Summary
We beschrijven een werkwijze fluorescentiemicroscopie, co-translationele activering door splitsing (CoTrAC), het afbeelden van de productie van eiwitmoleculen in levende cellen met enkele molecule precisie zonder verstoren van het eiwit functionaliteit. Deze methode is gebruikt om de expressie stochastische dynamiek van een transcriptiefactor, de λ repressor CI volgen
Abstract
We beschrijven een werkwijze fluorescentiemicroscopie, co-translationele activering door splitsing (CoTrAC) het afbeelden van de productie van eiwitmoleculen in levende cellen met enkele molecule precisie zonder verstoren van het eiwit functionaliteit. Deze methode maakt het mogelijk om het aantal tellen eiwitmoleculen geproduceerd in een cel gedurende opeenvolgende vijf minuten tijdvensters. Het vereist een fluorescentiemicroscoop met laserexcitatie vermogensdichtheid van ~ 0,5 tot 1 kW / cm 2, die voldoende gevoelig enkele fluorescerende eiwit moleculen te detecteren in levende cellen. De fluorescerende reporter in deze methode bestaat uit drie delen: een membraan doelsequentie, een snel rijpen, geel fluorescerend eiwit en protease herkenningssequentie. De reporter wordt translationeel gefuseerd aan de N-terminus van een eiwit van interesse. Cellen worden gekweekt op een temperatuurgeregelde microscooptafel. Elke vijf minuten worden fluorescerende moleculen in cellen belicht (en later counted door analyse fluorescentiebeelden) en vervolgens photobleached zodat alleen nieuw vertaalde eiwitten geteld in de volgende meting.
Fluorescentiebeelden gevolg van deze methode kan worden geanalyseerd door het detecteren van fluorescerende vlekken in elk beeld, het toekennen aan individuele cellen en toewijzen cellen cellijnen. Het aantal eiwitten die binnen een tijdvenster in een bepaalde cel wordt berekend door de geïntegreerde fluorescentie-intensiteit van de spots gemiddelde intensiteit van enkele fluorescerende moleculen. We gebruikten deze methode om expressie te meten in het bereik van 0-45 moleculen in enkele 5 min tijdvensters. Deze methode ons in staat om ruis te meten in de expressie van de repressor CI λ, en vele andere mogelijke toepassingen in systeembiologie.
Protocol
1. Strain engineering Workflow
- Plaats sequenties coderen (a) een membraan lokalisatiesequentie, (b) een snelle rijping fluorescent eiwit en (c) een protease herkenningssequentie N-terminaal en in frame met een eiwit van interesse (bijvoorbeeld een transcriptiefactor). We gebruikten het membraan gerichte Tsr-reporter Venus 2 en gefuseerd aan de protease herkenningssequentie Ubiquitin (Ub) het aantal uitgedrukt bacteriofaag λ repressor CI eiwitmoleculen tellen. Details over hoe construeerden wij het fusieproteïne Tsr-Venus-Ub-CI, vervanging van de wild-type coderende gebied CI en waarin de construct in de E. coli chromosoom met λ Red recombinatie 3 zijn beschreven in ref. 1.
- Controleer of alle wijzigingen door sequencing.
- Transformeren van een plasmide dat codeert voor een protease specifiek de herkenningssequentie hierboven gebruikte een stam die het fluorescerende reporter en eiwit van interessein translationele fusie. We gebruikten de protease Ubp1, die onmiddellijk splitst na de C-terminale residu Ubiquitin 4.
2. Cultuur Cellen en Bereid Sample
- Kies een E. coli kolonie van belangstelling van een vers gestreepte agarplaat in 1 ml M9 minimale media 5 aangevuld met 1X MEM aminozuren en geschikte antibiotica. Incubeer in een shaker bij gewenste temperatuur lang genoeg is om OD 600> 1,0 (optische dichtheid bij 600 nm).
- Verdun de cultuur in 1 ml vers M9 medium met geschikte antibiotica tot OD 600 = 0,02. Incubeer in een shaker bij geschikte temperatuur. Initiële celdichtheid kan worden verhoogd indien nodig voor lage temperatuur groei.
- Wanneer de OD 600 = 0,2-0,3 (bij 37 ° C met een eerste celkweek bij OD 600 = 0,02, zal 3-4 uur duren), start de voorbereiding van de agarose gel pad (stap 3).
- De cellen klaar voor beeldvorming bij OD
- Breng 1 ml geïncubeerde cultuur in een 1,5 ml microcentrifugebuisje, centrifuge bij 10.000 xg gedurende 1 minuut in een benchtop microcentrifuge.
- Verwijder het supernatant en voeg 1 ml vers M9 medium en resuspendeer de pellet voorzichtig.
- Centrifugeer bij 10.000 xg gedurende 1 minuut.
- Herhaal stap 1.6 en 1.7. Verwijder het supernatant.
- Voorzichtig resuspendeer in 1 ml M9 media. Cellen kunnen direct worden gebruikt voor microscoop imaging of verdund 10 - tot 100-voudige laag celdichtheden zorgen voor timelapse imaging. Merk op dat lage celdichtheden van belang zijn voor langere timelapse beeldvorming. De imaging kamer (stap 4) wordt afgedicht tijdens het experiment. Door exponentiële groei van cellen, hoge initiële cel die significant afbrekende zuurstof in de kamer na langdurige groei in het gelkussen, waardoor fluorescerende eiwit rijping en die celgroei.
3. Bereid de agarose-oplossing
- Weeg 10-20 mglaagsmeltende temperatuur agarose in een 1,5 ml microcentrifugebuis.
- Voeg het juiste volume M9 minimaal medium zonder antibiotica tot een 3% agarose oplossing.
- Verwarm de agarose oplossing gedurende 30 min bij 70 ° C te smelten, het buisje dat de oplossing volledig gesmolten en homogeen. Het gelkussen kan worden gegoten op dit punt (stap 4) of de temperatuur kan worden verlaagd tot 50 ° C en gedurende enkele uren later gebruik.
4. Bereid Gel Pad op de kamer
- Ongeveer 50 minuten voor beeldvorming, spoel een Microaqueduct glijbaan met water.
- Spoelen gereinigd een dekglas (met een stringent reinigingsmethode zoals beschreven in 6) en Microaqueduct schuif met steriel water en droog te blazen met perslucht.
- Plaats de rubberen pakking op de Microaqueduct zo in dat het dekt de in-en uitgangen op de glazen zijkant van de Microaqueduct dia (dit kan worden aangepast voor toepassingen inwelke media wordt doorbloed door het monster). 50 ul van toepassing agarose-oplossing (stap 3) naar het midden van de Microaqueduct dia.
- Top van de agarose oplossing met de gereinigde, droge dekglas.
- Laat de agarose oplossing bij kamertemperatuur gedurende 30 minuten.
- Ondertussen bereiden een celmonster (stap 2).
- Verwijder voorzichtig het dekglas van de bovenkant van gelkussen. Voeg 1,0 ul gewassen celkweek naar de top van het gelkussen. Wacht tot 2 minuten om de kweek te worden geabsorbeerd door het gelkussen. Het is belangrijk om niet te wachten zo lang dat de gelkussen overdries, maar lang genoeg dat cellen goed in acht worden genomen om de gel pad. De Ideale wachttijd zal variëren met de temperatuur en vochtigheid.
- Tijdens het wachten, drogen een ander voorgereinigde dekglas.
- Wordt het monster met de nieuwe dekglas zodat het dekglas en Microaqueduct schuif goed zijn uitgelijnd.
- Monteer de temperatuur gecontroleerde groeikamer volgens de instructies van de fabrikant.Het kan nu gebruikt worden voor beeldvorming op microscoop (stap 5).
5. Imaging en Verwerving van Timelapse Movies
- Zet de laser en microscoop volgens de instructies van de fabrikant (bijvoorbeeld de laser moet opgewarmd ~ 0,5 uur vóór het experiment).
- Vergrendelen gemonteerd kamer naar het podium insert op de microscoop. Stel de temperatuur van de groeikamer doel verwarming bij 37 ° C of andere gewenste groeitemperatuur.
- Als beeldvorming boven kamertemperatuur, zal de focus of gelkussen meestal aanzienlijk drift voor ~ 15 minuten na de eerste temperatuur verschuiving. In de praktijk is deze tijd gebruiken om de regio's van belang te vinden en imaging scripts als nodig te wijzigen voor een experiment.
- Vind cellen op de microscoop en opslaan van de stand van elke cel na gecentreerd binnen een vooraf uitgelijnd en imaging regio. Meerdere cellen kan worden afgebeeld in elke beeldopname tijdvenster. Voor timelapse beeldvorming over malle generaties ervoor dat afgebeelde cellen aanvankelijk gescheiden van andere cellen door ten minste een paar honderd micrometer zodat andere kolonies wordt de beeldvorming niet in gebied tijdens de groei.
- Stel laser excitatie-intensiteit bijna alle fluorescerende moleculen photobleach binnen 6 posities (Figuur 5).
- Toepassing van een geautomatiseerde beeldvorming script / journal verkrijgen timelapse data met het algoritme beschreven in het experimentele workflow in figuur 3.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Typische resultaten van een experiment CoTrAC volgen van de productie van het repressor CI λ zijn weergegeven in figuren 4 en 5. In dit experiment werden 12 kolonies afgebeeld op 5 min intervallen. Op elk tijdstip, werd de kolonie eerste autofocused en gecentraliseerd binnen de beeldvorming regio. Vervolgens werd het gecentreerde / gefocuste positie opgeslagen en een helderveld beeld werd verworven. De fase werd translocatie van ~ 0,5 pm langs de z-as van het helderveld brandpuntsvlak naar de bissectrice vlak van de cellen (niet fase-contrast of differentiële interferentie contrast (DIC) optiek kunnen semi-transparante objecten worden afgebeeld op iets out-of-focus vliegtuigen 8). Tenslotte werden zes beelden verkregen bij 1 sec intervallen, elk met een 100 msec blootstelling (Figuur 5 toont een dergelijke tijdstip). Dit werd herhaald voor alle cellen op elk tijdstip. Omdat vrijwel alle moleculen Venus photobleached op elk tijdspunt de fluorescent spots in figuren 4 en 5 komen overeen met Venus moleculen (werd fluorescent) rijping van de laatste 5 minuten. Venus moleculen rijpen snel in vivo met een halfwaardetijd van ~ 2-7 min 1, 2, 7 en splitsing door Ubp1 is zeer efficiënt 4, 9. Daarom kan het aantal eiwitmoleculen die sinds de laatste meting nauwkeurig worden afgeleid uit het aantal moleculen Venus geteld op het membraan.
Figuur 1. CoTrAC met de expressie van enkele transcriptiefactor moleculen tellen. (1) Een reporter zoals de membraan lokalisatiesequentie Tsr, de snel rijping YFP Venus en ubiquitine (Ub) wordt uitgedrukt in translationele fusie met een transcriptiefactor van een bevorer gereguleerd door de transcriptiefactor. (2) De protease Ubp1 co-translationeel het groeiende polypeptide splitst na de C-terminale residu Ub. (3) De Tsr-Venus-Ub reporter lokaliseert aan het membraan waar het kan worden geteld op de interne -molecuul. (4) De transcriptiefactor zijn eigen expressie te reguleren. Methode cartoon.
Figuur 2. Schematische voorstelling van monsterkamer gebruikt in CoTrAC experimenten. Cellen worden geplaatst tussen agarosegel pad en dekglas. Microaqueduct dia en objectieve worden op een vaste temperatuur met een elektronische controller. Voorbereiding van het monster.
Figuur 3. Workflow van een typische CoTrAC experiment. Experimentale workflow.
Figuur 4. Typische Timelapse gegevens van een CoTrAC experiment. Beelden uit een enkele kolonie worden getoond op 25 min. intervallen. In dit experiment werden verkregen gegevens om de 5 min van 12 verschillende kolonies. (A) Brightfield beelden. (B) Venus (YFP) fluorescentiebeeld (gemiddelde achtergrond afgetrokken rekening voor mutaties in de achtergrond van de gehele beeldveld tijd). (C ) Overlay afbeelding toont pool lokalisatie van Tsr-Venus-Ub reporter moleculen en heterogeniteit in het aantal moleculen geproduceerd in 5 min tijdvensters in verschillende cellen (helderveld beeld wordt omgekeerd en Venus beeld is bandpass gefilterd). Klik op here grotere afbeelding te bekijken.
Figuur 5. Typische gegevens van een enkel tijdstip in een CoTrAC experiment. (A) Venus (YFP) fluorescentie beelden. Zes 100 msec posities werden verkregen bij het begin van elke 5 min tijdsinterval. Elk van de 6 posities werd gescheiden door 900 msec tijd zal vergen tijdelijk donkere Venus moleculen die had knipperde met zijn ogen uit te worden fluorescerende. (B) Voor de analyse-, beeld-6 is afgetrokken van afbeelding 1 te corrigeren voor ongebleekte moleculen en autofluorescentie achtergrond. Vlekken in het beeld zijn gelokaliseerd tot specifieke cellijnen en gekwantificeerd door de geïntegreerde fluorescentie-intensiteit. (C) De gemiddelde geïntegreerde fluorescentie van de kolonie in A is uitgezet in 6 beelden (dusdeksel lijn). Montage van deze lijn tot een exponentiële verval en een constante offset (stippellijn) geeft een decay halve tijd van 1 sec. In dit experiment Venus moleculen photobleach veel sneller dan cellulaire autofluorescentie, dus dit betekent dat ongeveer de helft van het totale aantal moleculen Venus photobleached in elk frame. Photobleaching vooruitgang in een keer punt.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
De CoTrAC methode kan worden gegeneraliseerd tot de productie van andere eiwitten waar conventionele N-of C-terminale fusies kunnen fluorescent eiwit proteïneactiviteit verstoren meten. De CoTrAC strategie heeft drie unieke voordelen ten opzichte van de huidige methoden. Eerste co-translationele fusie, zodat een molecuul van de fluorescente reporter geproduceerd voor elk molecuul van het eiwit van belang, zodat nauwkeurige telling van eiwitproductie in real time. Anderzijds de membraan gerichte reporter Tsr-Venus maakt single-molecule detectie van fluorescente reporters, die de detectie van eiwitten die op zeer lage niveaus. Derde en vooral de co-translationele splitsing van fluorescerende reporter kan het eiwit van interesse zijn bijna wild-type sequentie en functie behouden normaal gebruik Ubiquitin als protease-herkenningssequentie in E. coli, doelwiteiwitten alleen verschilt van de wildtype peptidesequenties in de eerste N-terminale N </ Em>-formyl-methionine wordt veranderd in methionine.
Bij gebruik van de CoTrAC methode Het is belangrijk om in gedachten te houden dat de CoTrAC methode het aantal geproduceerde eiwitmoleculen meet bij elke 5 min tijdvenster, dat verschilt van de meting van het aantal eiwitmoleculen onderhavige per cel (de eiwitconcentratie). De meeste eencellige fluorescentie genexpressie testen meten eiwitconcentratie, die het evenwichtige resultaat van eiwitproductie en afbraak. Daarom moet de afbraaksnelheid van het eiwit van belang zorgvuldig overwogen worden als de concentratie meting worden eiwitproductie informatie afleiden. Bovendien eiwitconcentratie is onderhevig aan schommelingen veroorzaakt door afscherming van het eiwit tussen twee dochtercellen bij de celdeling, die significant zijn voor laag-expressie-niveau eiwitten en ten onrechte geïnterpreteerd als gevolg van eiwitproductie dynamiek. De CoTrAC methode kan worden veranderdgeschied op eiwitconcentratie te meten door niet fotobleken nieuw geproduceerde reporter moleculen, maar dit moet worden gedaan met een extra toetsing. Men moet controleren of de afbraaksnelheden van de fluorescerende reporter en het eiwit van belang lijken, en dat ze beiden eveneens verdeeld in twee dochtercellen na celdeling, zodat de concentratie van de fluorescente reporter die van het eiwit van interesse weergeeft.
We merken op dat terwijl de CoTrAC neemt niet weg eiwitsequentie, de toevoeging van het reportergen de mRNA sequentie verandert. Daarom, transcriptie en translatie dynamiek en / of mRNA-transcript afbraaksnelheden kan worden verstoord. Als de CoTrAC methode wordt gebruikt om eiwitproductie in het wild-type context observeren, is het belangrijk te vergelijken expressieniveaus van het doeleiwit zowel in de wild-type sequentie en de CoTrAC fluorescent fusion tag (bijvoorbeeld ref. Een we vergeleken CI uitdrukking in onze CoTrAC bouwt die in een wild-type lysogeen). Hieronder bespreken we overwegingen die noodzakelijk zijn voor het generaliseren van de CoTrAC methode.
Eerst bespreken we de mogelijkheid van het gebruik van sequenties anders dan Tsr-Venus-Ub. De algemene vereisten zijn: (1) de reporter worden gelokaliseerd op een bepaalde positie in de cel zodat het niet snel diffuse (met TSR, reporters in de cel polen 1). Dit is noodzakelijk voor single-molecule detectie van een fluorescent eiwit molecuul als het signaal van een snel diffundeert fluorescent eiwitmolecuul zal gewoonlijk detecteerbaar boven autofluorescerende een cel achtergrond, (2), het fluorescerende eiwit moet voldoende helder worden gedetecteerd op de individuele molecuul en moeten rijpen (worden fluorescerend) snel genoeg voor de gewenste toepassing (Venus het snelst rijpen fluorescent eiwit date 7), (3), de fluorescerende eiwitten worden photobleached na detectie zodat nieuwe fluorescerende eiwitten kunnen deschermd op latere tijdstippen (fluorescerende eiwitten die erg tegen fotobleking ongewenst buitensporig laserbelichting kan fototoxiciteit artefacten), (4) de protease herkenningssequentie kan geen resterende aminozuren reactie op het eiwit van belang dat de functionaliteit verstoren (Ubp1 splitst onmiddellijk na de carboxy-terminale residu Ub, zodat er geen extra residuen hebben).
Tweede moet men controleren of de reporter goed uitgedrukt en gesplitst. Proteolytische splitsing scheiden van de reporter van het eiwit van belang moet efficiënt, splitsing efficiency kan worden gemeten met Western blots tegen de reporter, het eiwit van interesse of beide (antilichamen zijn commercieel beschikbaar voor vele fluorescerende eiwitten zoals anti-GFP antilichaam JL- 8 uit Clontech, die Venus bindt in Western blot). Men ervoor zorgen dat geen ongesplitst fusie-eiwit wordt gedetecteerd in blots tegen lysaten van cellen die het fusieeiwit op een hoger niveau dan de resultaten verwacht in CoTrAC experimenten. Ook moet de reporter en eiwit van belang geproduceerd in een 1:1 verhouding na splitsing. Dit kan worden gecontroleerd door meting van de intensiteiten van de banden gesplitst in anti-reporter en anti-eiwit-of-interest Western blots genormaliseerd door de intensiteiten van de banden in ongekliefde stammen ontbreekt protease. Als reporter en eiwit van interesse aanwezig zijn in een verhouding van 1:1 na splitsing, dan:
Merk op dat aangezien Western blots maatregel eiwitconcentratie, de resulterende verhouding van 1:1 zal afwijken als de reporter en het eiwit van belang verschillende afbraaksnelheden vertonen na splitsing.
Ten derde moet men controleren of het eiwit van belang de verwachte functionaliteit vertoont na splitsing. De aanwezigheid van de grote reporterconstruct fusie en / of lokalisatie aan het celmembraan wordt verwacht dat de meeste transcriptiefactoren inactiveren (λ de repressor CI completely inactief zonder Ubp1 uitdrukking in onze experimenten 1). Transformatie van de protease tot expressie plasmide te activeren eiwit van belang werd bevrijd het eiwit uit de omvangrijke translationele fusie tag. Dit fenomeen leidt tot andere mogelijke toepassingen CoTrAC. Splitsing op de Ub carboxy terminus van Ubp1 is gebruikt om niet-canonieke amino-terminale aminozuren blootstellen aan de bacteriële N-end regel van eiwitafbraak 9 verduidelijken. Als fusie met een grote membraangeassocieerd reporter inactiveert een transcriptie factor (of een ander eiwit zoals een enzym), kan de activiteit snel worden goedgemaakt door het induceren protease expressie. CoTrAC kunnen worden gebruikt om zeer snel een bestaande pool van transcriptiefactoren "inschakelen" door het verwijderen / toevoegen van een inhibitor / co-activator of anderszins initiëren protease expressie of activiteit. Tot slot kan de expressie van het fluorescerende reporter verstoren celfysiologie en ervoor moet worden gezorgd dat de eigenschappen, zoals mobielecyclustijd niet beïnvloed, in het experiment beschreven in ref. 1, gebruikten we de Tsr eiwit als membraan lokalisatiesequentie omdat Tsr reeds een sterk tot expressie membraaneiwit en een kleine toename in Tsr expressie werd niet verwacht cel gedrag.
Ten vierde, wanneer een reporter sequentie anders dan de specifiek besproken Tsr-Venus-Ub wordt gebruikt, moeten de overeenkomstige imaging protocol ook indien nodig worden gewijzigd. Bijvoorbeeld, verschillende fluorescente eiwitten vereisen verschillende belichting protocollen een goede balans tussen efficiënt detecteren fluorescerende eiwitmoleculen, fototoxiciteit van laserbelichting en fotobleken bereiken. Idealiter laserexcitatie ten absorptiepiek van de gekozen fluorescent eiwit; daluren excitatie vereist hogere excitatie intensiteit (en dus hogere lichtgevoeligheid en autofluorescentie achtergrond) met dezelfde fluorescerende eiwit emissie en fotobleken karakteristieken. Ook deimaging frequentie kan worden aangepast om langzamer of sneller dan 5 min afhankelijk van de tolerantie van de cellen naar de fototoxiciteit van laserbelichting. In onze experimenten, 12 afzonderlijke E. coli kolonies werden afgebeeld om de 5 min en gevolgd gedurende 7-8 celcycli alvorens op te merken aanzienlijke fototoxiciteit gebreken 1.
Uiteindelijk, na intervalfilms van eiwitproductie worden verkregen in een CoTrAC experiment (voorbeelden in figuren 4 en 5), fluorescent eiwit expressie moet worden gekwantificeerd door het detecteren van fluorescerende vlekken overeenkomt met een of meer moleculen, moleculen toewijzen aan afzonderlijke cellen en het bijhouden van cellijnen. Wij hebben er een gewoonte Matlab routine om λ repressor CI productie 1 te bestuderen. In het kort, moet men eerst bepalen contouren van individuele cellen en tijdstippen die overeenkomen met de celdeling in helderveld beelden, terwijl het bijhouden van cellijnen door opeenvolgende beeldframes. We vonden dat een 5 min tijdsinterval was voldoende kort dat een cel in een frame meestal overeen met de cel in het vorige frame die hij aan de pixels in een gesegmenteerde beeld. Wanneer incidentele grote verschuivingen kolonies tussen twee opeenvolgende frames waargenomen werd handmatige toewijzing van afzonderlijke cellen hun lijnen vereist. Vervolgens moet men fluorescerende vlekken identificeren en hun intensiteit kwantificeren. We vonden dat fluorescerende vlekken kunnen worden geïdentificeerd door (1) bandpass filtering het fluorescentiebeeld aan laagfrequente fluorescentie achtergrond te verwijderen (bijv. autofluorescentie) en hoge frequentie, (2) drempeling het beeld op basis van fluorescentie-intensiteit en (3) het identificeren van voorwerpen groter dan enkele pixels in het beeld thresholded. De objecten in het beeld thresholded geschikt waren om een 2-dimensionale Gauss functie plus een constante achtergrond en de geïntegreerde intensiteit van de vlek werd genomen als het product van de fit amplitude en variantie.In onze experimenten, multiple Tsr-Venus-Ub reporters vaak samen gelokaliseerd cel polen, waardoor plekken die waren lichter dan die uit een Tsr-Venus moleculen. Het aantal Venus moleculen binnen een spot werd gekwantificeerd door het geïntegreerde intensiteit van de vlek van de fluorescentie-intensiteit van een Venus molecule die werd gekwantificeerd met een lage expressie niveau stam waarin spots zelden meer dan een fluorescent protein molecule. Deze meting kan verder worden aangevuld met in vitro metingen van enkele fluorescerende eiwitmoleculen gehecht aan een glasplaatje. We hebben gevonden dat fluorescent protein eigenschappen grotendeels vergelijkbaar in vivo en in vitro systemen met vergelijkbare buffer omstandigheden.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
We hebben geen toelichtingen.
Acknowledgments
Het plasmide pCG001 uiten Ubp1 werd vriendelijk door Rohan Baker op de John Curtin School of Medical Research. Dit werk werd gefinancierd door March of Dimes Research Grant 1-FY2011, March of Dimes Basil O'Connor Starter Scholar Research Award # 5-FY20 en NSF LOOPBAAN award 0.746.796.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Agarose (Low melting temperature) | Lonza | 50100 | |
| Milli-Q H2O | |||
| 5×M9 salts | Following recipe described in 9 | ||
| 20% glucose | |||
| MgSO4 | |||
| CaCl2 | |||
| 50×MEM amino acid solution | Invitrogen | 11130-051 | |
| Temperature-Controlled Growth Chamber Stage adaptor |
Bioptechs | FCS-2 | |
| Objective Heater | Bioptechs | Model depends on microscope objective | |
| Microaqueduct Slide | Bioptechs | 130119-5 | |
| Micro cover glasses | VWR | 40CIR-1 | Can be difficult to source; also available from Bioptechs |
| Cover glass/slide gasket | Bioptechs | FCS2 0.75 mm | |
| Fluorescence Microscope | Various | Example setup: Coherent Innova 308C Argon-ion laser, Olympus IX-81 microscope, Olympus PlanApo 100X NA 1.45 objective, Metamorph software | Must have laser excitation, automated xyz stage, automation software capable of scripted imaging and autofocus, optics capable of resolving single fluorescent proteins |
| EM-CCD Camera | Various | Example setup: Andor Ixon DU-898 | Must have sufficiently low noise to detect single fluorescent proteins above background |
References
- Hensel, Z., Feng, H. D., Han, B., Hatem, C., Wang, J., Xiao, J. Stochastic expression dynamics of transcription factor revealed by single-molecule noise analysis. Nat. Struct. Mol. Biol. 19, 797-802 (2012).
- Yu, J., Xiao, J., Ren, X., Lao, K., Xie, X. S. Probing Gene Expression in Live Cells, One Protein Molecule at a Time. Science. 311, 1600-1603 (2006).
- Datsenko, K. A., Wanner, B. L. One-step inactivation of chromosomal genes in Escherichia coli K-12 using PCR products. Proc. Nat. Acad. Sci. U.S.A. 97, 6640-6645 (2000).
- Tobias, J. W., Varshavsky, A. Cloning and Functional Analysis of the Ubiquitin-specific Protease Gene UBP1 of Saccharomyces cerevisiae. J. Biol. Chem. 266, 12021-12028 (1991).
- Sambrook, J., Russell, D. W. Molecular Cloning: A Laboratory Manual. , ed. 3, Cold Spring Harbor Laboratory Press. New York. A2.2 (2001).
- Xiao, J., Elf, J., Li, G., Yu, J., Xie, X. S. Imaging gene expression in living cells at the single-molecule level. Single Molecules: a laboratory manual. , 149-169 (2007).
- Nagai, T., et al. A variant of yellow fluorescent protein with fast and efficient maturation for cell-biological applications. Nat. Biotechnol. 20, 87-90 (2002).
- Stagaman, G., Forsyth, J. Bright-field microscopy of semitransparent objects. J. Opt. Soc. Am. A. 5, 648-659 (1988).
- Tobias, J. W., Shrader, T. E., Rocap, G., Varshavsky, A. The N-end rule in bacteria. Science. 254, 1374-137 (1991).
