Enkelt-molekyl Imaging of Gene Regulation Published: March 15, 2013 doi: 10.3791/50042

DOI

Automatic Translation

• English (Original)
• العربية (Arabic)
• 中文 (Chinese)
• dansk (Danish)
• Nederlands (Dutch)
• français (French)
• Deutsch (German)
• עברית (Hebrew)
• हिंदी (Hindi)
• italiano (Italian)
• 日本語 (Japanese)
• 한국어 (Korean)
• norsk (Norwegian)
• português (Portugese)
• русский (Russian)
• español (Spanish)
• svenska (Swedish)
• Türkçe (Turkish)

Zach Hensel¹, Xiaona Fang^1,2,3, Jie Xiao¹

¹Department of Biophysics and Biophysical Chemistry, Johns Hopkins University School of Medicine, ²Changchun Institute of Applied Chemistry, Chinese Academy of Sciences, ³Department of Physics, Jilin University

Summary

Vi beskriver en fluorescens mikroskopi metode, Co-Translasjonell Aktivering av Cleavage (CoTrAC) i bildet produksjon av protein molekyler i levende celler med single-molekyl presisjon uten perturbing protein funksjonalitet. Denne metoden har blitt brukt til å følge de stokastiske uttrykk dynamikken i en transkripsjon faktor, λ repressor CI

Abstract

Vi beskriver en fluorescens mikroskopi metode, Co-Translasjonell Aktivering av Cleavage (CoTrAC) til bildet produksjon av protein molekyler i levende celler med single-molekyl presisjon uten perturbing protein funksjonalitet. Denne metoden gjør det mulig å telle antallet av proteinmolekyler produsert en celle under sekvensielle, fem minutters tidsvinduer. Det krever en fluorescensmikroskop med laser magnetisering effekttetthet ~ 0,5 til 1 kW / cm ^2, som er tilstrekkelig følsom til å detektere enkelt fluorescerende proteinmolekyler i levende celler. Den fluorescerende reporter brukes i denne metoden består av tre deler: en membran målretting sekvens, en rask modning, gul fluorescerende protein og en protease gjenkjennelsessekvens. Reporteren er translationally smeltet til N-terminus av et protein av interesse. Celler dyrkes på en temperatur-kontrollert mikroskop scenen. Hvert femte minutt, er fluorescerende molekyler i cellene avbildes (og senere counted ved å analysere fluorescens bilder) og deretter photobleached slik at bare nylig oversatte proteiner telles i neste måling.

Fluorescens bilder som følge av denne metoden kan analyseres ved å registrere fluorescerende flekker i hvert bilde, tildele dem til individuelle celler og deretter tildele celler til celle linjene. Antallet proteiner produsert innenfor et tidsvindu i en gitt celle er beregnet ved å dividere den integrerte fluorescensintensiteten av flekker med gjennomsnittlig intensitet av enkelt fluorescerende molekyler. Vi brukte denne metoden for å måle uttrykket nivåer i størrelsesorden 0-45 molekyler i enkle 5 min tidsvinduer. Denne metoden mulig for oss å måle støy i uttrykket av λ repressor CI, og har mange andre potensielle bruksområder i systembiologi.

Protocol

1. Strain Engineering arbeidsflyt

1. Sett sekvenser koding (a) en membran-lokalisering sekvens, (b) en rask modning fluorescerende protein og (c) en protease gjenkjennelsessekvens N-terminal til og i ramme med et protein av interesse (f.eks en transkripsjonsfaktor). Vi brukte membranen målrettet TSR-Venus reporter ² og smeltet det til protease gjenkjennelsessekvens Ubiquitin (UB) for å telle antall uttrykt bakteriofag λ repressor CI protein molekyler. Detaljer om hvordan vi konstruerte fusjonsproteinet TSR-Venus-Ub-CI, erstatter villtype CI koding regionen og innlemme konstruere i E. coli kromosom hjelp λ Red rekombinasjon ^3, er beskrevet i detalj i ref.. 1.
2. Kontroller alle modifikasjoner ved sekvensering.
3. Transformere et plasmid som koder for en protease som er spesifikk for gjenkjennelsessekvensen brukes ovenfor inn i en stamme som uttrykker fluorescerende reporter og protein av interessei translasjonell fusjon. Vi brukte proteasen Ubp1, som kløyver umiddelbart etter den C-terminale Ubiquitin residuum ^4.

2. Kultur Cells og forberede Sample

1. Plukk en E. coli koloni av interesse fra en fersk stripete agarskål inn 1 ml M9 minimal medier ⁵ supplert med 1X MEM aminosyrer og hensiktsmessige antibiotika. Inkuber i en shaker med ønsket temperatur lenge nok til å nå ₆₀₀ OD> 1,0 (optisk densitet ved 600 nm).
2. Fortynn kultur inn 1 ml frisk M9 medium med egnede antibiotika til OD ₆₀₀ = 0,02. Inkuber i en shaker på passende temperatur. Initial cellulære tetthet kan økes om nødvendig for lav temperatur vekst.
3. Når OD ₆₀₀ = 0,2 til 0.3 (ved 37 ° C med en initial cellekultur på OD ₆₀₀ = 0,02, vil dette ta 3-4 timer), starter forberede agarosegel pad (trinn 3).
4. Cellene er klare for avbilding ved OD
5. Overfør 1 ml inkubert kultur inn et 1,5 ml mikrosentrifugerør, sentrifuger ved 10 000 xg i 1 min i en stasjonær mikrosentrifuge.
6. Kast supernatanten og tilsett 1 ml friskt M9 medium og resuspender pelleten forsiktig.
7. Sentrifuger ved 10.000 xg i 1 min.
8. Gjenta trinn 1,6 og 1,7. Kast supernatanten.
9. Forsiktig resuspender i 1 ml M9 media. Celler kan brukes direkte for mikroskop avbildning eller fortynnet 10 - til 100 ganger for å sikre lave celletetthet for timelapse imaging. Vær oppmerksom på at lave celletetthet er viktig for utvidet timelapse imaging. Imaging kammer (trinn 4) er forseglet under eksperimentet. Grunnet eksponensiell vekst av celler, kan høye initielle cellekonsentrasjoner signifikant deplete oksygen i kammeret etter langvarig vekst i gelen puten, redusere fluorescerende protein modning og påvirke celleveksten.

3. Klargjør Agarose Solution

1. Vei 10-20 mglavtsmeltende temperatur agarose til en 1,5 ml mikrosentrifugerør.
2. Legg passende volum M9 minimalt medium uten antibiotika for å gjøre en 3% agarose-løsning.
3. Varm agarosen løsningen i 30 minutter ved 70 ° C for å smelte, invertere røret for å sikre at løsningen er helt smeltet og homogen. Gelen puten kan helles på dette punktet (trinn 4) eller temperaturen kan bli redusert til 50 ° C og holdt i flere timer for senere bruk.

4. Forbered Gel Pad på Chamber

1. Ca 50 min før bildebehandling, skyll en Microaqueduct lysbilde med vann.
2. Skylling en renset dekkglass (ved hjelp av en streng rensemetode slik som beskrevet i ⁶⁾ og Microaqueduct lysbilde med sterilt vann og tørk ved å blåse med trykkluft.
3. Plasser gummipakningen på Microaqueduct lysbilde slik at det dekker og utløp på glasset side av Microaqueduct lysbildet (dette kan modifiseres for bruk isom media er perfused gjennom prøven). Påfør 50 ul agarose løsning (trinn 3) til midten av Microaqueduct lysbildet.
4. Toppe agarose løsningen med renset, tørr cover glass.
5. La agarose oppløsningen stå ved romtemperatur i 30 minutter.
6. I mellomtiden forbereder en celleprøve (trinn 2).
7. Dra forsiktig av dekselet glass fra toppen av gel pad. Tilsett 1,0 pl vasket cellekultur til toppen av gelen puten. Vent på ~ 2 min for kulturen å bli absorbert av den gel pad. Det er viktig ikke å vente så lenge at gel pad overdries, men lang nok til at cellene er riktig festet til gel pad. Ideell ventetid vil variere med temperatur og luftfuktighet.
8. Mens du venter, tørke en annen precleaned cover glass.
9. Dekk prøven med det nye dekselet glass sikrer at dekselet glass og Microaqueduct lysbilde er godt justert.
10. Monter temperatur kontrollert vekstkammeret følge produsentens instruksjoner.Det kan nå brukes for avbildning på mikroskop (trinn 5).

5. Bildebehandling og Oppkjøp av timelapse filmer

1. Slå på laser og mikroskop etter produsentens instruksjoner (f.eks laser må varme opp for ~ 0,5 timer før forsøket).
2. Lås sammensatte kammeret til scenen innsatsen på mikroskopet. Sette temperaturen i vekstkammeret og den objektive varmeapparatet ved 37 ° C eller en annen ønsket vekst temperatur.
3. Hvis avbildning over romtemperatur, vil fokus eller gel pad vanligvis drive betydelig for ~ 15 minutter etter den innledende temperatur skift. I praksis, bruke denne tid til å finne områder av interesse og modifisere bildebehandling skript som nødvendig for et eksperiment.
4. Finne celler på mikroskop og lagre posisjonen til hver celle etter sentrere innenfor en forhåndsdefinert og justert bildebehandling regionen. Mer enn en celle kan bli avbildet i hver bildeinnlastingen tidsvinduet. For timelapse bildebehandling over mnoen generasjoner, at sistnevnte tok bilder cellene er i utgangspunktet atskilt fra andre celler med minst et par hundre mikrometer, slik at andre kolonier ikke vil gå inn i bildebehandling regionen under vekst.
5. Juster laser magnetisering intensitet slik at nesten alle fluorescerende molekyler photobleach innen 6 eksponeringer (figur 5).
6. Bruke en automatisert bildebehandling script / journal, skaffe timelapse data ved hjelp av algoritmen beskrevet i den eksperimentelle arbeidsflyten i figur 3.

Representative Results

Typiske resultater fra en CoTrAC eksperiment sporing produksjonen av λ repressor CI er vist i figurene 4 og 5. I dette eksperimentet ble 12 kolonier avbildes på 5 min intervaller. Ved hvert tidspunkt, ble kolonien første autofocused og sentraliserte innenfor bildebehandling regionen. Deretter ble sentrert / fokusert posisjon lagres og en lysfelt bildet ble kjøpt. Scenen ble deretter translocated av ~ 0,5 mikrometer langs z-aksen for å flytte fra lysfelt fokusplan til flyet halverer cellene (uten fase kontrast eller differensial interferens kontrast (DIC) optikk, kan semi-transparente objekter avbildes på litt ut-av-fokus flyene ^8). Endelig ble seks bilder kjøpt en sek intervaller, hver med en 100 msek eksponering (Figur 5 viser en slik tid punkt). Dette ble gjentatt for alle cellene ved hvert tidspunkt. Fordi nesten alle Venus molekyler photobleached på hver endepunktet, det fluorescerendeProsent flekker i figurene 4 og 5 tilsvarer Venus molekyler som modnet (ble fluorescerende) innenfor de siste 5 min. Venus molekyler modnes raskt in vivo, med en halveringstid på ~ ² til 7 januar ^{min, 2, 7} og spalting ved Ubp1 er svært effektiv ^{4, 9.} Derfor kan antallet proteinmolekyler produsert siden siste måling være nøyaktig utledes fra antall Venus molekyler telles på membranen.

Figur 1. Bruke CoTrAC å telle uttrykket av single transkripsjon faktor molekyler. (1) En reporter inkludert membranen-lokalisering sekvens TSR, rask-modning YFP Venus, og ubiquitin (Ub) er uttrykt i translasjons fusjon med en transkripsjonsfaktor fra en fremmeER regulert av transkripsjonsfaktor. (2) Den protease Ubp1 co-translationally kløyver begynnende polypeptid etter den C-terminale Ub residuum (3). TSR-Venus-Ub reporter lokaliserer til membranen hvor den kan telles på enkelt -molekyl nivå. (4) Den transkripsjonsfaktor kan regulere sin egen uttrykk. Metode tegneserie.

Figur 2. Skjematisk av prøvekammeret brukt i CoTrAC eksperimenter. Celler plasseres mellom agarosegel pad og dekkglass. Microaqueduct lysbilde og målsetting er holdt på en fast temperatur ved hjelp av en elektronisk styreenhet. Prøveopparbeidelse.

Figur 3. Arbeidsflyt av en typisk CoTrAC eksperiment. Få med degmental arbeidsflyt.

Figur 4. Typiske timelapse data fra en CoTrAC eksperiment. Bilder fra en enkelt koloni er vist på 25 min intervaller. I dette eksperimentet, ble data ervervet hver 5 min fra 12 forskjellige kolonier. (A) lysfelt bilder. (B) Venus (YFP) fluorescens image (gjennomsnitt bakgrunn subtrahert til kontoen for endring i bakgrunnen av hele bildebehandling feltet over tid). (C ) Overlay bildet viser pole lokalisering av TSR-Venus-Ub reporter molekyler og heterogenitet i antall molekyler som produseres i 5 min tidsvinduer i ulike celler (lysfelt bildet er speilvendt og Venus bildet er Båndpassdesign filtrert). Klikk here for å se større figur.

Figur 5. Typiske data fra en enkelt tidspunkt i en CoTrAC eksperiment. (A) Venus (YFP) fluorescens bilder. Seks 100 ms eksponeringer ble kjøpt i begynnelsen av hver 5 min tidsintervall. Hver av de seks eksponeringer ble skilt av 900 millisekunder å gi tid til forbigående mørke Venus molekyler som hadde blunket av å bli fluorescerende. (B) For analyse, er image 6 trekkes fra bilde 1 til rette for ubleket molekyler og autofluorescens bakgrunn. Flekker i dette bildet er lokalisert til bestemte celle linjer og kvantifiseres ved sin integrerte fluorescens intensitet. (C) Den gjennomsnittlige integrerte fluorescens av kolonien i A er plottet over 6 bilder (sålokk linje). Montering denne linjen til en eksponensiell decay pluss en konstant offset (stiplet linje) gir et forfall halveringstid på 1 sek. I dette eksperimentet, Venus molekyler photobleach mye raskere enn mobilnettet autofluorescens, så dette betyr at omtrent halvparten av det totale antall Venus molekyler er photobleached i hver ramme. Photobleaching fremgang på ett tidspunkt.

Discussion

Den CoTrAC metoden kan bli generalisert til måle produksjonen av andre proteiner hvor konvensjonelle N-eller C-terminale fluorescerende protein fusjoner kan forstyrre proteinaktivitet. Den CoTrAC strategi har tre unike fordeler fremfor dagens metoder. Først sikrer co-translasjonell fusjon som ett molekyl av den fluorescerende reporter produseres for hvert molekyl av proteinet av interesse, slik at nøyaktig telling av proteinproduksjon i sanntid. Sekund, membran målrettede reporter TSR-Venus gjør single-molekyl deteksjon av fluorescerende reportere, slik at påvisning av proteiner uttrykt på svært lave nivåer. Tredje og viktigst, tillater samtidig translasjonelle spalting av fluorescerende reporter for proteinet av interesse å beholde sin nær-villtype sekvens og fungere normalt-benyttende Ubiquitin som en protease-gjenkjennelsessekvens i E. coli, target proteiner bare skiller seg fra sine villtype peptidsekvenser ved at den første N-terminale N </ Em>-formyl-metionin er endret til metionin.

Når du bruker CoTrAC metoden, er det viktig å huske på at CoTrAC metoden måler antall protein molekyler som produseres ved hver 5-min tid vindu, som er forskjellig fra måling av antall protein molekyler tilstede per celle (dvs. proteinkonsentrasjon). Mest encellede fluorescens genekspresjon analyser måler proteinkonsentrasjon, som er den balanserte resultat av proteinproduksjon og degradering. Derfor må nedbrytningshastigheten for proteinet av interesse vurderes nøye dersom konsentrasjonen måling brukes til å utlede proteinproduksjon informasjon. Videre er protein konsentrasjon utsatt for svingninger forårsaket av oppdeling av protein mellom to datterceller ved celledeling, som kan være av betydning for lavt uttrykk nivå proteiner og feilaktig tolkes som oppstår fra proteinproduksjonen dynamikk. Den CoTrAC metoden kan være modisert for å måle protein konsentrasjon ved ikke photobleaching nyproduserte reporter molekyler, men dette må gjøres med ekstra gransking. Man må verifisere at nedbrytningshastigheter av fluorescerende reporter og proteinet av interesse er like, og at de begge er tilsvarende oppdelt i to datterceller ved celledeling, slik at konsentrasjonen av den fluorescerende reporter gjenspeiler at av proteinet av interesse.

Vi noterer at mens CoTrAC ikke endrer proteinsekvens, endrer tillegg av rapportørgen mRNA sekvens. Derfor transkripsjon og oversettelse dynamikk og / eller mRNA transkript nedbrytningshastigheter kan perturbed. Hvis CoTrAC metoden brukes til å observere proteinproduksjon i villtype sammenheng, er det viktig å sammenligne uttrykket nivåer av målproteinet både i sin villtype sekvens og med CoTrAC fluorescerende fusion taggen (f.eks i ref.. 1 vi sammenlignet CI uttrykk i vår CoTrAC konstrukt som i en vill-type lysogen). Nedenfor vi diskutere hensyn som er nødvendige for å generalisere den CoTrAC metoden.

Først diskuterer vi muligheten for å bruke sekvenser enn TSR-Venus-Ub. De generelle krav er: (1) reporteren må være lokalisert til en eller annen posisjon i cellen slik at den ikke diffuse raskt (med TSR, reportere er på cellen polene ^1). Dette er nødvendig for en enkelt molekyl påvisning av en fluorescerende proteinmolekyl som signalet fra en raskt spre fluorescerende protein molekyl vil vanligvis ikke være påviselig ovenfor cellens autofluorescent bakgrunn, (2), må den fluorescerende protein være tilstrekkelig lyst å påvises på single-molekyl nivå og må modnes (som lyser) raskt nok for ønsket program (Venus er den raskest modning fluorescerende protein til dato ^7), (3), må den fluorescerende protein bli photobleached etter påvisning slik at nylig fluoriserende proteiner kan være dedetekteres ved senere tidspunkter (fluorescerende proteiner som er altfor motstandsdyktig mot photobleaching er uønsket som overdreven laserstråling kan forårsake fototoksisitetsstudier artefakter), (4), kan proteasen gjenkjennelsessekvens ikke gitt eventuelle gjenværende aminosyrer på proteinet av interesse som vil forurolige dens funksjonalitet (Ubp1 spalter umiddelbart etter karboksy-terminal Ub rester, slik at ingen ekstra rester i det hele tatt).

Sekund, må en kontrollere at reporter er riktig uttrykt og spaltet. Proteolytisk spaltning skille reporter fra proteinet av interesse må være effektiv, cleavage effektivitet kan måles ved hjelp av Western blot mot reporteren, proteinet av interesse eller begge (antistoffer er kommersielt tilgjengelige for mange fluorescerende proteiner som anti-GFP antistoff JL- 8 fra Clontech, som binder Venus i Western blott). Man bør sikre at ingen uncleaved fusion protein er oppdaget i blotter mot lysater av celler som uttrykker fusjonprotein på høyere nivåer enn det som er forventet i CoTrAC eksperimenter. Dessuten må reporteren og proteinet av interesse bli produsert i forholdet 1:1 etter spalting. Dette kan kontrolleres ved å måle intensiteten av de spaltede bandene i anti-reporter og anti-protein-av-interesse Western blot normalisert av intensiteter av uncleaved bandene i stammer mangler protease. Hvis reporter og proteinet av interesse er tilstede i forholdet 1:1 etter spalting, og deretter:

Merke seg at siden vestlige blotter måle protein konsentrasjon, vil den resulterende forholdet avviker fra 1:1 hvis reporter og proteinet av interesse oppviser forskjellige nedbrytningshastigheter etter spalting.

Tredje, bør en kontrollere at proteinet av interesse oppviser forventet funksjonalitet etter spalting. Tilstedeværelsen av den store reporteren konstruere fusjon og / eller lokalisering til cellemembranen er forventet å inaktivere fleste transkripsjonsfaktorer (den λ repressor KI var completely inaktive uten Ubp1 uttrykk i våre forsøk ^1). Transformasjon av protease-uttrykkende plasmid bør aktivere proteinet av interesse ved å frigjøre proteinet fra den voluminøse translasjonelle fusjonsplasmider tag. Dette fenomenet gir opphav til andre mulige CoTrAC programmer. Spalting ved Ub karboksy terminus ved Ubp1 har blitt brukt for å eksponere ikke-kanoniske amino-terminale aminosyrer for å belyse den bakterielle N-ende regel proteinnedbrytning ^9. Hvis fusjon til en stor, membran-assosiert reporter inaktiverer en transkripsjonsfaktor (eller andre protein, for eksempel en enzym), kunne dens aktivitet være raskt gjenopprettes av inducing protease uttrykk. CoTrAC kunne brukes til meget raskt "slå på" en preexisting pool av transkripsjonsfaktorer ved å fjerne / legge en inhibitor / co-aktivator eller ellers initiere protease ekspresjon eller aktivitet. Endelig kan uttrykk for den fluorescerende reporter forurolige cellefysiologi og det bør sikres at egenskaper som cellesyklustid er upåvirket, i forsøket beskrevet i Ref. 1, har vi brukt TSR protein som en membran-lokalisering sekvens fordi TSR er allerede et sterkt uttrykt membran protein og en liten økning i TSR uttrykk var ikke forventet å påvirke celle atferd.

Fjerde, når en reporter sekvens enn spesifikt diskuterte TSR-Venus-Ub brukes, bør den tilsvarende avbildning protokollen også bli endret etter behov. For eksempel vil ulike fluorescerende proteiner krever ulike belysning protokoller for å oppnå en god balanse mellom effektiv påvisning fluorescerende protein molekyler, fototoksisitetsstudier fra laser eksponering og photobleaching. Ideelt bør laser magnetisering være på absorbansen toppen av den valgte fluorescerende protein, off-peak eksitasjon krever høyere eksitasjonssignalene intensiteter (og dermed høyere fototoksisitet og autofluorescens bakgrunn) for å oppnå samme fluorescerende protein utslipp og photobleaching egenskaper. Også,avbildning frekvens kan bli endret for å være langsommere eller raskere enn 5 min avhengig toleranse av cellene til fototoksisitet av laserstråling. I våre eksperimenter, 12 separate E. coli kolonier ble fotografert hver 5 min og fulgte for 7-8 celle sykluser før observere betydelige fototoksisitetsstudier defekter ^en.

Endelig er etter tidsintervall filmer av proteinproduksjon ervervet ved CoTrAC eksperiment (eksempler vist i figurene 4 og 5), må fluorescerende protein uttrykk som skal kvantifiseres ved å oppdage fluorescerende flekker tilsvarende en eller flere molekyler, tildele molekyler til individuelle celler og sporing celle linjene. Vi har beskrevet en tilpasset Matlab rutine å studere λ repressor CI produksjon ^1. Kort, må man først identifisere konturene av individuelle celler og tidspunkter tilsvarende celledeling i lysfeltobjektiver bilder mens sporing celle linjer gjennom påfølgende bilderammens. Vi fant at en 5 min tidsintervall var tilstrekkelig kort at en celle i en ramme vanligvis tilsvarte cellen i forrige ramme som det delte flest piksler i et segmentert bilde. I tilfeller der sporadisk store skift av kolonier mellom to påfølgende rammer ble observert, var manuell tildeling av individuelle celler til sine linjer nødvendig. Neste, må man identifisere fluorescerende flekker og kvantifisere deres intensitet. Vi fant at fluorescerende flekker kunne identifiseres ved (1) båndpass filtrering fluorescens bildet for å fjerne lavfrekvente fluorescens bakgrunn (f.eks autofluorescens) og høyfrekvent støy, (2) terskelverdier bildet basert på fluorescens intensitet og (3) å identifisere objekter større enn noen få piksler i thresholded bildet. Objektene i thresholded bildet var passe til en 2-dimensjonal Gaussisk funksjon pluss en konstant bakgrunn, og den integrerte intensiteten av flekk ble tatt som produktet av den amplitude og passform varians.I våre eksperimenter, flere TSR-Venus-Ub reportere ofte samlokalisert på celle polene, noe som skaper flekker som var lysere enn de fra enkle TSR-Venus molekyler. Antallet Venus molekyler innenfor en flekk ble kvantifisert ved å dividere den integrerte intensiteten av stedet ved fluorescensintensiteten av en enkelt Venus molekyl, som ble kvantifisert ved hjelp av en lav-uttrykk-nivå belastning der flekker sjelden inneholder mer enn én fluorescerende protein molekyl. Denne målingen kan bli ytterligere supplert med in vitro målinger av enkelt fluorescerende proteinmolekyler overholdt en glass-slide. Vi har funnet at fluorescerende protein egenskaper er hovedsakelig lik i in vivo og in vitro-systemer med liknende buffer forhold.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Agarose (Low melting temperature)	Lonza	50100
Milli-Q H2O
5×M9 salts			Following recipe described in 9
20% glucose
MgSO4
CaCl2
50×MEM amino acid solution	Invitrogen	11130-051
Temperature-Controlled Growth Chamber Stage adaptor	Bioptechs	FCS-2
Objective Heater	Bioptechs	Model depends on microscope objective
Microaqueduct Slide	Bioptechs	130119-5
Micro cover glasses	VWR	40CIR-1	Can be difficult to source; also available from Bioptechs
Cover glass/slide gasket	Bioptechs	FCS2 0.75 mm
Fluorescence Microscope	Various	Example setup: Coherent Innova 308C Argon-ion laser, Olympus IX-81 microscope, Olympus PlanApo 100X NA 1.45 objective, Metamorph software	Must have laser excitation, automated xyz stage, automation software capable of scripted imaging and autofocus, optics capable of resolving single fluorescent proteins
EM-CCD Camera	Various	Example setup: Andor Ixon DU-898	Must have sufficiently low noise to detect single fluorescent proteins above background