Summary
Vi beskriver en fluorescensmikroskopi fremgangsmåde, cotranslationel aktivering ved spaltning (CoTrAC), til billede produktionen af proteinmolekyler i levende celler med enkelt-molekyle præcision uden at forskubbe proteinets funktionalitet. Denne fremgangsmåde er blevet anvendt til at følge de stokastiske udtrykket dynamik en transkriptionsfaktor, at λ repressor CI
Abstract
Vi beskriver en fluorescensmikroskopi fremgangsmåde, cotranslationel aktivering ved spaltning (CoTrAC) til billede produktionen af proteinmolekyler i levende celler med enkelt-molekyle præcision uden at forskubbe proteinets funktionalitet. Denne metode gør det muligt at tælle antallet af proteinmolekyler produceret i én celle i sekventielle, fem minutter tidsvinduer. Det kræver et fluorescensmikroskop med laserexcitation effekttæthed på ~ 0,5 til 1 kW / cm 2, som er tilstrækkelig følsom til at påvise enkelte fluorescerende protein-molekyler i levende celler. Det fluorescerende reporter, der anvendes i denne fremgangsmåde består af tre dele: en membran targeting sekvens, en fast-modning, gult fluorescerende protein og en protease-genkendelsessekvens. Reporteren er translationelt fusioneret til N-terminalen af et protein af interesse. Celler dyrkes på en temperaturstyret objektbordet. Hvert femte minut, er fluorescerende molekyler i celler afbildes (og senere counted ved at analysere fluorescensbilleder) og efterfølgende Lysblegede således at kun nyligt translaterede proteiner tælles i den næste måling.
Fluorescensbilleder som følge af denne fremgangsmåde kan analyseres ved at detektere fluorescerende pletter i hvert billede, tildele dem til individuelle celler og derefter tildele celler til cellelinier. Antallet af proteiner i et tidsvindue i en given celle beregnes ved at dividere den integrerede fluorescensintensitet af pletter med den gennemsnitlige intensitet af enkelte fluorescerende molekyler. Vi anvendte denne fremgangsmåde til at måle ekspressionsniveauer i området fra 0 til 45 molekyler i enkelt-5 min tidsvinduer. Denne fremgangsmåde gjorde det muligt at måle støjen i ekspressionen af λ-repressoren CI, og har mange andre potentielle anvendelser i systemer biologi.
Protocol
1. Stamme Engineering Workflow
- Indsæt sekvenser der koder for (a) et membran-lokaliseringssekvens, (b) en hurtigt modning fluorescerende protein og (c) en proteasegenkendelsessekvens N-terminalt for og i ramme med et protein af interesse (fx en transkriptionsfaktor). Vi anvendte membranen målrettet TSR-Venus reporter 2 og fusioneres den til proteasegenkendelsessekvens Ubiquitin (Ub) til at tælle antallet af udtrykte bakteriofag λ repressor CI proteinmolekyler. Detaljer om, hvordan vi konstrueret fusionsproteinet TSR-Venus-Ub-CI, erstatter vildtype-CI kodende region og inkorporerer konstruktionen i E. coli kromosomet ved hjælp af λ Red rekombination 3, er beskrevet i detaljer i ref. 1.
- Bekræft alle ændringer ved sekventering.
- Transformere et plasmid, der koder for en protease specifik for genkendelsessekvensen anvendt ovenfor i en stamme der udtrykker det fluorescerende reporter, og proteinet af interessei translationsfusion. Vi bruges protease UBP1, som spalter umiddelbart efter den C-terminale Ubiquitin rest 4.
2. Kultur Celler og forberede Sample
- Vælg en E. coli koloni af interesse fra en frisk stribede agarplade i 1 ml M9 minimal media 5 suppleret med 1X MEM aminosyrer og passende antibiotika. Inkuber i et rysteapparat ved den ønskede temperatur kan nå OD600> 1.0 (optisk tæthed ved 600 nm).
- Fortynd kultur i 1 ml frisk M9 medium med passende antibiotika til OD600 = 0,02. Inkuber i et rysteapparat ved passende temperatur. Initial cellulære tæthed kan øges efter behov for lavtemperatur-vækst.
- Når OD600 = 0,2 til 0,3 (ved 37 ° C med en første cellekultur ved OD600 = 0,02, vil dette tage 3-4 timer), begynder at forberede agarosegel puden (trin 3).
- Cellerne er klar til billeddannelse, når OD
- Overføres 1 ml inkuberet kultur i et 1,5 ml mikrocentrifugerør, centrifugeres ved 10.000 x g i 1 min i en benchtop mikrocentrifuge.
- Supernatanten fjernes, og der tilsættes 1 ml frisk M9 medium, og pellet resuspenderes forsigtigt.
- Centrifuger ved 10.000 x g i 1 min.
- Gentag trin 1,6 og 1,7. Supernatanten kasseres.
- Forsigtigt opblande i 1 ml M9 medier. Celler kan anvendes direkte til mikroskop billeddannelse eller fortyndet 10 - til 100-fold for at sikre lave celledensiteter for timelapse billeddannelse. Bemærk at lave celledensiteter er vigtige for udvidet timelapse billeddannelse. Det billeddannende kammer (trin 4) er forseglet under eksperimentet. På grund af eksponentiel vækst af celler, kan høje indledende cellekoncentration signifikant nedbryder oxygen i kammeret efter forlænget vækst i gel pad, reducerer fluorescerende protein modning og påvirke cellevækst.
3. Forbered agaroseopløsningen
- Afvejes 10-20 mglavtsmeltende temperatur agarose i et 1,5 ml mikrocentrifugerør.
- Tilsættes passende rumfang M9 minimalt medium uden antibiotika for at gøre en 3% agaroseopløsning.
- Opvarme agaroseopløsningen i 30 minutter ved 70 ° C for at smelte, vende røret for at sikre, at opløsningen er fuldstændig smeltet og homogen. Gel pad kan hældes på dette tidspunkt (trin 4) eller temperaturen kan formindskes til 50 ° C og holdt i flere timer til senere brug.
4. Forbered Gel Pad på mødesalen
- Ca. 50 min før billeddannelse, skylles en Microaqueduct objektglas med vand.
- Skyl en renset dækglas (under anvendelse af en streng rensemetode som den, der er beskrevet i 6) og Microaqueduct objektglas med sterilt vand og tørres ved blæsning med komprimeret luft.
- Placer gummipakningen på Microaqueduct dias, så den dækker de ind-og udløb på glasset side af Microaqueduct slide (dette kan ændres til applikationer isom alle er perfunderes gennem prøven). Påfør 50 ul agaroseopløsning (trin 3) til midten af Microaqueduct dias.
- Top det agaroseopløsning med renset, tørre dækglas.
- Lad agarose opløsningen henstå ved stuetemperatur i 30 minutter.
- I mellemtiden fremstilles en celleprøve (trin 2).
- Forsigtigt det dækglasset fra toppen af gel pad. Tilsæt 1,0 pi vasket cellekultur til toppen af gelen pad. Vente på ~ 2 min for kulturen at blive absorberet af den gel pad. Det er vigtigt ikke at vente så længe, at de gel pad overdries, men længe nok til, at cellerne ordentligt klæbet til gel pad. Ideal ventetid vil variere med temperatur og fugtighed.
- Mens vi venter, tørre en anden precleaned dækglas.
- Dæk prøven med den nye dækglas sikrer, at dækslet glas og Microaqueduct slide godt flugter.
- Samle det temperaturregulerede vækstkammer ifølge producentens anvisninger.Det kan nu anvendes til billeddannelse på mikroskop (trin 5).
5. Imaging and Erhvervelse af timelapse film
- Tænd laseren og mikroskopet ifølge producentens instruktioner (f.eks laseren muligvis varmet op til ~ 0,5 timer før forsøget).
- Lås samlede kammer på scenen insert på mikroskopet. Indstil temperaturen af vækstkammer og målet varmelegeme ved 37 ° C eller anden ønsket væksttemperatur.
- Hvis billeddannelse over stuetemperatur vil fokus eller gel pad normalt glider betydeligt for ~ 15 min efter den første temperatur skift. I praksis bruge denne tid til at finde områder af interesse og modificere billeddiagnostiske scripts som er nødvendigt for et eksperiment.
- Find celler på mikroskop og lagre positionen af hver celle efter centrere det inden for et forudbestemt og tilpasset imaging region. Mere end en celle kan afbildes i hver billedoptagelse tidsvindue. For timelapse billeddannelse over Mnogen generationer, at afbillede celler i første omgang er adskilt fra andre celler med mindst et par hundrede um, så andre kolonier vil ikke komme ind i imaging-regionen under væksten.
- Juster laser excitationsintensitet så næsten alle fluorescerende molekyler photobleach inden for 6 eksponeringer (figur 5).
- Ved hjælp af en automatiseret imaging script / tidsskrift, erhverve timelapse data ved hjælp af algoritmen beskrevet i den eksperimentelle workflow i figur 3.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Typiske resultater fra en CoTrAC eksperiment sporing produktionen af λ-repressoren CI er vist i figur 4 og 5.. I dette forsøg blev 12 kolonier afbildet ved 5 minutters intervaller. På hvert tidspunkt blev kolonien 1:e autofocused og centraliseret i imaging-regionen. Dernæst blev centrerede / fokuserede position lagres og en brightfield billede blev taget. Etapen blev derefter translokeret ved ~ 0,5 um langs z-aksen til at flytte fra den brightfield brændplan til flyet skærer cellerne (uden fase-kontrast eller differential interferens kontrast (DIC) optik, kan semi-transparente objekter blive afbildet på lidt ud af fokus fly 8). Endelig blev seks billeder erhvervet på 1 sek intervaller, hver med en 100 ms eksponering (figur 5 viser et sådant tidspunkt). Dette blev gentaget for alle celler på hvert tidspunkt. Fordi næsten alle Venus molekyler Lysblegede ved hvert tidspunkt, de fluorescerendecent pletter i figur 4 og 5 svarer til Venus molekyler, modnede (blevet fluorescerende) inden for sidste 5 min. Venus molekyler modne hurtigt in vivo med en halveringstid på ~ 2-7 min 1, 2, 7 og spaltning med UBP1 er meget effektiv 4, 9. Derfor kan antallet af proteinmolekyler fremstillet siden sidste måling nøjagtigt udledes antallet af Venus-molekyler optalt på membranen.
Figur 1. Ved hjælp CoTrAC at tælle ekspressionen af enkelte transkriptionsfaktor-molekyler. (1) En reporter herunder membran-lokaliseringssekvens TSR, den hurtige modning YFP Venus, og Ubiquitin (Ub) udtrykkes i translationel fusion med en transkriptionsfaktor fra en Promotis reguleret af transskriptionsfaktoren. (2) Proteasen UBP1 co-translationelt spalter den spirende polypeptidet efter den C-terminale Ub rest. (3) TSR-Venus-Ub reporter lokaliseres til membranen, hvor det kan tælles på en enkelt -molekyle niveau. (4) transkriptionsfaktor kan regulere sin egen ekspression. Metode tegneserie.
Figur 2. Skematisk af prøvekammeret, der anvendes i CoTrAC eksperimenter. Celler placeret mellem agarosegel pude og dækglasset. Microaqueduct slide og objektiv holdes ved en fast temperatur ved hjælp af en elektronisk controller. Prøveforberedelse.
Figur 3. Workflow af en typisk CoTrAC eksperiment. Experimental workflow.
Figur 4. Typiske timelapse data fra en CoTrAC eksperiment. Billeder fra en enkelt koloni er vist ved 25 minutters intervaller. I dette eksperiment blev indhentede data hver 5 min fra 12 forskellige kolonier. (A) brightfield billeder. (B) Venus (YFP) fluorescens billede (gennemsnitlig baggrund subtraheret at tage højde for ændringer i baggrunden af hele billedfeltet over tid). (C ) Overlay billede viser pol lokalisering af TSR-Venus-Ub reportermolekyler og heterogenitet i antallet af molekyler, der produceres i 5 min tidsvinduer i forskellige celler (lysfelt billede vendes om og Venus billede båndpasfiltreres). Click here for at se større figur.
Figur 5. Typiske data fra et enkelt tidspunkt i en CoTrAC eksperiment. (A) Venus (YFP) fluorescensbilleder. Seks 100 msek engagementer blev erhvervet i begyndelsen af hver 5 min tidsinterval. Hver af de seks eksponeringer blev adskilt ved 900 msek for at give tid til transient mørke Venus molekyler, som havde blinkede ud for at blive fluorescerende. (B) Til analyse, er billede 6 subtraheres fra billede 1 for at korrigere for ubleget molekyler og autofluorescens baggrund. Steder i dette billede er lokaliseret til specifikke cellelinier og kvantificeres ved deres integrerede fluorescensintensitet. (C) Den gennemsnitlige integrerede fluorescens af kolonien i A er afbildet over 6 billeder (sålåget line). Montering denne linie til en eksponentiel henfald plus en konstant forskydning (stiplet linie) giver et henfald halv tid på 1 sek. I dette eksperiment, meget Venus molekyler photobleach hurtigere end cellulær autofluorescens, så betyder dette, at omkring halvdelen af det samlede antal Venus molekyler Lysblegede i hver ramme. Fotoblegning fremskridt på et enkelt tidspunkt.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
The CoTrAC fremgangsmåde kan generaliseres til at måle produktionen af andre proteiner, hvor konventionelle N-eller C-terminale fluorescerende proteinfusioner kan forstyrre proteinaktivitet. Den CoTrAC strategi har tre unikke fordele i forhold til de nuværende metoder. Første, co-translationel fusion sikrer, at et molekyle af det fluorescerende reporter fremstilles for hvert molekyle af proteinet af interesse, hvilket tillader nøjagtig optælling af proteinproduktion i realtid. For det andet har membranen målrettet reporter TSR-Venus muliggør enkelt molekyle detektering af fluorescerende reportere, muliggør påvisning af proteiner udtrykt ved meget lave niveauer. Tredje og vigtigst, co-translationel spaltning af det fluorescerende reporter tillader proteinet af interesse bevarer sin nær-vildtype-sekvens og fungerer normalt, ved hjælp af ubiquitin som et protease-genkendelsessekvens i E. coli, målproteiner kun adskiller sig fra deres vildtype-peptidsekvenser, at det første N-terminale N </ Em>-formyl-methionin er ændret til methionin.
Ved brug af CoTrAC metode, er det vigtigt at huske på, at CoTrAC metoden måler antallet af protein produceret molekyler ved hver 5-min tidsvindue, som er forskellig fra måling af antallet af proteinmolekyler til stede per celle (dvs. proteinkoncentration). Mest enkeltcelle-fluorescens genekspression assays foranstaltning proteinkoncentration, som er en afbalanceret resultat af protein-produktion og nedbrydning. Derfor skal nedbrydningshastigheden af proteinet af interesse overvejes nøje hvis koncentrationen målingen anvendes til at udlede proteinproduktion information. Desuden proteinkoncentrationen er underlagt udsving forårsaget af en opdeling af proteinet mellem to datterceller ved celledeling, der kan være betydelige for lav-ekspression-level proteiner og fejlagtigt tolkes som hidrørende fra proteinproduktionssystemer dynamik. The CoTrAC metode kan være modificeret til at måle proteinkoncentration ved ikke fotoblegning nyproducerede reportermolekyler, men det skal ske med ekstra kontrol. Man skal kontrollere, at nedbrydningshastigheden for det fluorescerende reporter, og proteinet af interesse er ens, og at de begge er tilsvarende opdelt i to datterceller upon celledeling, således at koncentrationen af den fluorescerende reporter afspejler den for proteinet af interesse.
Vi bemærker, at mens CoTrAC ikke ændrer proteinsekvens, tilsætning af reportergenet ændrer mRNA-sekvens. Derfor transkriptions-og translationselementer dynamik og / eller mRNA-transkript nedbrydningshastigheder kan forstyrres. Hvis CoTrAC metode bruges til at observere proteinproduktion i vild-type forbindelse er det vigtigt at sammenligne ekspressionsniveauerne af målproteinet både i dens vild-type sekvensen og med CoTrAC fluorescerende fusion tag (f.eks ref. En vi sammenlignet CI udtryk i vores CoTrAC byggerit til om et vildtype-lysogen). Nedenfor diskuterer vi overvejelser, der er nødvendige for at generalisere den CoTrAC metode.
Først skal vi drøfte muligheden for at anvende sekvenser andre end TSR-Venus-Ub. De generelle krav: (1) reporter skal være lokaliseret til en vis position inden i cellen, således at det ikke diffunderer hurtigt (med TSR, er reportere ved celle poler 1). Dette er nødvendigt for enkelt-molekyle detektion af et fluorescerende protein molekyle som signalet fra en hurtigt spredende fluorescerende protein-molekyle vil normalt ikke kunne spores over en celles autofluorescerende baggrund, (2), skal det fluorescerende protein være tilstrækkelig lys, der skal detekteres på enkelt molekyle, og skal lagre (blive fluorescerende) hurtigt nok til den ønskede anvendelse (Venus er den hurtigste-modning fluorescerende protein til dato 7), (3), skal det fluorescerende protein være Lysblegede efter detektion således at nyligt fluorescerende proteiner kan være debeskyttes ved efterfølgende tidspunkter (fluorescerende proteiner, der er for resistente over for fotoblegning er uønskede som overdreven Lasereksponeringsgrænser kan forårsage fototoksicitet artefakter), (4), kan proteasegenkendelsessekvens ingen eventuelle resterende aminosyrer på proteinet af interesse, som vil forstyrre dens funktionalitet (UBP1 spalter umiddelbart efter den carboxyterminale Ub rest, der forlader ingen ekstra rester i alle).
For det andet må man kontrollere, at reporter korrekt udtrykkes og spaltes. Proteolytisk spaltning adskillelse af reporteren fra proteinet af interesse skal være effektiv, spaltning effektivitet kan måles ved anvendelse af Western blots mod reporter, proteinet af interesse eller begge (antistoffer er kommercielt tilgængelige for mange fluorescerende proteiner, såsom anti-GFP-antistof JL- 8 fra Clontech, som binder Venus i Western blot). Man bør sikre, at ingen uspaltede fusionsprotein detekteres i blots mod lysater af celler, der udtrykker fusionsproteinetprotein på højere niveauer end dem, der forudsiges i CoTrAC eksperimenter. Desuden skal reporteren og proteinet af interesse produceres i forholdet 1:1 efter spaltning. Dette kan kontrolleres ved at måle intensiteterne af de spaltede bånd i anti-reporter-og anti-protein-af-interesse Western blots normaliseret af intensiteterne af de uspaltede bånd i stammer, som mangler protease. Hvis reporter og proteinet af interesse er til stede i et 1:1 forhold efter spaltning, så:
Bemærk, at da Western blots foranstaltning proteinkoncentration, vil det resulterende forhold afviger fra 1:1, hvis reporter og det interessante protein udviser forskellige nedbrydningshastigheder efter spaltning.
For det tredje bør man verificere, at proteinet af interesse udviser den forventede funktionalitet efter spaltning. Tilstedeværelsen af store reporterkonstruktion fusion og / eller lokalisering til cellemembranen forventes at inaktivere de fleste transkriptionsfaktorer (for λ repressoren CI blev completely inaktivt uden UBP1 ekspression i vore forsøg 1). Omdannelse af protease-udtrykkende plasmid bør aktivere proteinet af interesse ved at frigøre proteinet fra voluminøse translationel fusion tag. Dette fænomen giver anledning til andre mulige CoTrAC anvendelser. Spaltning ved Ub carboxyterminus af UBP1 har været anvendt til at udsætte ikke-kanoniske amino-terminale aminosyrer for at belyse det bakterielle N-ende-reglen for proteinnedbrydning 9. Hvis fusion til et stort, membranassocieret reporter inaktiverer en transkriptionsfaktor (eller andet protein, såsom et enzym), kan dens aktivitet kom sig hurtigt efter induktion proteaseekspression. CoTrAC kan anvendes til meget hurtigt "tænder" en allerede eksisterende samling af transkriptionsfaktorer ved at fjerne / tilsætte en inhibitor / co-aktivator eller på anden måde iværksætte protease-ekspression eller-aktivitet. Endelig kan ekspression af det fluorescerende reporter forstyrre cellefysiologi og det bør sikres, at egenskaber, såsom cellecyklustid er upåvirkede, i eksperimentet beskrevet i ref. 1, vi bruges TSR-proteinet som en membran-lokaliseringssekvens, fordi TSR allerede stærkt udtrykt membranprotein og en lille stigning i TSR ekspression blev ikke at påvirke celle-adfærd.
Det fjerde, da en reportersekvens end specifikt beskrevet TSR-Venus-Ub anvendes, bør den tilsvarende imaging protokollen også modificeres efter behov. For eksempel vil forskellige fluorescerende proteiner kræver forskellige belysning protokoller for at opnå en god balance mellem effektiv detektering af fluorescerende proteinmolekyler, fototoksicitet fra Lasereksponeringsgrænser og fotoblegning. Ideelt set bør laser excitation være i absorbanstop for det valgte fluorescerende protein, off-peak excitation kræver højere excitations-intensiteter (og dermed højere fototoksicitet og autofluorescens baggrund) for at opnå det samme fluorescerende protein emissions-og fotoblegning egenskaber. Ogsåbilleddannelse frekvens kan ændres til at være langsommere eller hurtigere end 5 minutter afhængig af tolerancen af cellerne til fototoksicitet af laserstråling. I vores eksperimenter, 12 separate E. coli-kolonier blev afbildet hver 5 min og fulgt i 7-8 cellecykler før observere væsentlige fototoksicitet defekter 1.
Endelig er efter time-lapse film af proteinproduktion erhvervet ved en CoTrAC forsøg (eksempler er vist i figurerne 4 og 5), fluorescerende protein ekspression skal kvantificeres ved detektion af fluorescerende pletter svarende til et eller flere molekyler, tildele molekyler til individuelle celler og sporing cellelinier. Vi har beskrevet en brugerdefineret Matlab rutine at studere λ repressor CI produktion 1. Kort beskrevet, må man først identificere konturerne af individuelle celler og tidspunkter svarende til celledeling i brightfield billeder samtidig sporing cellelinier ved efterfølgende billedrammes. Vi fandt, at en 5 min tidsinterval var tilstrækkelig kort, at en celle i en ramme sædvanligvis svarer til cellen i den foregående ramme, som den delte de fleste pixels i et segmenteret billede. I tilfælde, hvor lejlighedsvise store forskydninger af kolonier mellem to efterfølgende rammer blev observeret, blev manuel tildeling af individuelle celler til deres slægter påkrævet. Dernæst er man nødt til at identificere fluorescerende pletter og kvantificere deres intensitet. Vi fandt, at fluorescerende pletter kan identificeres ved (1) båndpasfiltrering af fluorescensbillede til fjernelse af lavfrekvent fluorescens baggrund (fx autofluorescens) og højfrekvent støj, (2) tærskling billedet baseret på fluorescensintensitet, og (3) identifikation af objekter større end nogle få pixels i det tærsklingsbehandlet billede. Objekterne i den tærsklingsbehandlet billede blev tilpasset til en 2-dimensional gaussisk funktion plus en konstant baggrund, og den integrerede intensitet af pletten blev taget som produktet af pasningen amplitude og varians.I vores eksperimenter ofte flere TSR-Venus-Ub reportere co-lokaliseret på celle-poler, skabe pletter, som var lysere end dem fra enkelte TSR-Venus molekyler. Antallet af Venus-molekyler inden for en plet blev kvantificeret ved at dividere den integrerede intensitet af stedet af fluorescensintensiteten af en enkelt Venus-molekyle, som blev kvantificeret ved anvendelse af en lav-ekspression-niveau stamme, hvor pletter sjældent indeholder mere end én fluorescerende protein molekyle. Denne måling kan yderligere suppleret med in vitro målinger af enkelte fluorescerende proteinmolekyler adhæreret til et objektglas. Det har vist sig, at fluorescerende protein egenskaber er stort set identisk i in vivo-og in vitro-systemer med lignende pufferbetingelser.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Vi har ingen oplysninger.
Acknowledgments
Plasmidet pCG001 udtrykker UBP1 blev venligst stillet til rådighed af Rohan Baker på John Curtin School of Medical Research. Dette arbejde blev finansieret af March of Dimes Research Grant 1-FY2011, March of Dimes Basil O'Connor Starter Scholar Research Award # 5-FY20 og NSF KARRIERE prisen 0.746.796.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Agarose (Low melting temperature) | Lonza | 50100 | |
| Milli-Q H2O | |||
| 5×M9 salts | Following recipe described in 9 | ||
| 20% glucose | |||
| MgSO4 | |||
| CaCl2 | |||
| 50×MEM amino acid solution | Invitrogen | 11130-051 | |
| Temperature-Controlled Growth Chamber Stage adaptor |
Bioptechs | FCS-2 | |
| Objective Heater | Bioptechs | Model depends on microscope objective | |
| Microaqueduct Slide | Bioptechs | 130119-5 | |
| Micro cover glasses | VWR | 40CIR-1 | Can be difficult to source; also available from Bioptechs |
| Cover glass/slide gasket | Bioptechs | FCS2 0.75 mm | |
| Fluorescence Microscope | Various | Example setup: Coherent Innova 308C Argon-ion laser, Olympus IX-81 microscope, Olympus PlanApo 100X NA 1.45 objective, Metamorph software | Must have laser excitation, automated xyz stage, automation software capable of scripted imaging and autofocus, optics capable of resolving single fluorescent proteins |
| EM-CCD Camera | Various | Example setup: Andor Ixon DU-898 | Must have sufficiently low noise to detect single fluorescent proteins above background |
References
- Hensel, Z., Feng, H. D., Han, B., Hatem, C., Wang, J., Xiao, J. Stochastic expression dynamics of transcription factor revealed by single-molecule noise analysis. Nat. Struct. Mol. Biol. 19, 797-802 (2012).
- Yu, J., Xiao, J., Ren, X., Lao, K., Xie, X. S. Probing Gene Expression in Live Cells, One Protein Molecule at a Time. Science. 311, 1600-1603 (2006).
- Datsenko, K. A., Wanner, B. L. One-step inactivation of chromosomal genes in Escherichia coli K-12 using PCR products. Proc. Nat. Acad. Sci. U.S.A. 97, 6640-6645 (2000).
- Tobias, J. W., Varshavsky, A. Cloning and Functional Analysis of the Ubiquitin-specific Protease Gene UBP1 of Saccharomyces cerevisiae. J. Biol. Chem. 266, 12021-12028 (1991).
- Sambrook, J., Russell, D. W. Molecular Cloning: A Laboratory Manual. , ed. 3, Cold Spring Harbor Laboratory Press. New York. A2.2 (2001).
- Xiao, J., Elf, J., Li, G., Yu, J., Xie, X. S. Imaging gene expression in living cells at the single-molecule level. Single Molecules: a laboratory manual. , 149-169 (2007).
- Nagai, T., et al. A variant of yellow fluorescent protein with fast and efficient maturation for cell-biological applications. Nat. Biotechnol. 20, 87-90 (2002).
- Stagaman, G., Forsyth, J. Bright-field microscopy of semitransparent objects. J. Opt. Soc. Am. A. 5, 648-659 (1988).
- Tobias, J. W., Shrader, T. E., Rocap, G., Varshavsky, A. The N-end rule in bacteria. Science. 254, 1374-137 (1991).
