Summary
Descriviamo un metodo di microscopia a fluorescenza, Co-traslazionale di attivazione da Cleavage (CoTrAC), per l'immagine della produzione di molecole di proteine in cellule vive con singola molecola di precisione senza perturbare la funzionalità della proteina. Questo metodo è stato utilizzato per seguire la dinamica stocastica espressione di un fattore di trascrizione, il repressore λ CI
Abstract
Descriviamo un metodo di microscopia a fluorescenza, Co-traslazionale di attivazione da Cleavage (CoTrAC) per l'immagine della produzione di molecole di proteine in cellule vive con singola molecola di precisione senza perturbare la funzionalità della proteina. Questo metodo permette di contare il numero di molecole di proteine prodotte in una cella durante sequenziali, cinque minuti finestre temporali. Si richiede un microscopio a fluorescenza con densità di potenza laser di eccitazione di ~ 0,5 a 1 kW / cm 2, che è sufficientemente sensibile per rivelare singole molecole di proteine fluorescenti in cellule vive. Il reporter fluorescente utilizzata in questo metodo si compone di tre parti: una sequenza di targeting membrana, una rapida maturazione, proteina fluorescente gialla e una sequenza di riconoscimento proteasi. Il reporter è traduzionalmente fusa all'N-terminale di una proteina di interesse. Le cellule vengono coltivate su un temperatura controllata portaoggetti. Ogni cinque minuti, le molecole fluorescenti all'interno delle cellule vengono esposte (e poi counted analizzando le immagini di fluorescenza) e, successivamente, in modo che le proteine photobleached solo appena tradotti sono conteggiati nella misura successiva.
Immagini di fluorescenza risultanti da tale metodo può essere analizzato rilevando macchie fluorescenti in ogni immagine, assegnando loro singole celle e quindi assegnare cellule per linee cellulari. Il numero di proteine prodotte entro una finestra temporale in una data cella è calcolato dividendo l'intensità di fluorescenza delle macchie integrato per l'intensità media di singole molecole fluorescenti. Abbiamo usato questo metodo per misurare i livelli di espressione nella gamma di 0-45 molecole in finestre singole 5 min di tempo. Questo metodo consente di misurare il rumore nell'espressione del repressore λ CI, e ha molte altre applicazioni potenziali in biologia dei sistemi.
Protocol
1. Flusso di lavoro Strain Ingegneria
- Inserire codifica sequenze (a) una membrana-localizzazione sequenza, (b) una rapida maturazione proteina fluorescente e (c) una sequenza di riconoscimento proteasi N-terminale e in frame con una proteina di interesse (ad esempio, un fattore di trascrizione). Abbiamo usato la membrana mirata Tsr-Venus 2 giornalista e fuso alla sequenza di riconoscimento proteasi ubiquitina (Ub) per contare il numero di espresse batteriofago λ repressore molecole proteiche CI. I dettagli su come abbiamo costruito la proteina di fusione Tsr-Venere-Ub-CI, che sostituisce il wild-type CI regione codificante e incorporando il costrutto in E. cromosoma coli usando λ ricombinazione Red 3, sono descritte in dettaglio in rif. 1.
- Verificare che tutte le modifiche mediante sequenziamento.
- Trasformare un plasmide codificante una proteasi specifica per la sequenza di riconoscimento utilizzato sopra in un ceppo che esprime il reporter fluorescente e la proteina di interessein fusione traslazionale. Abbiamo usato la proteasi Ubp1, che scinde subito dopo il residuo C-terminale Ubiquitina 4.
2. Cellule Cultura e preparare campioni
- Scegli uno E. colonia coli di interesse da una piastra di agar appena striato in 1 ml di M9 minima media 5 integrato con 1X acidi MEM amminoacidi e antibiotici appropriati. Incubare in un agitatore a temperatura voluta abbastanza a lungo per raggiungere OD 600> 1,0 (densità ottica a 600 nm).
- Diluire la cultura in 1 ml di terreno fresco M9 con antibiotici appropriati per OD 600 = 0,02. Incubare in un agitatore a temperatura adeguata. Densità cellulare iniziale può essere aumentato se necessario per la bassa temperatura di crescita.
- Quando la OD 600 = 0,2-0,3 (a 37 ° C con una coltura cellulare iniziale OD 600 = 0,02, ciò richiederà hr 3-4), iniziare a preparare il gel di agarosio pad (passo 3).
- Le cellule sono pronte per l'imaging quando OD
- Trasferire 1 ml di coltura incubata in una provetta da microcentrifuga da 1,5 ml, centrifugare a 10.000 xg per 1 min in microcentrifuga.
- Eliminare il supernatante e aggiungere 1 ml di terreno fresco M9 e risospendere il pellet delicatamente.
- Centrifugare a 10.000 xg per 1 min.
- Ripetere il punto 1.6 e 1.7. Eliminare il surnatante.
- Risospendere delicatamente in 1 ml di M9 media. Cellule può essere direttamente utilizzata per l'imaging microscopio o diluito 10 - a 100 volte per garantire densità cellulari bassi per l'imaging timelapse. Notare che basse densità cellulari sono importanti per l'imaging timelapse esteso. La camera di imaging (fase 4) è sigillata durante l'esperimento. A causa della crescita esponenziale di cellule, elevate concentrazioni iniziali di cellule può significativamente esaurire l'ossigeno all'interno della camera di crescita dopo prolungata nel cuscinetto di gel, riducendo maturazione proteina fluorescente e influenzando la crescita cellulare.
3. Preparare la soluzione di agarosio
- Pesare 10-20 mgbassa temperatura di fusione agarosio in una provetta da microcentrifuga 1,5 ml.
- Aggiungere mezzo adeguato volume minimo M9 senza antibiotici per ottenere una soluzione al 3% di agarosio.
- Riscaldare la soluzione di agarosio per 30 minuti a 70 ° C per fondere, invertendo la provetta per garantire che la soluzione è completamente fusa e omogenea. Il cuscinetto di gel può essere versato a questo punto (passo 4) o la temperatura può essere ridotta a 50 ° C e mantenuta per diverse ore per un uso successivo.
4. Preparare Pad Gel sulla Camera
- Circa 50 minuti prima di imaging, lavare uno scivolo Microaqueduct con acqua.
- Risciacquo uno pulito vetro di copertura (utilizzando un metodo rigoroso di pulizia come quello descritto in 6) e Microaqueduct scivolo con acqua sterile e asciugare soffiando con aria compressa.
- Posizionare la guarnizione di gomma sul vetrino Microaqueduct modo che copra le entrate e le uscite sul lato del vetro scorrevole Microaqueduct (questo può essere modificato per applicazioni inquale supporto è perfuso attraverso il campione). Applicare 50 ul di soluzione di agarosio (step 3) al centro della slitta Microaqueduct.
- Top la soluzione di agarosio con la pulizia, vetro di copertura a secco.
- Lasciare la soluzione di agarosio riposare a temperatura ambiente per 30 min.
- Nel frattempo, preparare un campione di cellule (fase 2).
- Attentamente staccare il vetro di copertura dalla parte superiore del cuscinetto di gel. Aggiungere 1,0 microlitri coltura cellulare lavato per la parte superiore del cuscinetto di gel. Attendere ~ 2 min per la coltura di essere assorbita dal cuscinetto di gel. E 'importante non aspettare così a lungo che le overdries gel pad, ma abbastanza a lungo che le cellule siano correttamente rispettate il cuscinetto di gel. Il tempo ideale di attesa varia a seconda della temperatura e dell'umidità.
- In attesa, asciugare un altro bicchiere predepurata copertura.
- Coprire il campione con il vetro di copertura nuova assicurare che il vetro e il coperchio scorrevole Microaqueduct sono ben allineati.
- Montare la camera di crescita della temperatura controllata seguendo le istruzioni del produttore.Si può ora essere utilizzato per l'imaging su microscopio (passo 5).
5. Acquisizione di immagini e filmati Timelapse
- Accendere il microscopio laser e seguendo le istruzioni del produttore (ad esempio, il laser potrebbe essere necessario riscaldato per ~ 0,5 ore prima dell'esperimento).
- Bloccare la camera montata per l'inserto sul palco microscopio. Impostare la temperatura della camera di crescita e il riscaldatore obiettivo a 37 ° C o altra temperatura di crescita desiderata.
- Se l'imaging sopra della temperatura ambiente, la messa a fuoco o cuscinetto di gel di solito deviare significativamente per ~ 15 minuti dopo il turno temperatura iniziale. In pratica, utilizzare questo tempo per trovare le regioni di interesse e modificare gli script di imaging, se necessario, per un esperimento.
- Trova celle del microscopio e memorizzare la posizione di ciascuna cella dopo centrandolo all'interno di una regione imaging predefiniti e allineati. Più di una cella può essere ripreso in ciascuna finestra di tempo di acquisizione dell'immagine. Per timelapse di imaging su mtutte le generazioni, in modo che le cellule sotto forma di immagini sono inizialmente separati da altre cellule di almeno qualche centinaio di micron in modo che altre colonie non entrerà nella regione di imaging durante la crescita.
- Regolare intensità del laser di eccitazione in modo che quasi tutti fotosbiancante molecole fluorescenti entro 6 esposizioni (Figura 5).
- Utilizzo di uno script automatico di imaging / rivista, acquisire i dati timelapse utilizzando l'algoritmo descritto nel flusso di lavoro sperimentale in Figura 3.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Risultati tipici di un esperimento CoTrAC tracciamento della produzione del repressore λ CI sono mostrati nelle Figure 4 e 5. In questo esperimento, sono stati ripresi 12 colonie a intervalli di 5 min. Ad ogni punto di tempo, la colonia fu autofocused e centralizzato all'interno della regione di imaging. Successivamente, l'centrato / focalizzato posizione è stata memorizzata e l'immagine è stata acquisita campo chiaro. Lo stadio è stato poi traslocato da ~ 0,5 micron lungo l'asse z per passare dal piano focale campo chiaro al piano bisettore le cellule (senza contrasto di fase o interferenza contrasto differenziale (DIC) ottiche, semi-trasparenti gli oggetti possono essere esposte a un livello leggermente out-of-focus piani 8). Infine, sei immagini sono state acquisite ad intervalli di 1 secondo, ognuna con esposizione 100 msec (Figura 5 mostra un punto tale tempo). Questo è stato ripetuto per tutte le celle ad ogni tempo. Poiché quasi tutte le molecole sono Venus photobleached ad ogni timepoint, le fluorescentimacchie cent nelle figure 4 e 5 corrispondono a molecole che Venus maturati (diventato fluorescente) negli ultimi 5 minuti. Molecole venus maturare rapidamente in vivo con una emivita di 2-7 min ~ 1, 2, 7 e clivaggio mediante Ubp1 è molto efficiente 4, 9. Pertanto, il numero di molecole proteiche prodotte dopo l'ultima misurazione può essere accuratamente dedurre dal numero di molecole Venus contate sulla membrana.
Figura 1. Utilizzando CoTrAC contare l'espressione di molecole singole fattori di trascrizione. (1) Un reporter compresa la membrana-localizzazione Tsr sequenza, la rapida maturazione YFP Venus, e ubiquitina (Ub) è espresso in fusione traslazionale con un fattore di trascrizione da un promoter regolata dal fattore di trascrizione. (2) La proteasi Ubp1 co-traduzionale scinde il polipeptide nascente dopo il residuo C-terminale Ub. (3) Il TSR-Venus-Ub giornalista localizza alla membrana dove può essere contati alla singola -molecola livello. (4) Il fattore di trascrizione può regolare la propria espressione. Metodo di cartone animato.
Figura 2. Le cellule Schema della camera campione utilizzato negli esperimenti CoTrAC. Si trovi tra il pad in gel di agarosio e copertura in vetro. Microaqueduct vetrino e obiettivo sono tenuti ad una temperatura fissa utilizzando un controllore elettronico. Preparazione del campione.
Figura 3. Flusso di lavoro di un tipico esperimento CoTrAC. Experiflusso di lavoro mentale.
Figura 4. Timelapse dati tipici di un esperimento CoTrAC. Immagini da una singola colonia vengono visualizzati ad intervalli di 25 min. In questo esperimento, sono stati acquisiti i dati ogni 5 min da 12 colonie diverse. (A) immagini campo chiaro. (B) Venere (YFP) immagine di fluorescenza (fondo media sottratta al conto per il cambiamento in background di campo dell'imaging nel corso del tempo). (C ) Overlay immagine mostra la localizzazione del polo Tsr-Venere-Ub molecole reporter e l'eterogeneità del numero di molecole prodotte in finestre temporali min 5 in celle diverse (campo chiaro immagine è invertita e l'immagine di Venere è filtrata passa-banda). Clicca here per ingrandire figura.
Figura 5. Dati tipici di un punto di sola volta in un esperimento CoTrAC. (A) Venus (YFP) immagini di fluorescenza. Sei esposizioni 100 msec state acquisite all'inizio di ogni intervallo di tempo di 5 min. Ognuno dei 6 esposizioni è stato separato da 900 msec per dare tempo transitoriamente scuri molecole Venus che aveva lampeggiavano fuori di diventare fluorescente. (B) Per l'analisi, l'immagine 6 è sottratto da Immagine da 1 a correggere molecole greggi e sfondo autofluorescenza. Punti in questa immagine sono localizzati linee cellulari specifici e quantificati per la loro intensità fluorescenza integrato. (C) La fluorescenza media integrata della colonia in A viene tracciata oltre 6 immagini (cosìcoperchio linea). Montaggio questa linea ad un decadimento esponenziale aggiunto un offset (linea tratteggiata) dà un decadimento metà tempo di 1 sec. In questo esperimento, Venus fotosbiancante molecole molto più rapidamente di autofluorescenza cellulare, quindi questo significa che circa la metà del numero totale di molecole Venus sono photobleached in ogni frame. Photobleaching progresso in un punto sola volta.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Il metodo CoTrAC può essere generalizzato per misurare la produzione di altre proteine con N-convenzionali o C-terminali fusioni proteine fluorescenti possono alterare l'attività della proteina. La strategia CoTrAC ha tre vantaggi unici rispetto ai metodi attuali. First, co-traslazionale fusione assicura che una molecola del reporter fluorescente viene prodotta per ogni molecola di proteina di interesse, permettendo conteggio preciso della produzione di proteina in tempo reale. In secondo luogo, la membrana targeting giornalista TSR-Venus consente singola molecola di rilevamento reporter fluorescenti, permettendo la rilevazione di proteine espresse a livelli molto bassi. Terzo e più importante, il co-traslazionale clivaggio del reporter fluorescente permette la proteina di interesse a conservare la sua quasi sequenza wild-type e funzione normalmente utilizzando Ubiquitina come proteasi sequenza di riconoscimento in E. coli, proteine bersaglio differiscono dai loro tipo selvatico sequenze peptidiche fatto che il primo N-terminale N </ Em>-formil-metionina viene modificato in metionina.
Quando si utilizza il metodo CoTrAC, è importante tenere presente che il metodo CoTrAC misura il numero di molecole proteiche prodotte ogni 5 min di tempo, che è distinta dalla misura del numero di molecole proteiche presenti per cella (cioè l' la concentrazione di proteine). Più cella singola fluorescenza genica saggi misura la concentrazione di proteine, che è il risultato equilibrato della produzione di proteine e degradazione. Pertanto, la velocità di degradazione della proteina di interesse deve essere considerato attentamente se la misura della concentrazione viene utilizzato per dedurre informazioni produzione proteica. Inoltre, la concentrazione di proteine è soggetto a fluttuazioni dovute partizionamento della proteina tra due cellule figlie a divisione cellulare, che potrebbero essere significativi a basso livello di espressione delle proteine ed erroneamente interpretate come derivanti dalle dinamiche di produzione delle proteine. Il metodo CoTrAC possono essere modicato per misurare la concentrazione di proteine, non photobleaching molecole reporter di nuova produzione, ma questo deve essere fatto con controllo extra. Si deve verificare che la velocità di degradazione del reporter fluorescente e la proteina di interesse sono simili, e che entrambe sono similmente partizionato in due cellule figlie upon divisione cellulare, in modo che la concentrazione del reporter fluorescente rispecchia quella della proteina di interesse.
Si nota che mentre il CoTrAC non altera la sequenza proteica, l'aggiunta del gene reporter modifica la sequenza di mRNA. Pertanto, la trascrizione e la dinamica di traduzione e / o velocità di degradazione di mRNA trascritti possono essere turbato. Se il metodo è utilizzato per CoTrAC osservare nella produzione di proteine di tipo selvatico contesto, è importante confrontare i livelli di espressione della proteina bersaglio sia nella sua sequenza wild-type e con l'etichetta fluorescente CoTrAC fusione (ad esempio in rif. 1 abbiamo confrontato CI espressione nel nostro CoTrAC costruzionet a che in un tipo selvaggio lysogen). Qui di seguito discuteremo le considerazioni necessarie per generalizzare il metodo CoTrAC.
In primo luogo, si discute la possibilità di utilizzare altre sequenze di Tsr-Venere-Ub. I requisiti generali sono: (1) il reporter deve essere localizzato in qualche posizione all'interno della cellula in modo che non si diffonde rapidamente (con Tsr, reporter sono ai poli cellule 1). Ciò è necessario per la singola molecola di rilevamento di una molecola di proteina fluorescente come segnale da una molecola rapidamente diffondendo proteina fluorescente genere non rilevabile sopra sfondo autofluorescente una cellula, (2), la proteina fluorescente deve essere sufficientemente luminosa da rilevare sul livello di singola molecola e deve maturare (diventare fluorescente) abbastanza velocemente per l'applicazione desiderata (Venere è la più rapida maturazione della proteina fluorescente ad oggi 7), (3), la proteina fluorescente deve essere photobleached dopo il rilevamento in modo che nuove proteine fluorescenti possono essere deprotette a tempi successivi (proteine fluorescenti che sono troppo resistenti alla fotodegradazione sono indesiderabili come esposizione laser eccessivo può causare artefatti fototossicità), (4), la sequenza di riconoscimento proteasi non può lasciare residui acidi aminoacidi della proteina di interesse che disturberà la sua funzionalità (Ubp1 scinde immediatamente dopo il carbossi-terminale residuo Ub, senza lasciare residui supplementari a tutti).
In secondo luogo, si deve verificare che il reporter è adeguatamente espressa e scisso. Clivaggio proteolitico separa il reporter dalla proteina di interesse deve essere efficiente, efficienza clivaggio può essere misurata usando Western blot contro il reporter, la proteina di interesse o entrambi (anticorpi sono disponibili in commercio per molte proteine fluorescenti come la GFP anticorpo anti-JL- 8 da Clontech, che lega Venere in Western blot). Si dovrebbe assicurare che nessun uncleaved proteina di fusione viene rilevato in blots contro lisati di cellule che esprimono la fusioneproteine a livelli superiori rispetto a quelli previsti in esperimenti CoTrAC. Inoltre, il giornalista e la proteina di interesse deve essere prodotto in un rapporto di 1:1 a seguito della scissione. Questo può essere verificato misurando le intensità delle bande spaccati in anti-reporter e anti-proteina di interessi Western blot normalizzato mediante la intensità delle bande uncleaved in ceppi privi proteasi. Se il giornalista e proteine di interesse sono presenti in un rapporto 1:1 a seguito della scissione, quindi:
Si noti che, poiché la concentrazione di proteine occidentale misura blots, il rapporto risultante devierà da 1:1 se il reporter e la proteina di interesse mostrano diverse velocità di degradazione dopo clivaggio.
Terzo, si deve verificare che la proteina di interesse esibisce la propria funzionalità prevista dopo la scissione. La presenza del reporter grande costrutto di fusione e / o localizzazione alla membrana cellulare dovrebbe inattivare maggior parte dei fattori di trascrizione (λ il repressore CI stato completely inattivo senza Ubp1 espressione nei nostri esperimenti 1). Trasformazione della proteasi plasmide esprimente deve attivare la proteina di interesse liberando la proteina dal tag ingombranti fusione traduzionale. Questo fenomeno dà luogo ad altre possibili applicazioni CoTrAC. Clivaggio al capolinea Ub carbossi da Ubp1 è stato utilizzato per esporre non canonici amminoacidi ammino-terminali di chiarire il batterica N-end stato di degradazione proteica 9. Se la fusione di un grande, associata alla membrana giornalista inattiva un fattore di trascrizione (o altra proteina come un enzima), la sua attività potrebbe essere recuperato velocemente grazie espressione inducendo proteasi. CoTrAC potrebbe essere usato per molto rapidamente "accendere" un gruppo preesistente di fattori di trascrizione rimuovendo / aggiungendo un inibitore / co-attivatore o altrimenti avviare proteasi espressione o attività. Infine, l'espressione del reporter fluorescente può perturbare fisiologia cellulare e si deve garantire che proprietà come cellatempo di ciclo non vengono modificate, nell'esperimento descritto nel rif. 1, abbiamo usato la proteina Tsr come membrana-localizzazione sequenza perché Tsr è già una proteina di membrana altamente espresso e un piccolo aumento nell'espressione Tsr non era previsto per influenzare il comportamento cellulare.
Quarto, quando una sequenza reporter di diverso specificamente discusso Tsr-Venus-Ub viene utilizzato, il protocollo di imaging corrispondente deve essere modificato secondo necessità. Per esempio, diverse proteine fluorescenti richiedono protocolli di illuminazione differenti per raggiungere un buon equilibrio tra efficienza rilevare molecole proteiche fluorescenti, fototossicità da esposizione laser e photobleaching. Idealmente, eccitazione laser dovrebbe essere al picco di assorbanza della proteina fluorescente prescelto; off-picco di eccitazione richiede intensità di eccitazione più alti (e quindi maggiore fototossicità e sfondo autofluorescenza) per ottenere l'emissione stessa proteina fluorescente e caratteristiche photobleaching. Inoltre, lafrequenza di imaging può essere modificato per essere più lento o più veloce di 5 min a seconda della tolleranza delle cellule alla fototossicità di esposizione laser. Nei nostri esperimenti, separate da 12 E. colonie coli sono stati ripresi ogni 5 min e seguiti per 7-8 cicli cellulari prima di osservare i difetti sostanziali fototossicità 1.
Infine, dopo filmati time-lapse della produzione di proteine vengono acquisiti in un esperimento CoTrAC (esempi illustrati nelle figure 4 e 5), l'espressione della proteina fluorescente deve essere quantificato rilevando macchie fluorescenti corrispondenti ad una o più molecole, assegnando alle molecole singole celle e tracciamento linee cellulari. Abbiamo descritto una routine personalizzata Matlab per studiare λ produzione repressore CI 1. In breve, si deve prima identificare i profili delle singole celle e punti di tempo corrispondenti al divisione cellulare in immagini campo chiaro, mentre si tracciano linee cellulari attraverso la cornice immagine successivas. Abbiamo trovato che un intervallo di tempo 5 min era sufficientemente breve che una cellula in un frame di solito corrispondeva alla cella nel frame precedente con cui condivide maggior parte dei pixel in un'immagine segmentata. Nei casi in cui sono stati osservati occasionali spostamenti in grandi colonie tra due fotogrammi successivi, assegnazione manuale delle singole celle di loro lignaggi era necessaria. Successivamente, si ha la necessità di identificare i punti fluorescenti e quantificare la loro intensità. Abbiamo trovato che macchie fluorescenti possono essere individuati (1) passabanda filtrare l'immagine di fluorescenza per rimuovere bassa frequenza fluorescenza di fondo (ad es autofluorescenza) e ad alta frequenza del rumore, (2) l'immagine di soglia sulla base di intensità di fluorescenza e (3) l'identificazione di oggetti più grande di alcuni pixel dell'immagine thresholded. Gli oggetti nell'immagine thresholded erano idonei ad un 2-dimensionale funzione gaussiana più un sottofondo costante, e l'intensità integrata del posto è stato preso come prodotto della forma e dell'ampiezza varianza.Nei nostri esperimenti, più Tsr-Venere-Ub giornalisti spesso co-localizzata ai poli cellulari, creando macchie che erano più luminoso di quelli singoli Tsr-Venus molecole. Il numero di molecole Venus entro un spot è stato quantificato dividendo l'intensità integrata del posto per l'intensità di fluorescenza di una singola molecola Venus, che è stata quantificata utilizzando un basso livello di espressione ceppo in cui macchie raramente contengono più di una proteina fluorescente molecola. Questa misurazione può essere ulteriormente integrata con misurazioni in vitro di singole molecole di proteine fluorescenti aderito ad un vetrino. Abbiamo trovato che le proprietà di proteine fluorescenti sono molto simili in in vivo e in vitro con sistemi tampone condizioni simili.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Non abbiamo informazioni integrative.
Acknowledgments
Il pCG001 plasmide che esprime Ubp1 è stato gentilmente fornito da Rohan Baker presso la John Curtin School of Medical Research. Questo lavoro è stato finanziato dal March of Dimes Research Grant 1-FY2011, March of Dimes Basil O'Connor Research Scholar Award Starter N ° 5-FY20 e di aggiudicazione CARRIERA NSF 0746796.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Agarose (Low melting temperature) | Lonza | 50100 | |
| Milli-Q H2O | |||
| 5×M9 salts | Following recipe described in 9 | ||
| 20% glucose | |||
| MgSO4 | |||
| CaCl2 | |||
| 50×MEM amino acid solution | Invitrogen | 11130-051 | |
| Temperature-Controlled Growth Chamber Stage adaptor |
Bioptechs | FCS-2 | |
| Objective Heater | Bioptechs | Model depends on microscope objective | |
| Microaqueduct Slide | Bioptechs | 130119-5 | |
| Micro cover glasses | VWR | 40CIR-1 | Can be difficult to source; also available from Bioptechs |
| Cover glass/slide gasket | Bioptechs | FCS2 0.75 mm | |
| Fluorescence Microscope | Various | Example setup: Coherent Innova 308C Argon-ion laser, Olympus IX-81 microscope, Olympus PlanApo 100X NA 1.45 objective, Metamorph software | Must have laser excitation, automated xyz stage, automation software capable of scripted imaging and autofocus, optics capable of resolving single fluorescent proteins |
| EM-CCD Camera | Various | Example setup: Andor Ixon DU-898 | Must have sufficiently low noise to detect single fluorescent proteins above background |
References
- Hensel, Z., Feng, H. D., Han, B., Hatem, C., Wang, J., Xiao, J. Stochastic expression dynamics of transcription factor revealed by single-molecule noise analysis. Nat. Struct. Mol. Biol. 19, 797-802 (2012).
- Yu, J., Xiao, J., Ren, X., Lao, K., Xie, X. S. Probing Gene Expression in Live Cells, One Protein Molecule at a Time. Science. 311, 1600-1603 (2006).
- Datsenko, K. A., Wanner, B. L. One-step inactivation of chromosomal genes in Escherichia coli K-12 using PCR products. Proc. Nat. Acad. Sci. U.S.A. 97, 6640-6645 (2000).
- Tobias, J. W., Varshavsky, A. Cloning and Functional Analysis of the Ubiquitin-specific Protease Gene UBP1 of Saccharomyces cerevisiae. J. Biol. Chem. 266, 12021-12028 (1991).
- Sambrook, J., Russell, D. W. Molecular Cloning: A Laboratory Manual. , ed. 3, Cold Spring Harbor Laboratory Press. New York. A2.2 (2001).
- Xiao, J., Elf, J., Li, G., Yu, J., Xie, X. S. Imaging gene expression in living cells at the single-molecule level. Single Molecules: a laboratory manual. , 149-169 (2007).
- Nagai, T., et al. A variant of yellow fluorescent protein with fast and efficient maturation for cell-biological applications. Nat. Biotechnol. 20, 87-90 (2002).
- Stagaman, G., Forsyth, J. Bright-field microscopy of semitransparent objects. J. Opt. Soc. Am. A. 5, 648-659 (1988).
- Tobias, J. W., Shrader, T. E., Rocap, G., Varshavsky, A. The N-end rule in bacteria. Science. 254, 1374-137 (1991).
