הדמית מולקולה הבודדה של רגולציה גנטית Published: March 15, 2013 doi: 10.3791/50042

DOI

Automatic Translation

• English (Original)
• العربية (Arabic)
• 中文 (Chinese)
• dansk (Danish)
• Nederlands (Dutch)
• français (French)
• Deutsch (German)
• עברית (Hebrew)
• हिंदी (Hindi)
• italiano (Italian)
• 日本語 (Japanese)
• 한국어 (Korean)
• norsk (Norwegian)
• português (Portugese)
• русский (Russian)
• español (Spanish)
• svenska (Swedish)
• Türkçe (Turkish)

Zach Hensel¹, Xiaona Fang^1,2,3, Jie Xiao¹

¹Department of Biophysics and Biophysical Chemistry, Johns Hopkins University School of Medicine, ²Changchun Institute of Applied Chemistry, Chinese Academy of Sciences, ³Department of Physics, Jilin University

Summary

אנו מתארים שיטת מיקרוסקופיה הפעלת פלואורסצנטי, Co-Translational ידי מחשוף (CoTrAC), לתמונת הייצור של מולקולות חלבון בתאים חיים עם דיוק מולקולה בודדה ללא perturbing הפונקציונלי של החלבון. שיטה זו נמצאת בשימוש אחרי דינמיקת הביטוי האקראית של גורם שעתוק, λ repressor CI

Abstract

אנו מתארים שיטת מיקרוסקופיה הפעלת פלואורסצנטי, Co-Translational ידי מחשוף (CoTrAC) לתמונת הייצור של מולקולות חלבון בתאים חיים עם דיוק מולקולה בודדה ללא perturbing הפונקציונלי של החלבון. שיטה זו מאפשרת לספור את המספרים של מולקולות חלבון היוצר בתא אחד בחלונות זמן רציפים של חמש דקות. זה דורש מיקרוסקופ פלואורסצנטי עם צפיפות הספק עירור ליזר של ~ 0.5-1 קילוואט / ² סנטימטר, שהוא רגיש מספיק כדי לזהות מולקולות חלבון ניאון בודדות בתאים חיים. כתב הניאון בשימוש בשיטה זו מורכב משלושה חלקים: רצף קרום מיקוד, מהר התבגרות חלבון, צהוב ניאון ורצף הכרת פרוטאז. הכתב הוא התמזג translationally לN-הסופי של חלבון של עניין. תאים גדלים על במת מיקרוסקופ טמפרטורה מבוקרת. כל חמש דקות, מולקולות ניאון בתוך תאים הם צלמו (ומאוחר יותר שיתוףunted על ידי ניתוח תמונות פלואורסצנציה) ולאחר מכן photobleached כך שחלבונים שתורגמו רק לאחרונה נספרים במדידה הבאה.

תמונות פלואורסצנציה נובעות משיטה זו ניתן לנתח על ידי איתור נקודתי ניאון בכל תמונה, הקצאתם לתאים בודדים ולאחר מכן הקצאת תאים לשושלות תאים. מספר חלבונים המיוצרים בתוך חלון זמן בתא נתון מחושב על ידי חלוקת עוצמת הקרינה המשולבת של כתמים מהעוצמת הממוצעת של מולקולות ניאון בודדות. אנחנו השתמשנו בשיטה זו כדי למדוד את רמות ביטוי בטווח של 0-45 מולקולות ב 5 חלונות זמן דקות בודדות. שיטה זו אפשרה לנו למדוד את הרעש בביטוי של λ repressor CI, ויש יישומים פוטנציאליים רבים אחרים בביולוגית מערכות.

Protocol

1. זרימת עבודת הנדסת מתח

1. הכנס קידוד רצפים () רצף קרום לוקליזציה, (ב) חלבון מהיר התבגרות פלורסנט ו( ג) רצף הכרת פרוטאז N-מסוף ולמסגרת עם חלבון של עניין (גורם שעתוק לדוגמה). אנחנו השתמשנו הקרום הממוקד כתב ^TSR-2 ונוס והתמזגנו זה ברצף פרוטאז הכרת יוביקוויטין (UB) לספור את מספר המולקולות הביעו bacteriophage λ מדכאי CI חלבון. פרטים על אופן בו אנו נבנינו חלבון היתוך TSR-ונוס-UB-CI, החלפה פרועה סוג קידוד CI אזור ושילוב המבנה לE. כרומוזום חיידק באמצעות רקומבינציה λ האדום ^3, מתואר בפירוט בנ"צ. 1.
2. לאמת את כל השינויים ברצף.
3. להפוך קידוד פלסמיד פרוטאז ספציפי לרצף ההכרה בשימוש מעל לתוך זן מבטא את הכתב והחלבון פלואורסצנטי של ענייןבהיתוך translational. אנחנו השתמשנו פרוטאז Ubp1, שחותך מייד לאחר שאריות יוביקוויטין C-מסוף ^4.

2. תאי תרבות ולהתכונן לדוגמה

1. בחר אחד E. מושבת coli ריבית מצלחת אגרה טרי מפוספסת למיליליטר M9 מדיה 1 מינימאלית ⁵ בתוספת חומצות אמינו 1X ממ ואנטיביוטיקה מתאימה. דגירה בייקרה בטמפרטורה רצויה מספיק זמן כדי להגיע OD _600> 1.0 (צפיפות אופטית ב 600 ננומטר).
2. דלל את התרבות למדיום M9 טרי 1 מ"ל באנטיביוטיקה מתאימה לOD ₆₀₀ = 0.02. דגירה בייקרה בטמפרטורה המתאימה. צפיפות תאית ראשונית ניתן להגדיל במידת צורך לצמיחה בטמפרטורה נמוכה.
3. כאשר OD ₆₀₀ = 0.2-0.3 (ב 37 ° C עם תרבית תאים ראשונית בOD ₆₀₀ = 0.02, זה ייקח שעתי 3-4), להתחיל להכין את agarose ג'ל הכרית (שלב 3).
4. התאים מוכנים להדמיה כאשר OD
5. העברת התרבות דגרה 1 מ"ל לתוך צינור 1.5 מ"ל microcentrifuge, צנטריפוגה ב -10,000 XG לדקות 1 בmicrocentrifuge benchtop.
6. בטל supernatant ולהוסיף בינוניים M9 מ"ל טרי 1 וresuspend הגלולה בעדינות.
7. צנטריפוגה ב -10,000 XG לדקות 1.
8. חזור על השלב 1.6 ו 1.7. השלך את supernatant.
9. resuspend עדינות במיליליטר M9 מדיה 1. תאים יכולים לשמש ישירות להדמית מיקרוסקופ או 10 מדוללים - ל100-קיפול על מנת להבטיח צפיפות נמוכה של תאים להדמית timelapse. שים לב שהצפיפות נמוכה של תאים חשובות להדמית timelapse מורחבת. חדר ההדמיה (שלב 4) הוא חתום במהלך הניסוי. בשל גידול המעריכי של תאים, תאי ריכוזים ראשוניים גבוהים באופן משמעותי יכולים לרוקן חמצן בתוך התא לאחר צמיחה ממושכת בכרית ג'ל, הפחתת הבשלת החלבון פלואורסצנטי ומשפיע על גדילת תאים.

3. הכן את פתרון agarose

1. שוקל 10-20 מ"גהיתוך בטמפרטורה הנמוכה agarose לתוך צינור microcentrifuge 1.5 מ"ל.
2. הוסף מדיום המתאים M9 נפח מינימאלי ללא אנטיביוטיקה לעשות 3% פתרון agarose.
3. מחמם את פתרון agarose למשך 30 דקות ב 70 מעלות צלזיוס כדי להמס, היפוך הצינור כדי להבטיח שהפתרון הוא לגמרי נמס והומוגנית. כרית ג'ל אפשר לשפוך בשלב זה (שלב 4) או הטמפרטורה יכולה להיות ירידה ל 50 מעלות צלזיוס והחזיקה למשך מספר שעות לשימוש מאוחר יותר.

4. הכן Pad ג'ל בלשכה

1. אודות 50 דקות לפני ההדמיה, לשטוף שקופית Microaqueduct עם מים.
2. לשטוף 1 ניקה מכסה זכוכית (באמצעות שיטת ניקוי מחמירה כמו זו המתוארת ^ב6) וMicroaqueduct שקופית עם מים סטריליים ויבשים על ידי נשיפה עם אוויר דחוס.
3. הנח את אטם הגומי בשקופית Microaqueduct כך שהוא מכסה את פתחי כניסה ושקעים בצד כוס שקופית Microaqueduct (זה יכול להיות שונה עבור יישומיםשתקשורת היא perfused באמצעות המדגם). החל פתרון 50 μl agarose (שלב 3) למרכז שקופית Microaqueduct.
4. למעלה פתרון agarose עם ניקה זכוכית, היבשה הכיסוי.
5. בואו פתרון agarose לעמוד בטמפרטורת חדר למשך 30 דקות.
6. בינתיים מכין מדגם תא (שלב 2).
7. זהירות לקלף את מכסה הזכוכית מהחלק העליון של כרית ג'ל. הוסף תרבית תאים שטופה μl 1.0 לחלק העליון של כרית ג'ל. חכה ~ 2 דקות לתרבות להיספג על ידי כרית ג'ל. חשוב לא לחכות זמן רב כל כך שoverdries הכרית ג'ל, אבל ארוך מספיק כדי שתאים מודבקים היטב למשטח ג'ל. זמן ההמתנה האידיאלי ישתנה בהתאם לטמפרטורה ולחות.
8. בזמן המתנה, לייבש מכסה זכוכית precleaned אחרת.
9. כסה את המדגם עם מכסה הזכוכית החדשה להבטיח כי מכסה הזכוכית ושקופית Microaqueduct מיושרות היטב.
10. להרכיב את חדר צמיחה בטמפרטורה המבוקרת בהתאם להוראות היצרן.עכשיו זה יכול לשמש להדמיה במיקרוסקופ (שלב 5).

5. הדמיה ורכישת סרטי timelapse

1. הפעל את הליזר ומיקרוסקופ בעקבות הוראות היצרן (למשל הליזר ייתכן שיצטרך התחמם במשך ~ 0.5 שעות לפני הניסוי).
2. נעל את החדר כנס להוספת השלב במיקרוסקופ. הגדר את הטמפרטורה של חדר הצמיחה והתנור בטמפרטורה האובייקטיבי צמיחה רצויה אחרת 37 ° C או.
3. אם הדמיה מעל טמפרטורת חדר, המיקוד או כרית ג'ל בדרך כלל נסחף באופן משמעותי ל~ 15 דקות אחרי שינוי הטמפרטורה ההתחלתית. בפועל, להשתמש בזמן הזה כדי למצוא אזורים של עניין ולשנות תסריטי הדמיה לפי צורך לניסוי.
4. מצא את התאים במיקרוסקופ ולאחסן את המיקום של כל תא לאחר שמרכזו בתוך אזור מוגדר מראש הדמיה ומיושרת. יותר מתא אחד יכול להיות צלם בכל חלון זמן רכישת תמונה. לtimelapse הדמיה מעל מ 'דורות כלשהם, ודאו כי תאי הדמיה מופרדים בתחילה מתאים אחרים בלפחות כמה מאה מיקרומטר כך שמושבות אחרות לא להיכנס לאזור ההדמיה במהלך צמיחה.
5. התאם עוצמת עירור ליזר, כך שכמעט כל photobleach ניאון המולקולות בתוך 6 חשיפות (איור 5).
6. באמצעות הסקריפט אוטומטי הדמיה / יומן, איסוף נתוני timelapse שימוש באלגוריתם שתואר בעבודה הניסיונית באיור 3.

Representative Results

תוצאות אופייניות מניסוי CoTrAC מעקב הייצור של λ repressor CI מוצגות באיורי 4, 5. בניסוי זה, 12 מושבות צלמו במרווחי 5 דקות. בכל נקודת זמן, מושבת autofocused הראשון ורכזה בתוך אזור ההדמיה. בשלב הבא, העמדה במרכז / ממוקד הייתה מאוחסנת ותמונת brightfield נרכשה. אז הבמה הייתה translocated ידי ~ 0.5 מיקרומטר לאורך ציר Z-לעבור ממישור המוקד של brightfield למטוס ומפריד בין התאים (ללא שלב ניגוד או לעומת פער התערבות (DIC) אופטיקה, חפצים שקופים למחצה ניתן הדמיה במעט מטוסים מחוץ לפוקוס ^8). לבסוף, שש תמונות נרכשו ב1 מרווחי שנייה, כל אחד עם חשיפת 100 אלפיות שנייה (איור 5 מראה נקודת זמן אחת כזו). זה חזר על עצמו לכל תאים בכל נקודת זמן. מכיוון שכמעט כל מולקולות ונוס הם photobleached בכל timepoint, הנורותנקודתי אחוז באיורי 4, 5 מתאימות למולקולות ונוס שהבשילו (הפך ניאון) בתוך 5 הדקות האחרונות. מולקולות ונוס להתבגר במהירות בvivo עם זמן מחצית חיים של ~ ^02-07 ינואר ^{דקות, 2, 7} ומחשוף ידי Ubp1 הם מאוד יעיל ^{4, 9.} לכן, מספר מולקולות חלבון היוצר מאז המדידה האחרונה ניתן להסיק באופן מדויק ממספר מולקולות ונוס נספרו על הממברנה.

איור 1. שימוש CoTrAC לספור את הביטוי של מולקולות בודדות גורם שעתוק. (1) כתב כולל TSR קרום לוקליזציה הרצף, YFP ונוס מהר בגר, ויוביקוויטין (UB) בא לידי הביטוי בהיתוך translational עם גורם שעתוק מPromotאה מוסדר על ידי גורם השעתוק. (2) פרוטאז Ubp1 שיתוף translationally cleaves פוליפפטיד המתהווה אחרי שאריות UB C-המסוף. (3) כתב TSR-ונוס-UB localizes אל הקרום שבו ניתן לספור באחת מולקולת רמה. (4) גורם השעתוק יכול לווסת ביטוי משלו. קריקטורת שיטה.

איור 2. תאים סכמטי של תא מדגם המשמש בניסויי CoTrAC. ממוקמים בין משטח agarose ג'ל וכיסוי זכוכית. שקופית Microaqueduct ואובייקטיבי מוחזקות בטמפרטורה קבועה באמצעות בקר אלקטרוני. הכנת דוגמאות.

איור 3. זרימת עבודה של ניסוי CoTrAC טיפוסי. Experiעבודה נפשית.

איור 4. נתונים אופייניים timelapse מניסוי CoTrAC. תמונות ממושבה אחת מוצגים במרווחי 25 דקות. בניסוי זה, נתונים נרכשו כל 5 דקות מ12 מושבות שונות. () תמונות brightfield. (ב ') תמונת ונוס (YFP) פלואורסצנטי (רקע ממוצע נגרע לחשבון לשינוי ברקע של כל תחום הדמיה לאורך זמן). (C ) כסה תמונה מראה לוקליזציה קוטב של מולקולות TSR-ונוס-UB כתב והטרוגניות במספר מולקולות המיוצרות ב 5 דקות חלונות זמן בתאים שונים (תמונת brightfield היא הפוכה ותמונת ונוס היא מסוננת bandpass). לחץ hפה כדי להציג דמות גדולה.

איור 5. נתונים אופייניים מנקודת זמן אחת בניסוי CoTrAC. (A) ונוס (YFP) תמונות פלואורסצנטי. שש 100 חשיפות msec נרכשו בתחילתו של כל פרק זמן דקות 5. כל אחד מ6 החשיפות הופרד על ידי 900 אלפיות שני כדי לאפשר למולקולות ונוס transiently כהות שכבה להיות ניאון. (ב ') לניתוח, תמונה 6 נגרעה מתמונת 1 כדי לתקן עבור מולקולות מולבנות ורקע autofluorescence. כתמים בתמונה זו המותאמת לשפה מקומיות לשושלות תאים ספציפיות ולכמת את עוצמת הקרינה המשולבת שלהם. (C) פלואורסצנטי משולב הממוצע של המושבה בזמם מעל 6 תמונות (כךקו מכסה). מניח שורה זו לדעיכה מעריכית בתוספת קבועה קיזוז (קו מקווקו) נותן ריקבון בחץ המשרה של 1 שניות. בניסוי זה, ונוס photobleach מולקולות הרבה יותר מהר מautofluorescence הסלולרית, אז זה אומר שכמחצית מהמספר הכולל של מולקולות ונוס הם photobleached בכל מסגרת. Photobleaching התקדמות בנקודת זמן אחת.

Discussion

שיטת CoTrAC ניתן להכליל למדוד את הייצור של חלבונים אחרים כאשר N-או קונבנציונלי fusions החלבון פלואורסצנטי C-מסוף עלול לשבש את פעילות חלבון. אסטרטגית CoTrAC יש שלושה יתרונות ייחודיים על פני שיטות קיימות. ראשית, ההיתוך משותף translational מבטיח שמולקולה אחת של כתב הניאון מיוצרת עבור כל מולקולה של החלבון של עניין, המאפשרת ספירה מדויקת של ייצור חלבון בזמן אמת. שנית, כתב קרום הממוקד TSR-ונוס מאפשר זיהוי מולקולה הבודדה של כתבי ניאון, המאפשר זיהוי של חלבונים מתבטאים ברמות נמוכות מאוד. שלישי והכי חשוב, המחשוף משותף translational של כתב הניאון מאפשר את החלבון של ריבית כדי לשמור על רצף ותפקוד כמעט פראי מסוגו בדרך כלל באמצעות-יוביקוויטין כרצף פרוטאז הכרה בE. coli, חלבוני היעד שונה רק מרצפים פפטידים פראי מסוגם שבN-מסוף N הראשון </ Em>-formyl-מתיונין משתנה למתיונין.

בעת שימוש בשיטת CoTrAC, חשוב לזכור כי שיטת CoTrAC מודדת את מספר מולקולות חלבון מיוצר בכל חלון זמן 5-דקות, והוא שונה מהמדידה של מספר מולקולות חלבון לכל תא בהווה (כלומר חלבון ריכוז). מבחני ריכוז רוב התא בודד פלואורסצנטי ביטוי גני מדד חלבון, שהוא התוצאה המאוזנת של ייצור חלבון ושפלה. לכן, קצב הפירוק של החלבון של עניין יש לשקול בזהירות אם מדידת הריכוז משמש להסיק מידע ייצור חלבון. יתר על כן, ריכוז חלבון נתונה לתנודות הנגרמות על ידי מחיצות של החלבון בין שני תאי בת בחלוקת תא, שעשויה להיות משמעותיות לחלבוני ביטוי ברמה נמוכה וטעות פרשו כנובעות מדינמיקת ייצור חלבון. שיטת CoTrAC יכולה להיות מודיםfied למדוד ריכוז חלבון על ידי לא photobleaching מולקולות כתב הופקו לאחרונה, אבל זה חייב להיעשות בבדיקה נוספת. יש לוודא כי השיעורים הפגומים של כתב הניאון והחלבון של עניין דומים, וכי הם גם מחולקים למחיצות באופן דומה לשני תאי בת על חלוקת תא, כך שריכוזו של כתב הניאון משקף זה של החלבון של עניין.

יש לציין כי בעוד CoTrAC אינו משנה את רצף החלבון, תוספת של גן הכתב משנה את רצף ה-mRNA. שיעורי שפלת תעתיק mRNA לכן, שעתוק ותרגום דינמיקה ו / או עשוי להיות מוטרדים. אם שיטת CoTrAC משמשת לייצור חלבון להתבונן בהקשר פרוע הסוג, חשוב להשוות את רמות ביטוי של חלבון המטרה הוא ברצף שלו פרוע ועם סוג תג היתוך ניאון CoTrAC (למשל בנ"צ. 1 השווינו CI הביטוי בCoTrAC construcלא לזה שבlysogen פראי מסוג). להלן אנו דנים שיקולים דרושים להכללת שיטת CoTrAC.

ראשית, אנו דנים באפשרות של שימוש ברצפים אחרים מאשר TSR-ונוס-UB. הדרישות הכלליות הן: (1) הכתב חייב להיות מותאם אישית למיקום מסוים בתוך התא, כך שהוא אינו מפוזר במהירות (עם TSR, כתבים הם בקטבי התא ^1). זה הכרחי לזיהוי מולקולה הבודדה של מולקולת חלבון פלואורסצנטי כאות ממולקולת חלבון פלואורסצנטי מהירות לשדר בדרך כלל לא ניתן יהיה להבחין מעל רקע autofluorescent של תא; (2), החלבון פלואורסצנטי חייב להיות בהיר מספיק כדי להיות מזוהה על רמת מולקולה בודדה וחייבות להבשיל (הפך ניאון) במהירות מספקת ליישום הרצוי (ונוס הוא החלבון פלואורסצנטי התבגרות-המהירה ביותר עד כה ^7), (3), חלבון פלואורסצנטי יש photobleached לאחר זיהוי, כך שחלבונים שזה עתה הניאון יכולים להיות דהtected בנקודתי הזמן באות (חלבוני ניאון יתר על מידה עמידות לphotobleaching אינם רצויים כחשיפת ליזר מוגזמת יכול לגרום לחפצי phototoxicity); (4), את רצף הכרת פרוטאז לא יכול להשאיר את כל חומצות האמין שיורית בחלבון של עניין שמטריד את הפונקציונליות שלו (Ubp1 דבק מייד לאחר שאריות UB Carboxy-המסוף, לא משאיר שאריות מיותרות בכולם).

שנית, יש לוודא שהכתב מתבטא כראוי והבקיע. מחשוף פרוטאוליטי הפרדת הכתב מהחלבון של עניין חייב להיות יעיל; יעילות מחשוף ניתן למדוד באמצעות כתמים מערביים נגד הכתב, החלבון של ריבית או שניהם (נוגדנים זמינים מסחריים לחלבונים רבים ניאון כגון אנטי GFP נוגדני JL- 8 מClontech, אשר נקשר ונוס במערב כתם). יש לוודא ששום חלבון היתוך uncleaved הוא זוהה בכתמים נגד lysates של תאים המבטא את ההיתוךחלבון ברמות גבוהות יותר מאלו שנצפו בניסויי CoTrAC. כמו כן, הכתב והחלבון של עניין חייב להיות מיוצרים על יחס של 1:1 אחרי מחשוף. זה ניתן לבדוק על ידי מדידת עוצמותיהן של הלהקות בקעו ב- כתב אנטי וכתמים מערביים אנטי-חלבונים של ריבית נורמליות לאור העוצמות של להקות uncleaved בזנים חסרי פרוטאז. אם כתבת וחלבון של עניין נמצאת ביחס של 1:1, לאחר מחשוף, ואז:

שים לב כי מאז ריכוז חלבון מערבי כתמי מידה, יחס כתוצאה יסטה מ01:01 אם הכתב והחלבון של עניין מפגינים שיעורי שפלה שונים לאחר מחשוף.

שלישית, יש לוודא שהחלבון של עניין מציג פונקציונלי הצפויה שלו אחרי מחשוף. נוכחותו של הכתב הגדול לבנות היתוך ו / או לוקליזציה לממברנת התא צפוי להשבית גורמי שעתוק רוב (λ repressor CI היה שותףmpletely פעיל ללא Ubp1 ביטוי בניסויים שלנו ^1). טרנספורמציה של פלסמיד פרוטאז מבטא צריכה להפעיל את החלבון של עניין על ידי שחרור החלבון מתג ההיתוך translational המגושם. תופעה זו מעוררת יישומי CoTrAC אפשריים אחרים. מחשוף בתחנה הסופית Carboxy UB ידי Ubp1 נעשה שימוש כדי לחשוף את חומצות אמינו אמין מסוף ה"לא להבהיר את כלל N-סוף החיידקים של פירוק חלבונים ^9. אם ההיתוך, כתב גדול קרום הקשורים inactivates גורם שעתוק (או חלבון אחר כגון אנזים), פעילותו יכולה להיות התאוששה במהירות על ידי ביטוי פרוטאז ישכנע. CoTrAC יכול לשמש לקצב מהיר מאוד "להפעיל" ברכת preexisting של גורמי שעתוק על ידי הסרה / הוספת מעכב / שיתוף activator או אחר ייזום ביטוי פרוטאז או פעילות. לבסוף, ביטוי של כתב הניאון עשוי לטרוד תא פיזיולוגיה ויש להבטיח שמאפיינים כגון תאזמן המחזור אינו מושפע; בניסוי המתואר בנ"צ. 1, השתמש בחלבון TSR כרצף קרום לוקליזציה בגלל TSR כבר הביע חלבון מאוד קרום ועלייה קטנה בביטוי TSR לא צפוי להשפיע על התנהגות תא.

הרביעית, כאשר רצף כתב אחר מאשר דן במיוחד TSR-ונוס-UB משמש, פרוטוקול ההדמיה המתאימה צריך גם להיות שונה בהתאם לצורך. לדוגמה, חלבוני ניאון שונים ידרשו פרוטוקולי תאורה שונים כדי להשיג איזון טוב בין איתור יעיל מולקולות חלבון ניאון, phototoxicity מחשיפת הליזר וphotobleaching. באופן אידיאלי, עירור ליזר צריך להיות בשיא הספיגה של החלבון פלואורסצנטי נבחר; עירור מחוץ לשיא דורש עוצמות עירור גבוהות יותר (וphototoxicity כך גבוה ורקע autofluorescence) כדי להשיג את אותה פליטת החלבון פלואורסצנטי ומאפייני photobleaching. כמו כן,תדירות הדמיה יכולה להיות שונה כדי להיות איטי יותר או מהיר יותר מ 5 דקות תלויות בסובלנות של תאים לphototoxicity חשיפת ליזר. בניסויים שלנו, 12 א הנפרד מושבות coli היו צלמה כל 5 דקות ואחרי 7-8 מחזורים לסלולריים לפני התבוננות פגמי phototoxicity משמעותיים ^1.

לבסוף, לאחר הזמן לשגות סרטים של ייצור חלבון נרכשים בניסוי CoTrAC (דוגמאות שמוצגות באיורי 4 ו 5), ביטוי החלבון פלואורסצנטי צריך לכמת על ידי איתור נקודות מתאימות לאחד או יותר מולקולות ניאון, הקצאת מולקולות לתאים בודדים ו מעקב אחר שושלות תאים. כבר תארו שגרת Matlab מנהג ללמוד ייצור CI repressor λ ^1. בקצרה, יש לזהות את קווי מתאר של תאים בודדים ונקודתי זמן מתאימים לחלוקת תא בתמונות brightfield ראשון תוך מעקב אחר שושלות תאים באמצעות מסגרת תמונה הבאהs. מצאנו כי מרווח זמן 5 דקות היה מספיק קצר שתא בפריים אחד בדרך כלל תואם את התא במסגרת הקודמת שבה חלקה את רוב פיקסלים בתמונה מפולחת. במקרים בם שינויים גדולים מזדמנים של מושבות בין שתי המסגרות הבאות נצפו, הקצאה ידנית של תאים בודדים במשפחותיהם הייתה נדרשה. בשלב בא, אחד צריך לזהות כתמי ניאון ולכמת את העצמה שלהם. מצאנו שכתמי ניאון יכולים להיות מזוהים על ידי (1) bandpass סינון תמונת פלואורסצנטי להסיר רקע פלואורסצנטי בתדירות נמוכה (autofluorescence למשל) ורעש בתדר גבוה, (2) thresholding הדימוי המבוסס על עוצמת קרינה ו( 3) זיהוי אובייקטים גדול יותר מאשר כמה פיקסלים בתמונת thresholded. האובייקטים בתמונת thresholded יהיו כשירים לפונקצית 2-ממדיות גאוס בתוספת רקע קבוע, והעוצמת המשולבת של המקום נלקחה כתוצר של משרעת והשונה לנכון.בניסויים שלנו, עיתונאים מרובים TSR-ונוס-UB ישתפו מקומיים לעתים קרובות בקטבי תא, ויוצרים כתמים שהיו בהירים יותר מאלה של מולקולות בודדות TSR-Venus. מספר מולקולות ונוס במקום אחד היה לכמת ידי חלוקת העצמה המשולבת של הנקודה מעוצמת הקרינה של מולקולה אחת ונוס, שכומתה באמצעות מתח נמוך ביטוי ברמה שבה כתמים לעתים רחוקות מכילים חלבון פלואורסצנטי יותר מפעם אחת מולקולה. מדידה זו ניתן להשלים עוד עם במדידות מבחנה של מולקולות חלבון בודדות ניאון דבקו לשקופית זכוכית. מצאנו כי תכונות חלבון פלואורסצנטי במידה רבה דומות בin vivo ו במערכות מבחנה עם תנאי חיץ דומים.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Agarose (Low melting temperature)	Lonza	50100
Milli-Q H2O
5×M9 salts			Following recipe described in 9
20% glucose
MgSO4
CaCl2
50×MEM amino acid solution	Invitrogen	11130-051
Temperature-Controlled Growth Chamber Stage adaptor	Bioptechs	FCS-2
Objective Heater	Bioptechs	Model depends on microscope objective
Microaqueduct Slide	Bioptechs	130119-5
Micro cover glasses	VWR	40CIR-1	Can be difficult to source; also available from Bioptechs
Cover glass/slide gasket	Bioptechs	FCS2 0.75 mm
Fluorescence Microscope	Various	Example setup: Coherent Innova 308C Argon-ion laser, Olympus IX-81 microscope, Olympus PlanApo 100X NA 1.45 objective, Metamorph software	Must have laser excitation, automated xyz stage, automation software capable of scripted imaging and autofocus, optics capable of resolving single fluorescent proteins
EM-CCD Camera	Various	Example setup: Andor Ixon DU-898	Must have sufficiently low noise to detect single fluorescent proteins above background