Summary
Een protocol voor levende beeldvorming van GFP-gemerkte eiwitten of autofluorescerende structuren in afzonderlijke
Abstract
De Drosophila eicel is opgericht als een veelzijdig systeem voor het onderzoeken van fundamentele vragen, zoals cytoskelet functie, cel organisatie en organel structuur en functie. De beschikbaarheid van verschillende GFP-gemerkte eiwitten betekent dat vele cellulaire processen kunnen worden gevolgd in levende cellen in de loop van minuten of uren, en het gebruik van deze techniek, zijn processen zoals RNP transport, epitheliale morfogenese en weefselombouw beschreven in detail in Drosophila oöcyten 1,2.
De mogelijkheid om video imaging gecombineerd met een rijke repertoire van mutanten uit te voeren kan een enorme verscheidenheid van genen en processen te onderzoeken in ongelooflijk veel details. Een voorbeeld hiervan is het proces van het ooplasmic streaming, die het initiatiefrecht heeft halverwege de oögenese 3,4. Deze krachtige beweging van cytoplasmatische vesikels is microtubuli en kinesine-afhankelijke 5 en biedt een nuttige systeem voor onderzoek cytoskelet functie in deze fasen.
Hier presenteer ik een protocol voor time lapse imaging van levende eicellen met behulp van vrijwel elke confocale microscopie setup.
Protocol
1. Voorbereiding Flies voor Dissection
- Verdoven gezonde vliegen van de gewenste genotype (bijvoorbeeld expressie van een GFP-gemerkt eiwit) die minder dan een week oud. Selecteer 10 tot 15 grote wijfjes met afgeronde crèmekleurige buik.
- Overdracht van de geselecteerde vliegen en een paar (3-5) mannen aan een houder die nieuw licht gegiste voedsel en laat de vliegen om twee dagen mesten bij 25 ° C. Zie Weil et al.. 6 voor details van Drosophila preparaat. Mesten vliegen zodat verschillende fasen, vooral fasen 8-12, beschikbaar voor beeldvorming. Slecht vetgemest of unfattened vliegt bevatten meestal alleen een zeer vroeg stadium (1-6) en volwassen (fase 14) eicellen.
2. Voorbereiding van Eicellen for Imaging Met behulp van een Upright Compound Microscope
- Bereid een standaard glas dia door het aanbrengen van twee dekglaasjes om de dia, ongeveer 1 cm van elkaar, met behulp van siliconen invettene. Gebruik alleen genoeg vet om een goede afdichting tussen het dekglaasje en schuif te garanderen. Drukken stevig op elk van de dekglaasje zal verspreiden het vet dun en gelijkmatig. Voeg wat Halocarbonolie 27 (Sigma) aan de kruising tussen de dekglaasjes en glijbaan. Zij dienen als afstandhouders voorkomen verwondt geïsoleerd eicellen in opeenvolgende stappen. Nee 1,5 dekglaasjes werken goed, met een gemiddelde dikte (0,16 tot 0.18 mm) dan die van een vergevorderd stadium eicellen past.
- Plaats 2-3 druppels Halocarbonolie 27 op het oppervlak van een 22 mm 2 dekglaasje. Om de gezondste eicellen mogelijk te verkrijgen, wordt een individuele vrouwelijke verwijderd uit het voedsel flacon met behulp van mond pipetteren en voorzichtig gestort in het Halocarbonolie zonder eerst verlamming.
- Met behulp van scherpe ontleden tang (zoals Dumont # 5), pin-the-fly tegen het dekglaasje en trek de punt van de buik. Verwijder de eierstokken door ze langs het oppervlak van het dekglaasje onder de olie. Dit bevordert adhesion van de eicellen naar het dekglaasje.
- Voorzichtig plagen elkaar de eierstokken, op zoek naar eicellen die op zijn minst stadium 10B van oögenese. Eicellen in dit stadium kunnen worden geïdentificeerd door te zoeken naar egg kamers waarin de eicel inneemt ten minste 50-60% van het totale volume van het ei kamer. Op dit punt in oogenese, de follikelcellen bovenop de eicel worden kolomvormige en rond de eicel aan alle zijden, behalve een klein gebied waar verbindingen met de verpleegster cellen blijven. Gebruik de tang om individuele eicellen uit de ovariole schede.
- Ga, met behulp van een tot drie vrouwtjes, totdat vijf-acht onbeschadigde eicellen zijn geïsoleerd op de dekglaasje aan. Verwijder eventuele onbruikbaar weefsel.
- Voorzichtig omkeren het dekglaasje met de eicellen op de bereide zo in dat de eicellen zich tussen de twee afstandsstukken. Druk niet op de omgekeerde dekglaasje als die schade zal toebrengen aan de eicellen. Indien nodig een kleine hoeveelheid Halocarbonolie tHij randen van de "sandwich" om de ruimte te waarborgen gevuld. (Optioneel:. Laat slide rusten voor een paar minuten om te zorgen voor de afwikkeling van de dekglaasje) De dia is nu klaar voor de beeldvorming.
3. Voorbereiding van Eicellen for Imaging behulp van een omgekeerde samengestelde microscoop
- Eicellen worden ontleed in hoofdzaak zoals beschreven in hoofdstuk 2, behalve dat kleine petrischalen met een glazen bodem inzetstuk (MatTek, 35 mm) worden in plaats van dekglaasjes gebruikt. Het is onnodig om het monster te dekken, en na sectie weefsel kan direct worden afgebeeld in de gerechten, maar zorg moet worden genomen om ervoor te zorgen de eicellen blijven bedekt met olie en mogen niet uitdrogen.
4. Leef Imaging
- Breng een eicel in beeld met behulp van DIC of fasecontrast optica en onderzoekt de eicel op tekenen van schade, zoals het lekken van cytoplasma, of bolling van follikel cellen. Alleen beeld eicellen die gezond lijken en onbeschadigd zijn.
- Streaming kan direct worden gevolgd zonder GFP labeling, omdat dooier blaasjes in het cytoplasma zijn autofluorescerende 7. Dit signaal kan worden vastgelegd in de FITC bereik van de scope maar zal een hogere gain-instellingen dan die voor GFP-gemerkte eiwitten.
- De beste beelden van de streaming worden verkregen uit optische secties die net onder het oppervlak van de eicel die rust tegen het glas dekglaasje / Petri glas. Hier wordt de eicel is een beetje afgeplat, waardoor voor een betere vlak van focus. Beelden kunnen worden vastgelegd op 200X - 1.000 X. Met de inrichting beschreven, moet lucht doelstellingen worden gebruikt omdat het dekglaasje een barrière vormt tussen de eicel en doel. Dit is optimaal omdat het sterk minimaliseert drift en beweging van het monster.
- Zodra een gebied van belang is in focus, schakelt u de brighfield optiek en schakel over naar confocale beeldvorming. Met behulp van de snelle scan / preview-functie van de software, scherp te stellen en te krijgenindien nodig.
- Instellingen voor capture varieert van microscoop microscoop, maar algemene parameters zijn: Gebruik een excitatiegolflengte van ~ 488 nm en een emissiegolflengte van ~ 515 nm. Zet Z-as vastleggen zodat de Z-as constant blijft, met een vertraging van 10 sec tussen frames. Leg een testsequentie van 5-10 frames om ervoor te zorgen de eicel stilstaat en het vlak van concentratie aangewezen is.
- Een typische time lapse filmpje zal vastleggen tussen 20 - 50 frames, en kan onmiddellijk worden beoordeeld na afloop van video kwaliteit te beoordelen. Het proces kan worden herhaald voor andere cellen in de dia of aanvullende vrouwtjes worden ontleed als nodig.
5. Problemen oplossen en Veelvoorkomende problemen
- Drift - Bij gebruik van een rechtopstaande microscoop, cellen kan soms drijven als gevolg van verspreiding van olie. Dit kan geminimaliseerd worden door alleen voldoende olie om het gebied op grond van haar dekglaasje. Als de problemen aanhouden, gebruiken minder silicone grease aan te brengen afstandhouders aan de dia.
Opmerking: Sommige confocale softwarepakketten zorgen voor cell tracking, maar in het algemeen is het beter om beeldvorming van driften eicellen plaats te verlaten en een ander exemplaar te gebruiken.
- Geen tekenen van streaming - Als streaming niet duidelijk is, is waarschijnlijk te wijten aan twee oorzaken, hetzij het brandvlak voor beeldopname is onjuist (meestal te diep in het inwendige van de eicel) of de eicel beschadigd. Tijd en oefening kan minimaliseren beide fouten.
Representative Results
Beeldvorming van GFP-gemerkte eiwitten afhankelijk van hoe sterk het gecodeerde eiwit tot expressie wordt gebracht. Een mid-stage eicel uiten reticulon-achtige 1 (Rtnl-1), exon getagd met GFP 8,9 produceert een sterk signaal. Rtnl-1 lijkt te co-lokaliseren de lange microtubules aanwezig tijdens ooplasmic streaming 10 (Figuur 1A). Rtnl-1 is een goede marker voor het waarnemen van streaming, en is ook een indicator van microtubuli organisatie in een vergevorderd stadium eicellen.
Ooplasmic streaming in een wildtype ei kamer is duidelijk zichtbaar als beweging van autofluorescerende dooier vesicles wanneer een opnamesnelheid van een frame iedere 10 sec (Figuur 1B). Een maximum projectie vijf frames kan worden gegenereerd om het pad van bewegende vesicles markeren.
Figuur 1. Leven beeldvorming van zowel autofluorescent en GFP-gemerkte structuren. A) Een enkele time-lapse beeld van een etappe 11 eicel uiten Rtnl1-GFP op 400X. Rtnl1-GFP vezels te gaan met een golf-achtige beweging in streaming eicellen. B) Een vijf kader maximale projectie van een fase 10B ei kamer waarin de autofluorescente dooier blaasjes werden elke 10 sec belicht voor 50 sec totaal, bij 400X vergroting. Scale bar = 30 pm
Discussion
Drosophila oöcyten zijn een veelzijdige modelsysteem voor het adresseren van een verscheidenheid van vragen met betrekking tot de functie en organisatie van cellen en subcellulaire componenten. Een volledig begrip van eiwit functie vereist de controle op zowel ruimtelijke en temporele aspecten van eiwitten gedrag. Advances in zowel beeldvorming en de genetische beschikbare instrumenten Drosophilists het mogelijk ook kleine labs van hoge kwaliteit imaging experimenten in levende oöcyten. Here I schetsen een protocol om het gedrag van GFP-gemerkte of autofluorescerende eiwitten te analyseren bij midden-tot late-oögenese die kunnen worden gebruikt in combinatie met verschillende genetische achtergronden van eiwitfunctie sonde.
In dit protocol I beschrijven het proces waarbij eicellen worden bereid voor beeldvorming en de basis confocale instellingen verkrijging van tijdsverloop video van fluorescerende eiwitten en structuren mogelijk maken. Extra details met eicel preparaat beschreven door Weil et al.. 6 A uiteenlopende fly stammen die eiwitten die endogeen zijn gecodeerd via exon-trapping beschikbaar 8 en oneindig eiwitvarianten kunnen worden ontworpen en opnieuw te vliegen.
In het werken met levend weefsel, de gezondheid van de exemplaren van het allergrootste belang. Egg kamers van het podium 10B kunnen voltooien oögenese in een in wezen autonome mode 11, waardoor ze ideaal zijn voor de korte termijn imaging studies. Zorg moet worden genomen op een aantal belangrijke stappen om gegevens van hoge kwaliteit te krijgen. Tijdens dissectie is het belangrijk om eierstokken en eicellen manipuleren zo min mogelijk en de tijd tussen dissectie en de voltooiing van imaging minimaliseren. Idealiter zou een kleine dissectie station zich in dezelfde kamer die de confocale scope herbergt, en slechts enkele eieren kamers tegelijk worden afgebeeld. Het aantal hier aanbevolen (5-8) Zorgt ervoor dat dissectie tijd geminimaliseerd wordt terwijl het maximaliseren van de kans op het verkrijgen van een goede kwaliteit foto's. Ik raad het vastleggen van een korte reeks beelden om de beeldkwaliteit te beoordelen en dat de opname-instellingen worden geoptimaliseerd, voor het vastleggen van een langere time lapse volgorde te bevestigen. De meeste software stelt individuele frames worden opgeslagen, en deze beelden kunnen dan worden geanalyseerd op verschillende manieren met ImageJ 12 of andere software.
Disclosures
Ik heb niets te onthullen.
Acknowledgments
Dit werk werd ondersteund door subsidies GM096076 van de NIH AREA programma.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Halocarbon oil 27 | Sigma-Aldrich | H8773-100ML | |
| #5SF Forceps | Fine Science Tools | 11252-00 | |
| Silicon grease | Sigma Aldrich | Z273554-1EA | |
| Glass-bottom Petri dishes | MatTek | P35G-0-20-C |
References
- Becalska, A. N., Gavis, E. R. Lighting up mRNA localization in Drosophila oogenesis. Dev. 136, 2493-2503 (2009).
- He, L., Wang, X., Montell, D. J. Shining light on Drosophila oogenesis: Live imaging of egg development. Curr. Opin. Gen. Dev. 21, 612-619 (2011).
- King, R. C. Ovarian development Drosophila melanogaster. , Academic Press. New York. (1970).
- Spradling, A. C. Developmental genetics of oogenesis. The Development of Drosophila melanogaster. Bate, M., Martinez-Arias, A. 1, Cold Spring Harbor Press. Cold Spring Harbor. 1-70 (1993).
- Serbus, L. R., Cha, B. -J., Theurkauf, W. E., Saxton, W. M. Dynein and the actin cytoskeleton control kinesin-driven cytoplasmic streaming in Drosophila oocytes. Dev. 132, 3743-3752 (2005).
- Weil, T. T., Parton, R. M., Davis, I. Preparing Individual Drosophila Egg Chambers for Live Imaging. J. Vis. Exp. (60), e3679 (2012).
- Theurkauf, W. E. Premature microtubule-dependent cytoplasmic streaming in cappuccino and spire mutant oocytes. Science. 265, 2093-2096 (1998).
- Morin, X., Daneman, R., Zavortink, M., Chia, W. A protein trap strategy to detect GFP-tagged proteins expressed from their endogenous loci in Drosophila. PNAS. 98, 15050-15055 (2001).
- Röper, K. Rtnl1 is enriched in a specialized germline ER that associates with ribonucleoprotein granule components. J. Cell Sci. 120, 1081-1092 (2007).
- Pokrywka, N. J., Payne-Tobin, A., Raley-Susman, K. M., Swartzman, S. Microtubules, the ER and Exu: New associations revealed by analysis of mini spindles mutations. Mech. Dev. 126, 289-300 (2009).
- Petri, W. H., Mindrinos, M. N., Lombard, M. F., Margaritis, L. H. In vitro development of the Drosophila chorion.ih a chemically defined organ culture medium. Wilhelm Roux's Arch., Devl. Biol. 186, 351-362 (1979).
- ImageJ [Internet]. , Available from: http://rsbweb.nih.gov/ij/index.html (2013).
