Summary
Wir beschreiben ein Verfahren der Fluoreszenzmikroskopie, Co-translationale Aktivierung durch Spaltung (CoTrAC), zur Abbildung der Herstellung von Protein-Molekülen in lebende Zellen mit Einzel-Molekül-Präzision ohne Stören des Proteins Funktionalität. Dieses Verfahren wurde verwendet, um die Expression stochastische Dynamik eines Transkriptionsfaktors, dem λ-Repressor CI folgen
Abstract
Wir beschreiben ein Verfahren der Fluoreszenzmikroskopie, Co-translationale Aktivierung durch Spaltung (CoTrAC) zur Abbildung der Herstellung von Protein-Molekülen in lebende Zellen mit Einzel-Molekül-Präzision ohne Stören des Proteins Funktionalität. Dieses Verfahren macht es möglich, die Zahl der Proteinmoleküle in einer Zelle während sequentiell, fünfminütigen Zeitfenster produziert zählen. Es erfordert ein Fluoreszenzmikroskop mit Laseranregung Leistungsdichte von ~ 0,5 bis 1 kW / cm 2, die empfindlich genug, um einzelne Moleküle fluoreszierende Protein in lebenden Zellen nachzuweisen ist. Das fluoreszierende Reporter in diesem Verfahren verwendet wird, besteht aus drei Teilen: eine Membran-Targeting-Sequenz, eine Fast-Reifung, gelb fluoreszierendes Protein und ein Protease-Erkennungssequenz. Der Reporter translatorisch an den N-Terminus eines Proteins von Interesse fusioniert ist. Zellen werden auf einer Temperatur-gesteuerten Mikroskoptisch gewachsen. Alle fünf Minuten werden fluoreszierende Moleküle in Zellen abgebildet (und später coUNTED durch die Analyse von Fluoreszenz-Bildern) und anschließend Lichtgeschädigte so dass nur neu übersetzt Proteine in der nächsten Messung gezählt.
Fluoreszenzbilder aus diesem Verfahren kann durch Erfassen Fluoreszenzpunkte in jedem Bild, ihre Zuordnung zu einzelnen Zellen und dann Zuweisen Zellen Zelllinien analysiert werden. Die Anzahl von Proteinen innerhalb eines Zeitfensters in einer gegebenen Zelle erzeugt wird durch Dividieren der integrierten Intensität der Fluoreszenz von Flecken durch die durchschnittliche Intensität der einzelnen fluoreszierenden Moleküle berechnet. Wir verwendeten diese Methode zum Expressionslevel in dem Bereich von 0-45 Molekülen in einzelnen Zeitfenstern 5 min zu messen. Dieses Verfahren ermöglichte es uns, Rauschen in dem die Expression des λ-Repressor CI messen, und hat viele andere potentielle Anwendungen in Systembiologie.
Protocol
Ein. Belastung Engineering Workflow
- Legen Sequenzen kodiert (a) eine Membran-Lokalisierungssequenz, (b) eine schnell reifenden fluoreszierendes Protein und (c) eine Protease-Erkennungssequenz N-terminal zu und im Leserahmen mit einem Protein von Interesse (zB ein Transkriptionsfaktor). Wir verwendeten die Membran gezielt Tsr-Venus Reporter 2 und fusioniert an die Protease Erkennungssequenz Ubiquitin (Ub), die Anzahl der Bakteriophage λ ausgedrückt Repressor CI Proteinmoleküle zählen. Einzelheiten über konstruierten wir das Fusionsprotein Tsr-Venus-Ub-CI, Ersetzen des Wildtyp-CI Kodierregion und Einbringen des Konstrukts in die E. coli-Chromosom mit λ Red Rekombination 3, sind im Detail in ref beschrieben. Ein.
- Überprüfen Sie alle Änderungen durch Sequenzierung.
- Transformieren eines Plasmids, das eine Protease spezifisch für die Erkennungssequenz oben in einen Stamm, der die fluoreszierende Reporter und Protein von Interesse verwendetin translationale Fusion. Wir verwendeten die Protease UBP1, die sofort spaltet nach der C-terminale Rest 4 Ubiquitin.
2. Kultur Cells und Probe vorbereiten
- Wählen Sie ein E. coli-Kolonie von Interesse aus einer frisch ausgestrichenen Agarplatte in 1 ml M9 Minimalmedium 5 mit 1X MEM Aminosäuren und geeigneten Antibiotika ergänzt. Inkubieren in einem Schüttler bei gewünschte Temperatur lange genug, um zu erreichen OD 600> 1,0 (optische Dichte bei 600 nm).
- Verdünnen Sie die Kultur in 1 ml frischem M9-Medium mit geeigneten Antibiotika zur OD 600 = 0,02. Inkubieren in einem Schüttler bei geeigneter Temperatur. Initial Zelldichte erhöht werden, wenn für die Tieftemperatur-Wachstum benötigt werden.
- Wenn die OD 600 = 0,2-0,3 (bei 37 ° C mit einem anfänglichen Zellkultur bei OD 600 = 0,02, dies wird 3-4 Stunden dauern kann), beginnen die Vorbereitung der Agarosegel-Pad (Schritt 3).
- Die Zellen sind zur Bildgebung bereit, wenn OD
- Übertragen 1 ml inkubierten Kultur in einem 1,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen Zentrifuge bei 10.000 xg für 1 min in einem Tischgerät Mikrozentrifuge.
- Überstand verwerfen und 1 ml frisches Medium M9 und das Pellet vorsichtig.
- Zentrifugieren bei 10.000 × g für 1 Minute.
- Wiederholen Sie Schritt 1,6 und 1,7. Überstand verwerfen.
- Vorsichtig in 1 ml M9-Medien resuspendieren. Bis 100-fache zu geringen Zelldichten für timelapse Bildgebung sicherzustellen - Zellen können direkt für Mikroskopabbildanordnung oder verdünntem 10 verwendet werden. Beachten Sie, dass geringen Zelldichten wichtig sind für längere timelapse Bildgebung. Die Abbildungskammer (Schritt 4) während des Experiments abgedichtet. Durch exponentielle Wachstum der Zellen, können hohe anfängliche Zellkonzentration signifikant zum Abbau Sauerstoff in die Kammer nach längerer Wachstum in der Gel-Pad, wodurch fluoreszierende Protein Reifung und beeinflussen Zellwachstum.
3. Bereiten Sie die Agarose-Lösung
- Wiegen 10-20 mglow-Schmelztemperatur Agarose in einem 1,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen.
- Fügen Sie entsprechende Volumen M9 Minimalmedium ohne Antibiotika, um eine 3% igen Lösung herzustellen.
- Erwärmen der Agarose-Lösung für 30 min bei 70 ° C zu schmelzen, Invertieren des Rohres zu gewährleisten, dass die Lösung vollständig geschmolzen und homogen ist. Das Gelkissen kann an diesem Punkt (Schritt 4) gegossen werden, oder die Temperatur kann auf 50 ° C gesenkt werden und dort für mehrere Stunden zur späteren Verwendung.
4. Bereiten Gel Pad auf der Kammer
- Etwa 50 min vor der Bildgebung, spülen ein Microaqueduct Rutsche mit Wasser.
- Lidspalt ein Deckglas reinigen (mit einem strengen Reinigungsverfahren wie das in 6 beschrieben) und Microaqueduct Schlitten mit sterilem Wasser und trocken durch Abblasen mit Druckluft.
- Platzieren Sie die Gummidichtung auf den Schieber Microaqueduct so dass er die Ein-und Auslässe auf der Glasseite der Microaqueduct Schieber (deckt diese für Anwendungen im modifiziert werdenwelche Medien durch die Probe perfundiert). Anwenden 50 ul Agaroselösung (Schritt 3) in der Mitte des Schiebers Microaqueduct.
- Ganz oben auf der Agarose-Lösung mit dem gereinigten, trockenen Deckglas.
- Lassen Sie die Agarose-Lösung bei Raumtemperatur stehen für 30 min.
- Unterdessen bereiten eine Zellprobe (Schritt 2).
- Ziehen Sie vorsichtig die Glasabdeckung von der Spitze des Gel-Polster. Fügen Sie 1,0 ul gewaschene Zellkultur an die Spitze des Gel-Polster. Warten für ~ 2 Minuten für die Kultur von der Gel-Polster absorbiert werden. Es ist wichtig, nicht so lange zu warten, dass die Gel-Polster overdries, aber lang genug, dass die Zellen richtig auf das Gel Pad eingehalten werden. Das Ideal Wartezeit wird mit Temperatur und Luftfeuchtigkeit variieren.
- Während des Wartens, trocknen anderen vorgereinigte Deckglas.
- Decken Sie die Probe mit dem neuen Deckglas sicherzustellen, dass das Deckglas und Microaqueduct Objektträgers ausgerichtet sind.
- Montieren Sie den temperierten Klimakammer nach den Anweisungen des Herstellers.Es kann nun zur Abbildung auf Mikroskop (Schritt 5) verwendet werden.
5. Imaging und Erwerb von Timelapse Filme
- Einschalten des Lasers und Mikroskop nach Herstellerangaben (zB der Laser muss möglicherweise aufgewärmt für ~ 0,5 Stunden vor dem Experiment).
- Verriegeln Sie den zusammengesetzten Kammer auf die Bühne Einsatz am Mikroskop. Stellen Sie die Temperatur der Wachstumskammer und des Ziels Heizeinrichtung bei 37 ° C oder eine andere gewünschte Wachstumstemperatur.
- Wenn Bildgebung oberhalb der Raumtemperatur, wird der Fokus oder die Gel-Polster in der Regel deutlich driften für ~ 15 min nach der anfänglichen Temperatur-Verschiebung. In der Praxis diese Zeit nutzen, um Bereiche von Interesse zu finden und zu ändern Bildgebung Script als notwendig für ein Experiment.
- Finden Zellen auf dem Mikroskop und Speichern der Position einer jeden Zelle nach Zentrierung er innerhalb eines vordefinierten und ausgerichtet Bildgebungsregion. Mehr als eine Zelle in jeder Bildaufnahmezeit Fenster abgebildet werden. Für timelapse Abbildung über mirgendwelche Generationen, damit abgebildeten Zellen zunächst von anderen Zellen durch mindestens ein paar hundert um getrennt, so dass andere Kolonien nicht betreten wird die Bildgebungsregion während des Wachstums.
- Passen Laseranregung Intensität, so dass fast alle fluoreszierende Moleküle Photobleichmittels innerhalb von 6 Aufnahmen (Abbildung 5).
- Mit Hilfe eines automatisierten Imaging-Skript / journal erwerben timelapse Daten mit Hilfe des Algorithmus in der experimentellen Workflow in Abbildung 3 beschrieben.
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Representative Results
Typische Ergebnisse aus einem Versuch CoTrAC Verfolgen der Herstellung des λ-Repressor CI sind in den 4 und 5 gezeigt. In diesem Experiment wurden 12 Kolonien in 5 min Intervallen abgebildet. Zu jedem Zeitpunkt wurde die erste Kolonie autofocused und zentralisiert innerhalb der Bildgebungsregion. Als nächstes wurde die mittig / fokussierte Position gespeichert und ein Hellfeld Bild erworben wurde. Die Stufe wurde dann von ~ 0,5 um entlang der z-Achse von der transloziert Hellfeld Brennebene zu der Ebene bewegen Winkelhalbierenden der Zellen (ohne Phasen-Kontrast-oder Differential-Interferenz-Kontrast (DIC) Optik können semi-transparenten Objekten bei leicht abzubildenden out-of-Fokusebenen 8). Schließlich wurden sechs Bilder bei 1 sec Intervallen mit jeweils 100 ms Exposition (Abbildung 5 zeigt einen solchen Zeitpunkt) erworben. Dies wurde für alle Zellen zu jedem Zeitpunkt wiederholt. Da fast alle Venus-Moleküle sind zu jedem Zeitpunkt die Fluoreszenz LichtgeschädigteH. Flecken in den 4 und 5 zu Venus Moleküle, (wurde Leuchtstoff) innerhalb der letzten 5 min gereift entsprechen. Venus Moleküle reifen schnell in vivo mit einer Halbwertszeit von 2-7 min ~ 1, 2, 7 und Spaltung durch UBP1 ist sehr effizient 4, 9. Daher kann die Anzahl der Proteinmoleküle seit der letzten Messung genau hergestellt aus der Anzahl von Venus Moleküle auf der Membran gezählt entnehmen.
Abbildung 1. Verwendung CoTrAC um die Expression des Transkriptionsfaktors einzelnen Molekülen zählen. (1) Ein Reporter einschließlich der Membran-Lokalisierungssequenz Tsr, der schnell reifenden YFP Venus und Ubiquitin (Ub) in translationale Fusion mit einem Transkriptionsfaktor aus einem För exprimierter durch den Transkriptionsfaktor reguliert. (2) Die Protease UBP1 cotranslational spaltet das entstehende Polypeptid nach dem C-terminalen Ub Rückstand. (3) Die TSR-Venus-Ub-Reporter an der Membran lokalisiert, wo sie an der einzigen gezählt werden können Molekül-Ebene. (4) Der Transkriptionsfaktor kann seine eigene Expression regulieren. Method Karikatur.
Abbildung 2. Schematische Darstellung der Probenkammer in CoTrAC Experimente verwendet. Cells zwischen Agarosegel Pad und Deckglas gelegt. Microaqueduct Rutsche und Ziel sind bei einer festen Temperatur mit Hilfe eines elektronischen Reglers gehalten. Probenvorbereitung.
Abbildung 3. Workflow eines typischen CoTrAC Experiment. Experigeistige Workflow.
Abbildung 4. Typische timelapse Daten aus einer CoTrAC Experiment. Bilder aus einer einzigen Kolonie bei 25 Minuten-Intervallen dargestellt. In diesem Experiment wurden die Daten alle 5 min von 12 verschiedenen Kolonien erworben. (A) Hellfeld Bildern. (B) Venus (YFP) Fluoreszenzbilds (durchschnittliche Hintergrund zu berücksichtigen Veränderung subtrahiert Hintergrund der gesamten Bildfeld über die Zeit). (C ) Overlay-Bild zeigt Pol Lokalisierung von Tsr-Venus-Ub Reportermoleküle und Heterogenität in der Anzahl der Moleküle in 5 min Zeitfenstern in verschiedenen Zellen (Hellfeld Bildes invertiert wird und Venus Bildes ist bandpaßgefilterten) hergestellt. Anweisungen here für eine größere Abbildung zu sehen.
Abbildung 5. Typische Daten von einem einzelnen Zeitpunkt in einem CoTrAC Experiment. (A) Venus (YFP) Fluoreszenzbildern. Sechs 100 msec Belichtungen wurden zu Beginn eines jeden Zeitintervalls 5 min gewonnen. Jeder der 6 Positionen wurde von 900 ms getrennt, um Zeit für transient dunklen Venus Moleküle, blinzelte off hatte sich fluoreszierende ermöglichen. (B) Für die Analyse, Bild 6 von Bild 1 subtrahiert wird, um für ungebleichte Moleküle und Autofluoreszenz Hintergrund zu korrigieren. Spots in diesem Bild sind auf bestimmte Zelllinien lokalisiert und quantifiziert durch ihre integrierte Fluoreszenzintensität. (C) Die durchschnittliche integrierten Fluoreszenz der Kolonie in A aufgetragen über 6 Bilder (soLidstrich). Montage diese Zeile zu einem exponentiellen Abfall sowie ein konstanter Offset (gestrichelte Linie) gibt einen Zerfall Halbwertszeit von 1 sek. In diesem Experiment Venus Moleküle Photobleichmittel viel schneller als zelluläre Autofluoreszenz, so bedeutet dies, daß etwa die Hälfte der Gesamtzahl der Moleküle Venus in jedem Rahmen sind photogebleichten. Photobleaching Fortschritte auf einem einzelnen Zeitpunkt.
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Discussion
Die CoTrAC Verfahren kann verallgemeinert werden, um die Produktion von anderen Proteinen, wo herkömmliche N-oder C-terminale Fusionen fluoreszierendes Protein-Protein-Aktivität zerstören kann messen. Die CoTrAC Strategie hat drei einzigartige Vorteile gegenüber den derzeitigen Methoden. Erstens sorgt co-translationale Fusion, daß ein Molekül des fluoreszierenden Reporter für jedes Molekül des Proteins von Interesse hergestellt wird, was eine genaue Zählung der Proteinproduktion in Echtzeit. Zweitens die Membran gezielte Reporter Tsr-Venus ermöglicht Einzel-Molekül-Nachweis von fluoreszierenden Reporter, so dass der Nachweis von Proteinen auf sehr niedrigem Niveau exprimiert. Dritten und vor allem kann der cotranslationale Spaltung des fluoreszierenden Reporter das Protein von Interesse an ihren nahen Wildtyp-Sequenz und Funktion behalten normalerweise wobei als Protease-Erkennungssequenz in E. Ubiquitin coli, Zielproteine unterscheiden sich nur von ihrem Wildtyp-Peptidsequenzen, daß die erste N-terminale N </ Em>-Formyl-Methionin zu Methionin verändert.
Bei Verwendung des CoTrAC Verfahren, ist es wichtig zu beachten, dass die CoTrAC Methode die Anzahl der Protein-Moleküle produziert misst bei jedem 5-min Zeitfenster (dh die, welche unterscheidet sich von der Messung der Anzahl von Protein-Moleküle pro Zelle vorliegen Proteinkonzentration). Die meisten Single-Cell-Fluoreszenz-Gen-Expression Assays Maßnahme Proteinkonzentration, die das ausgewogene Ergebnis der Protein-Produktion und Abbau ist. Daher muss die Abbaugeschwindigkeit des Proteins von Interesse sorgfältig betrachtet werden, wenn die Konzentration Messung dient zur Proteinproduktion Informationen herzuleiten. Darüber hinaus ist Proteinkonzentration unterliegt Schwankungen, die durch die Partitionierung des Proteins zwischen zwei Tochterzellen bei der Zellteilung, die erheblich sein für Low-Ausdruck-Level-Proteine und können fälschlicherweise als aus Protein-Produktion Dynamik interpretiert verursacht. Die CoTrAC Methode kann modi seinFied zur Proteinkonzentration nicht Photobleaching neu produzierten Reportermoleküle messen, aber das muss mit zusätzlichen Kontrolle durchgeführt werden. Man muss überprüfen, ob die Abbauraten der fluoreszierenden Reporter und dem Protein von Interesse ähnlich sind, und daß sie sowohl in ähnlicher Weise in zwei Tochterzellen auf Zellteilung partitioniert, so dass die Konzentration des fluoreszierenden Reporter jene des Proteins von Interesse reflektiert.
Wir bemerken, dass, während die CoTrAC nicht ändert die Proteinsequenz, die Zugabe des Reportergens die mRNA-Sequenz ändert. Daher Transkription und Translation Dynamik und / oder mRNA-Transkript Abbauraten kann gestört werden. Wenn die CoTrAC Verfahren dient zur Proteinproduktion in dem Wildtyp-Kontext zu beobachten, ist es wichtig, Expressionsniveaus des Zielproteins sowohl in seiner Wildtyp-Sequenz und mit der CoTrAC fluoreszierende Fusionsprotein-Tag (z. B. in ref vergleichen. 1 verglichen wir CI Ausdruck in unserem CoTrAC Baut auf, dass in einem Wildtyp-Lysogen). Nachfolgend diskutieren wir Überlegungen notwendig Verallgemeinerung der CoTrAC Methode.
Zuerst diskutieren wir die Möglichkeit der Verwendung von Sequenzen als TSR-Venus-Ub. Die allgemeinen Anforderungen sind: (1) der Reporter müssen bis zu einem gewissen Position innerhalb der Zelle lokalisiert werden, so dass es nicht diffuse schnell (mit TSR, sind Reporter an den Zellpolen 1). Dies ist notwendig für Detektion einzelner Moleküle eines fluoreszierenden Proteins Molekül als dem Signal eines schnell diffundierenden fluoreszierendes Protein-Molekül wird in der Regel nicht erkennbar oberhalb einer Zelle autofluoreszierenden Hintergrund; (2), wobei das fluoreszierende Protein muss ausreichend hell, um auf die erfaßte werden einzelnen Molekülen und muss reifen (geworden Leuchtstoff) schnell genug für die gewünschte Anwendung (Venus ist die schnellste frühreifend Fluoreszenzprotein bisher 7), (3), wobei das fluoreszierende Protein muss nach Detektion photogebleichten werden, so dass neu fluoreszierende Proteine können degeschützt an nachfolgenden Zeitpunkten (fluoreszierenden Proteinen, die übermäßig gegen Ausbleichen sind unerwünscht, da übermäßige Laserbelichtung kann Phototoxizität Artefakte verursachen), (4), die Protease Erkennungssequenz nicht verlassen können alle restlichen Aminosäuren auf der Protein von Interesse, dass seine Funktionalität stören (UBP1 spaltet unmittelbar nach dem carboxyterminalen Ub Rückstand, so dass keine zusätzliche Reste überhaupt).
Zweitens muss man sicherstellen, dass der Reporter richtig exprimiert und gespalten. Proteolytische Spaltung Trennen des Reporter von dem Protein von Interesse muss effizient; Spaltungseffizienz kann unter Verwendung Westernblots gegen den Reporter, das Protein von Interesse oder beides (Antikörper sind kommerziell für viele fluoreszierende Proteine wie der Anti-GFP-Antikörper vorhanden sein JL- 8 von Clontech, die Venus bindet in Western-Blot). Man sollte sicherstellen, dass kein ungespaltenes Fusionsprotein in Blots gegen Lysaten von Zellen, die das Fusionsprotein detektiertenProtein bei höheren als den in CoTrAC Experimenten erwartet. Außerdem muss der Reporter und Protein von Interesse im Verhältnis 1:1 nach Spaltung erzeugt werden. Dies kann durch Messen der Intensitäten der gespaltenen Bänder in Anti-Reporter und Anti-Protein-von-Interesse-Western-Blots von den Intensitäten der Banden im ungespaltenen Stämme fehlt Protease normalisiert überprüft werden. Wenn Reporter und Protein von Interesse sind im Verhältnis 1:1 nach der Spaltung vorhanden ist, dann:
Man beachte, daß Westernblots Maßnahme Proteinkonzentration, wird das resultierende Verhältnis von 1:1 abweichen, wenn der Reporter und das Protein von Interesse weisen unterschiedliche Abbaugeschwindigkeiten nach Spaltung.
Drittens sollte ein verifizieren, dass das Protein von Interesse ihrer erwarteten Funktionalität aufweist nach der Spaltung. Das Vorhandensein der großen Reporterkonstrukt Fusion und / oder Lokalisierung an der Zellmembran wird erwartet, dass die meisten Transkriptionsfaktoren Inaktivierung (die λ-Repressor CI war completely inaktive ohne UBP1 Ausdruck in unseren Experimenten 1). Transformation des Protease-exprimierenden Plasmid sollte das Protein von Interesse durch Freisetzung des Proteins aus der sperrig Translationsfusion tag aktivieren. Dieses Phänomen führt zu anderen möglichen CoTrAC Anwendungen. Spaltung an der Ub Carboxyterminus durch UBP1 wurde verwendet, um nicht-kanonischen Aminosäure-terminalen Aminosäuren freizulegen, um die bakterielle N-Ende Regel des Proteinabbaus 9 verdeutlichen. Wenn die Fusion an einem großen, membranassoziierten Reporter inaktiviert einen Transkriptionsfaktor (oder ein anderes Protein, wie ein Enzym), könnte ihre Aktivität schnell durch Induzieren Proteaseexpression zurückgewonnen werden. CoTrAC könnte verwendet werden, um sehr schnell einem bereits vorhandenen Pool von Transkriptionsfaktoren "einschalten" durch Entfernen / Hinzufügen eines Inhibitors / Co-Aktivator oder ansonsten Initiieren Protease Expression oder Aktivität werden. Schließlich kann die Expression des fluoreszierenden Reporter stören Zellphysiologie und es sollte sichergestellt werden, dass Eigenschaften wie ZelleZykluszeit sind unberührt; in dem Experiment in Lit. beschrieben. 1, nutzten wir die Tsr Protein als Membran-localization sequence, weil Tsr ist bereits ein stark exprimiertes Membranprotein und eine geringe Erhöhung der Tsr Ausdruck wurde nicht erwartet, dass das Verhalten der Zelle beeinflussen.
Viertens, wenn eine Reportersequenz andere als die konkret erläutert Tsr-Venus-Ub verwendet wird, sollte die entsprechende Bildgebungsprotokoll auch nach Bedarf modifiziert werden. Beispielsweise werden verschiedene fluoreszierende Proteine benötigen unterschiedliche Ausleuchtung Protokolle, eine gute Balance zwischen effizient Erfassen fluoreszierendes Protein-Moleküle, Phototoxizität von Laserbelichtung und Photobleichen erreichen. Idealerweise sollte Laseranregung bei der Absorptionsspitze des gewählten fluoreszierende Protein sein; Nebenzeit Anregung erfordert höhere Anregungsintensitäten (und damit höhere Phototoxizität und Autofluoreszenz Hintergrund), um die gleiche Fluoreszenzprotein Emission und Photobleichen Eigenschaften zu erzielen. Auch dieBildgebungsfrequenz können modifiziert werden langsamer oder schneller als 5 min in Abhängigkeit von der Toleranz der Zellen an die Phototoxizität von Laserbelichtung werden. In unseren Experimenten 12 separate E. coli-Kolonien wurden alle 5 min bebildert und anschließend für 7-8 Zellzyklen vor Beobachtung erhebliche Phototoxizität Mängeln 1.
Schließlich wird nach Zeitrafferclips der Proteinproduktion in einem Experiment CoTrAC (Beispiele in 4 und 5 gezeigt) erfasst, muss fluoreszierendes Protein Expression durch Detektieren Fluoreszenzpunkte entsprechend einem oder mehreren Molekülen, Molekülen Zuweisen zu einzelnen Zellen und quantifiziert werden Tracking-Zelllinien. Wir haben eine eigene Matlab-Routine beschrieben, um λ Repressor CI Produktion 1 studieren. Kurz gesagt, muss man zunächst feststellen, die Umrisse von einzelnen Zellen und Zeitpunkten entsprechende Zellteilung im Hellfeld Bilder während Tracking Zelllinien durch nachfolgende Bildrahmens. Wir fanden, dass ein 5 min Zeitintervall ausreichend kurz, dass eine Zelle in einem Rahmen in der Regel entsprach der Zelle in dem vorangehenden Rahmen, mit dem es teilten sich die meisten Pixel in einem segmentierten Bild war. In Fällen, in denen gelegentlich große Verschiebungen von Kolonien zwischen zwei aufeinanderfolgenden Frames beobachtet wurden, wurde manuellen Zuordnung einzelner Zellen an ihrer Linien erforderlich. Weiter muss man fluoreszierende Flecken zu identifizieren und zu quantifizieren, deren Intensität. Wir fanden, dass fluoreszierende Punkte von (1) Bandpass-Filtern des Fluoreszenzbilds auf niederfrequente Fluoreszenz Hintergrund zu entfernen (zB Autofluoreszenz) und hochfrequentes Rauschen, (2) Schwellwertbildung des Bildes basierend auf Fluoreszenzintensität und (3) Identifizieren von Objekten identifiziert werden größer als einige Pixel in der Schwellenbilds. Die Objekte in der Schwellenbilds wurden zu einem 2-dimensionalen Gauß-Funktion sowie einer konstanten Hintergrund passen, und die integrierte Intensität des Spots wurde als das Produkt der Passung Amplitude und der Varianz entnommen.In unseren Experimenten mehreren Tsr-Venus-Ub Reportern oft Zellpole kolokalisiert, wodurch Spots, die heller als die aus einzelnen Tsr-Venus Moleküle waren. Die Anzahl der Moleküle innerhalb eines Venus Spot wurde durch Dividieren der integrierten Intensität des Flecks von der Fluoreszenzintensität einer einzigen Venus-Molekül, das durch die Verwendung eines niedrigen Ausdruck Ebene Stamm, worin Spots enthalten selten mehr als ein fluoreszierendes Protein quantifiziert wurde quantifiziert Molekül. Diese Messung kann mit weiteren in-vitro-Messungen der einzelnen fluoreszierenden Protein-Moleküle haften an einem Objektträger ergänzt werden. Wir haben gefunden, dass fluoreszierende Protein Eigenschaften weitgehend ähnlich in in vivo und in vitro-Systeme mit ähnlichen Pufferbedingungen sind.
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Disclosures
Wir haben keine Angaben.
Acknowledgments
Das Plasmid pCG001 Ausdruck UBP1 wurde freundlicherweise von Rohan Baker an der John Curtin School of Medical Research. Diese Arbeit wurde von March of Dimes Research Grant 1-FY2011, March of Dimes Basil O'Connor Starter Scholar Research Award # 5-FY20 und NSF CAREER Award 0.746.796 finanziert.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Agarose (Low melting temperature) | Lonza | 50100 | |
| Milli-Q H2O | |||
| 5×M9 salts | Following recipe described in 9 | ||
| 20% glucose | |||
| MgSO4 | |||
| CaCl2 | |||
| 50×MEM amino acid solution | Invitrogen | 11130-051 | |
| Temperature-Controlled Growth Chamber Stage adaptor |
Bioptechs | FCS-2 | |
| Objective Heater | Bioptechs | Model depends on microscope objective | |
| Microaqueduct Slide | Bioptechs | 130119-5 | |
| Micro cover glasses | VWR | 40CIR-1 | Can be difficult to source; also available from Bioptechs |
| Cover glass/slide gasket | Bioptechs | FCS2 0.75 mm | |
| Fluorescence Microscope | Various | Example setup: Coherent Innova 308C Argon-ion laser, Olympus IX-81 microscope, Olympus PlanApo 100X NA 1.45 objective, Metamorph software | Must have laser excitation, automated xyz stage, automation software capable of scripted imaging and autofocus, optics capable of resolving single fluorescent proteins |
| EM-CCD Camera | Various | Example setup: Andor Ixon DU-898 | Must have sufficiently low noise to detect single fluorescent proteins above background |
References
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