Summary
En protokol til direkte billedvisning af GFP-mærkede proteiner eller autofluorescerende strukturer i de enkelte
Abstract
Drosophila oocyt er blevet oprettet som et alsidigt system til undersøgelse grundlæggende spørgsmål såsom cytoskeletal funktion, celle organisation, og organel struktur og funktion. Tilgængeligheden af forskellige GFP-mærkede proteiner betyder, at mange cellulære processer kan overvåges i levende celler i løbet af minutter eller timer, og anvendelse af denne teknik, har processer såsom RNP transport, epithelial morfogenese, og vævsremodellering blevet beskrevet meget detaljeret i Drosophila oocytter 1,2.
Evnen til at udføre video imaging kombineret med et rigt repertoire af mutanter gør en imponerende vifte af gener og processer, der skal undersøges med utrolige detaljer. Et sådant eksempel er processen med ooplasmic streaming, som begynder ved midten oogenesen 3,4. Denne energisk bevægelse af cytoplasmiske vesikler er mikrotubuli og kinesin-afhængig 5 og giver en nyttig sysmet til at undersøge cytoskeleton funktion på disse stadier.
Her vil jeg præsentere en protokol for tid bortfalder billeddannelse af levende oocytter bruger stort set alle konfokal mikroskopi setup.
Protocol
1. Forberedelse fluer til Dissection
- Bedøve sunde fluer af det ønskede genotype (for eksempel ekspression af et GFP-mærket protein), som er mindre end en uge gamle. Vælg 10-15 store hunner med afrundede creme-farvede underliv.
- Overfør valgte fluer og nogle få (3-5) hanner til et hætteglas indeholdende ny let yeasted mad og lad fluerne at opfede i to dage ved 25 ° C. Der henvises til Weil et al. 6 for detaljer om Drosophila præparat. Opfedning fluerne sikrer, at en række forskellige faser, især trin 8-12, er tilgængelige til billeddannelse. Dårligt opfedes eller unfattened flyver normalt kun indeholde meget tidlige stadier (1-6) og modne (trin 14) oocyter.
2. Udarbejdelse af Oocytter for Imaging Brug af en Upright sammensat mikroskop
- Forbered en standard objektglas ved at anbringe to dækglas til objektglasset, ca 1 cm fra hinanden, ved hjælp af silikone grease. Brug kun nok fedt til at sikre en god tætning mellem dækglasset og objektglasset. Ved at trykke godt ned på hver dækglasset vil sprede fedt tyndt og jævnt. Tilføj nogle halogencarbon olie 27 (Sigma) til tidspunkt mellem dækglassene og dias. De vil tjene som afstandsstykker til at forhindre skade isolerede oocytter i efterfølgende trin. Nej 1,5 dækglas fungerer godt, med en gennemsnitlig tykkelse (0,16-0,18 mm), der passer til den sene fase oocytter.
- Place 2-3 dråber Halocarbon oil 27 på overfladen af et 22 mm 2 dækglas. For at opnå de sundeste oocytter muligt, er en individuel kvinde fjernet fra maden hætteglasset med munden pipettering og forsigtigt deponeret i halogencarbon olie uden først bedøvelse.
- Brug af skarpe dissekering pincet (såsom Dumont # 5), fluen mod dækglasset pin og træk spidsen af maven. Fjern ovarierne ved at trække dem langs overfladen af dækglasset, i olien. Dette vil fremme adhesion af oocytterne til dækglasset.
- Forsigtigt drille hinanden æggestokkene, på udkig efter oocytter, der er mindst stadie 10B i oogenesen. Oocytter på dette stadium, kan identificeres ved at finde æg kamre, hvor oocytten udgør mindst 50-60% af det samlede volumen af ægget kammeret. På dette tidspunkt i oogenesen har follikelceller ligger over oocyt bliver søjleformede, og omgiver ægget på alle sider bortset fra en lille region, hvor forbindelser til sygeplejersken cellerne forbliver. Anvende pincet til at fjerne individuelle oocytter fra ovariole kappe.
- Videre ved hjælp 1-3 hunner, indtil 5-8 ubeskadigede oocytter er blevet isoleret på dækglasset. Fjern eventuelle unuseable væv.
- Omhyggeligt vende dækglasset, der indeholder oocytterne på den forberedte slide således at oocytterne er anbragt mellem de to afstandsstykker. Tryk ikke ned på den omvendte dækglas da det vil ødelægge oocytter. Om nødvendigt tilsættes en lille mængde halogencarbon olie than kanter af "sandwich" at sikre rummet er fyldt. (Valgfrit:. Lad slide hvile i et par minutter for at tillade afvikling af dækglas) Slæden er nu klar til billeddannelse.
3. Udarbejdelse af Oocytter for Imaging anvendelse af en inverteret sammensat mikroskop
- Oocytter dissekeres væsentlige som beskrevet i afsnit 2, bortset fra, at små petriskåle med et glas bunden insert (Mattek, 35 mm) anvendes i stedet for dækglas. Det er unødvendigt at dække prøven, og efter dissektion kan væv afbildes direkte i skålene, men skal man være omhyggelig for at sikre oocytterne forbliver dækket med olie og er ikke tilladt at tørre ud.
4. Levende Imaging
- Bring en oocyt i fokus ved hjælp DIC eller fasekontrastoptik og undersøge oocytten for eventuelle tegn på skader, såsom utætte af cytoplasma, eller udbuling af follicle celler. Kun billede oocytter, der vises sund og ubeskadiget.
- Streaming kan overvåges direkte uden behov for GFP-mærkning, idet æggeblomme vesikler i cytoplasmaet er autofluorescerende 7. Dette signal kan blive fanget i FITC området anvendelsesområdet, men vil sandsynligvis kræve højere forstærkning end dem, der anvendes til GFP-mærkede proteiner.
- De bedste billeder af streaming er fremstillet af optiske sektioner, som er lige under overfladen af oocytten, der hviler mod dækglas / Petri glas. Her ægget er let fladtrykt, hvilket giver en bedre fokusplanet. Billeder kan være fanget på 200X - 1.000 X. Anvendelse af arrangementet beskrevet her, bør luft mål anvendes, da dækglasset danner en barriere mellem oocytten og målet. Det er optimalt, fordi det i høj grad minimerer drift og bevægelse af prøven.
- Når et område af interesse er i fokus, skal du slukke for brighfield optik og skifte til konfokal billeddannelse. Brug af hurtig scanning / preview-funktion af softwaren, skal du justere fokus og vindeefter behov.
- Indstillinger for opsamling vil variere fra mikroskop til mikroskop, men generelle parametre er som følger: Brug en excitationsbølgelængde på ~ 488 nm og en emissionsbølgelængde på ~ 515 nm. Nedsat Z-aksen indfange således at Z-aksen forbliver konstant, med en forsinkelse på 10 sekunder mellem hvert billede. Indfange en testsekvens på 5-10 rammer at sikre oocytten er stationær og fokusplanet er passende.
- En typisk tid lapse-sekvens vil fange mellem 20 - 50 billeder, og kan revideres umiddelbart efter afslutningen at vurdere videokvaliteten. Processen kan gentages for andre celler i glideren, eller yderligere hunner kan dissekeres efter behov.
5. Fejlfinding og fælles problemer
- Drift - Ved brug af en opretstående mikroskop kan celler undertiden glider grund af spredningen af olie. Dette kan minimeres ved kun at anvende tilstrækkelig olie til at dække området under dækglasset. Hvis problemerne fortsætter, skal du bruge mindre silicone grease at anbringe afstandsstykker til diaset.
Bemærk: Nogle konfokale softwarepakker giver mulighed for cellesporing, men generelt er det bedre at opgive billeddannelse af drivende oocytter og i stedet bruge en anden prøve.
- Ingen tegn på streaming - Hvis streaming ikke er indlysende, skyldes det sandsynligvis en af to årsager, enten brændplanet for billedoptagelse er ikke korrekt (normalt for dybt ind i det indre af ægget) eller oocytten er beskadiget. Tid og praksis kan minimere begge fejl.
Representative Results
Billeddannelse af GFP-mærkede proteiner vil variere afhængigt af, hvor stærkt mærket protein udtrykkes. En midt-trins oocyt udtrykker reticulon-lignende 1 (Rtnl-1), exon mærket med GFP 8,9 frembringer stærkt signal. Rtnl-1 ser ud til at co-lokalisere med de lange mikrotubuli til stede under ooplasmic streaming 10 (figur 1A). Rtnl-1 er en god markør for at observere streaming, og er også en indikator for mikrotubulus organisation i sent stadium oocytter.
Ooplasmic streaming i en vildtype æg kammer er tydelig så mærkbar bevægelse af autofluorescerende æggeblomme vesikler ved anvendelse af en indfangnings-hastighed på én ramme hvert 10. sekund (figur 1B). En maksimal fremskrivning af fem billeder kan genereres for at markere vejen for bevægelse vesikler.
Figur 1. Levende billeder af både autofluorescent og GFP-mærkede strukturer. A) En enkelt time-lapse billede af en scene 11 oocyt udtrykker Rtnl1-GFP ved 400X. Rtnl1-GFP-fibre bevæge sig med en bølgelignende bevægelse i streaming oocytter. B) En fem frame maksimal projektion af et trin 10B æg kammer, hvor autofluorescerende æggeblomme vesikler blev afbildet hvert 10. sekund til 50 sekunder alt, ved 400X forstørrelse. Scale bar = 30 um
Discussion
Drosophila oocytter er et alsidigt model system til at tackle en række spørgsmål i relation til funktion og organisering af celler og subcellulære komponenter. En fuldstændig forståelse af protein funktion kræver overvågning af både rumlige og tidsmæssige aspekter af protein adfærd. Fremskridt i både billeddannende systemer og de genetiske værktøjer til rådighed for Drosophilists gør det muligt for selv små laboratorier til at udføre høj kvalitet billeddannelse eksperimenter i levende oocytter. Here I skitserer en protokol for at analysere adfærden af GFP-mærkede eller autofluorescerende proteiner og strukturer i midten og slutningen-oogenesen, der kan anvendes i forbindelse med en række forskellige genetiske baggrunde for at undersøge proteinfunktion.
I denne protokol I beskriver den proces, hvor oocyter bliver forberedt til billeddannelse og de grundlæggende konfokale indstillinger, der vil muliggøre køb af tidsforskydningen video af fluorescerende proteiner og strukturer. Yderligere Details på oocyt fremstilling er beskrevet af Weil et al. 6 En bred vifte af flyve stammer, der udtrykker proteiner, der er endogent mærket via exon-indfangning fås 8, og uendeligt mere proteinvarianter kan konstrueres og genindføres i fluer.
I arbejdet med levende væv, er sundheden af prøverne af afgørende betydning. Egg kamre fra scenen 10B kan udfylde oogenesen i en i det væsentlige autonom mode 11, hvilket gør dem ideelle til kortsigtede billeddiagnostiske undersøgelser. Der skal udvises forsigtighed ved flere vigtige skridt til at få data af høj kvalitet. Under dissektion er det vigtigt at manipulere æggestokke og oocyter så lidt som muligt, og for at minimere tidsrummet mellem dissektion og afslutningen af billeddannelse. Ideelt set skal en lille dissektion station placeres i det samme rum, der huser den konfokale omfang, og kun nogle få æg kamre ad gangen skal afbildes. Antallet anbefales her (5-8) Sikrer, at dissektion tid er minimeret samtidig maksimere sandsynligheden for at opnå god kvalitet billeder. Jeg anbefaler at fange en kort serie af billeder til at vurdere billedkvalitet og bekræfter, at capture indstillinger optimeres, før du tager en længere tid bortfalder sekvens. De fleste software giver de enkelte frames for at blive frelst, og disse billeder kan derefter blive analyseret i en række forskellige måder ved hjælp af ImageJ 12 eller anden software.
Disclosures
Jeg har intet at afsløre.
Acknowledgments
Dette arbejde blev støttet af tilskud GM096076 fra NIH AREA program.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Halocarbon oil 27 | Sigma-Aldrich | H8773-100ML | |
| #5SF Forceps | Fine Science Tools | 11252-00 | |
| Silicon grease | Sigma Aldrich | Z273554-1EA | |
| Glass-bottom Petri dishes | MatTek | P35G-0-20-C |
References
- Becalska, A. N., Gavis, E. R. Lighting up mRNA localization in Drosophila oogenesis. Dev. 136, 2493-2503 (2009).
- He, L., Wang, X., Montell, D. J. Shining light on Drosophila oogenesis: Live imaging of egg development. Curr. Opin. Gen. Dev. 21, 612-619 (2011).
- King, R. C. Ovarian development Drosophila melanogaster. , Academic Press. New York. (1970).
- Spradling, A. C. Developmental genetics of oogenesis. The Development of Drosophila melanogaster. Bate, M., Martinez-Arias, A. 1, Cold Spring Harbor Press. Cold Spring Harbor. 1-70 (1993).
- Serbus, L. R., Cha, B. -J., Theurkauf, W. E., Saxton, W. M. Dynein and the actin cytoskeleton control kinesin-driven cytoplasmic streaming in Drosophila oocytes. Dev. 132, 3743-3752 (2005).
- Weil, T. T., Parton, R. M., Davis, I. Preparing Individual Drosophila Egg Chambers for Live Imaging. J. Vis. Exp. (60), e3679 (2012).
- Theurkauf, W. E. Premature microtubule-dependent cytoplasmic streaming in cappuccino and spire mutant oocytes. Science. 265, 2093-2096 (1998).
- Morin, X., Daneman, R., Zavortink, M., Chia, W. A protein trap strategy to detect GFP-tagged proteins expressed from their endogenous loci in Drosophila. PNAS. 98, 15050-15055 (2001).
- Röper, K. Rtnl1 is enriched in a specialized germline ER that associates with ribonucleoprotein granule components. J. Cell Sci. 120, 1081-1092 (2007).
- Pokrywka, N. J., Payne-Tobin, A., Raley-Susman, K. M., Swartzman, S. Microtubules, the ER and Exu: New associations revealed by analysis of mini spindles mutations. Mech. Dev. 126, 289-300 (2009).
- Petri, W. H., Mindrinos, M. N., Lombard, M. F., Margaritis, L. H. In vitro development of the Drosophila chorion.ih a chemically defined organ culture medium. Wilhelm Roux's Arch., Devl. Biol. 186, 351-362 (1979).
- ImageJ [Internet]. , Available from: http://rsbweb.nih.gov/ij/index.html (2013).
