的数量进行定量的光斑的积分强度除以由一个单一金星分子的荧光强度,通过使用低表达水平的菌株,其中点很少包含一个以上的荧光蛋白进行定量分子。这种测量可以进一步补充附着在载玻片上的单一的荧光蛋白分子在体外测量。我们已经发现,荧光蛋白的性能在很大程度上相似, 在体内和体外系统相似的缓冲液条件。
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Disclosures
我们有没有公开。
Acknowledgments
的的质粒pCG001表达Ubp1好心提供的罗汉贝克在约翰·科廷学校的医学研究。这项工作是由of Dimes的研究资助,2011财年3月,3月Dimes的瓦西里·奥康纳入门学术研究奖#5-FY20和美国国家科学基金会职业奖0746796。
Materials
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Agarose (Low melting temperature) | Lonza | 50100 | |
Milli-Q H2O | |||
5×M9 salts | Following recipe described in 9 | ||
20% glucose | |||
MgSO4 | |||
CaCl2 | |||
50×MEM amino acid solution | Invitrogen | 11130-051 | |
Temperature-Controlled Growth Chamber Stage adaptor |
Bioptechs | FCS-2 | |
Objective Heater | Bioptechs | Model depends on microscope objective | |
Microaqueduct Slide | Bioptechs | 130119-5 | |
Micro cover glasses | VWR | 40CIR-1 | Can be difficult to source; also available from Bioptechs |
Cover glass/slide gasket | Bioptechs | FCS2 0.75 mm | |
Fluorescence Microscope | Various | Example setup: Coherent Innova 308C Argon-ion laser, Olympus IX-81 microscope, Olympus PlanApo 100X NA 1.45 objective, Metamorph software | Must have laser excitation, automated xyz stage, automation software capable of scripted imaging and autofocus, optics capable of resolving single fluorescent proteins |
EM-CCD Camera | Various | Example setup: Andor Ixon DU-898 | Must have sufficiently low noise to detect single fluorescent proteins above background |
References
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