Summary
Un protocole d'imagerie en temps réel des protéines GFP-marqués ou des structures autofluorescentes en individuel
Abstract
L'ovocyte chez la drosophile a été établi comme un système polyvalent d'enquêter sur des questions fondamentales telles que la fonction du cytosquelette, l'organisation des cellules, et la structure et la fonction des organites. La disponibilité de diverses protéines GFP-taggés signifie que de nombreux processus cellulaires peuvent être surveillés dans les cellules vivantes au cours des minutes ou des heures, et l'utilisation de cette technique, des procédés tels que la RNP transport, la morphogenèse épithéliale, et le remodelage tissulaire ont été décrits en détail ovocytes chez la drosophile 1,2.
La possibilité d'effectuer une imagerie vidéo combiné avec un riche répertoire de mutants permet une grande variété de gènes et des processus à examiner en détail incroyable. Un exemple en est le processus de diffusion ovoplasmique, qui initie à la mi-ovogenèse 3,4. Ce mouvement vigoureux de vésicules cytoplasmiques est microtubules et la kinésine-dépendante 5 et fournit un sys utilestème d'enquêter sur la fonction du cytosquelette lors de ces étapes.
Ici, je présente un protocole pour l'imagerie laps de temps de vie des ovocytes aide de pratiquement n'importe quelle configuration microscopie confocale.
Protocol
1. Préparation des mouches pour la dissection
- Anesthésier les mouches saines du génotype désiré (par exemple, l'expression d'une protéine GFP-étiqueté) qui sont inférieures à une semaine. Sélectionnez 10-15 femelles de grande taille avec des arrondis de couleur crème abdomen.
- Transférez les mouches sélectionnées et quelques (3-5) mâles dans un flacon contenant de nouveaux aliments légèrement yeasted et permettre aux mouches pour engraisser pendant deux jours à 25 ° C. Reportez-vous à Weil et al. 6 pour les détails de préparation drosophile. Engraissement les mouches veille à ce que des stades différents, en particulier les étapes 8-12, sera disponible pour l'imagerie. Mal engraissés ou unfattened vole habituellement ne contiennent que des stades très précoces (1-6) et matures (stade 14) ovocytes.
2. Préparation des ovocytes d'imagerie utilisant un microscope composé vertical
- Préparer une lame de verre standard par l'apposition de deux lamelles de la lame, à environ 1 cm de distance, à l'aide de silicone GREASe. Utiliser uniquement une graisse suffisante pour assurer une bonne étanchéité entre la lamelle et un toboggan. En appuyant fermement sur chaque lamelle la volonté répartir la graisse couche mince et régulière. Ajouter un peu d'huile halocarbone 27 (Sigma) à la jonction entre les lamelles et le faire glisser. Ils serviront de cales pour empêcher blessant ovocytes isolés dans les étapes ultérieures. N ° 1.5 lamelles fonctionnent bien, avec une épaisseur moyenne (0.16-0.18 mm) qui correspond à celui des ovocytes à un stade avancé.
- Lieu 2-3 gouttes d'huile 27 halocarbure sur la surface d'une lamelle 22 mm 2. Pour obtenir les ovocytes sains possibles, une femelle est retirée du flacon à l'aide alimentaire pipetage à la bouche et lentement déposée dans l'huile sans anesthésiant premier halocarbure.
- En utilisant une pince à dissection (tels que Dumont # 5), la broche à la volée contre la lamelle et retirer le bout de l'abdomen. Enlever les ovaires en les faisant glisser le long de la surface de la lamelle couvre-objet, en vertu de l'huile. Cela permettra de promouvoir adhesion des ovocytes à la lamelle.
- Doucement démêler les ovaires, à la recherche d'ovocytes qui sont 10B étape au moins de l'ovogenèse. A ce stade, les ovocytes peuvent être identifiés par recherche de chambres d'oeuf dans lequel l'ovocyte occupe au moins 50-60% du volume total de la chambre d'oeuf. À ce stade de l'ovogenèse, les cellules folliculaires qui recouvrent l'ovocyte sont devenus colonne, et entourent l'ovocyte de tous les côtés, sauf pour une petite région où les connexions à des cellules nourricières restent. Utilisez la pince pour enlever ovocytes individuels de la gaine ovarioles.
- Procéder, en utilisant des femelles 1-3, 5-8 ovocytes intacts jusqu'à ce que ont été isolées sur la lamelle. Retirez tous les tissus inutilisables.
- Retourner avec précaution la lamelle contenant les ovocytes sur la lame de pré-préparée de telle sorte que les ovocytes sont placés entre les deux entretoises. Ne pas appuyer sur la lamelle inversée car cela endommager les ovocytes. Si nécessaire, ajouter une petite quantité d'huile halocarbone à til bords du "sandwich" pour assurer l'espace est rempli. (Facultatif:. Laisser reposer diapositive pendant plusieurs minutes pour permettre le tassement de la lamelle) La diapositive est maintenant prêt pour l'imagerie.
3. Préparation des ovocytes d'imagerie utilisant un microscope composé inversé
- Les ovocytes sont disséqués essentiellement comme décrit dans la section 2, sauf que les petites boîtes de Pétri avec un insert à fond de verre (MatTek, 35 mm) sont utilisés au lieu des lamelles. Il n'est pas nécessaire de recouvrir l 'échantillon, et après la dissection des tissus peuvent être visualisés directement dans les plats, mais des précautions doivent être prises pour s'assurer que les ovocytes restent couverts d'huile et ne sont pas autorisés à se dessécher.
4. Vivez l'imagerie
- Apportez un ovocyte dans le foyer en utilisant DIC ou optique à contraste de phase et d'examiner l'ovocyte pour tout signe de dommage, comme une fuite du cytoplasme, ou gonflement des cellules folliculaires. Ovocytes seulement les images qui semblent en bonne santé et en bon état.
- Streaming peut être contrôlée directement sans qu'il soit nécessaire pour l'étiquetage GFP, depuis vésicules vitellines dans le cytoplasme sont autofluorescente 7. Ce signal peut être capté dans la gamme FITC de la portée, mais il faudra probablement des réglages de gain plus élevés que ceux qui sont utilisés pour des protéines GFP-marqués.
- Les meilleures images de diffusion en continu sont obtenues à partir de coupes optiques qui sont juste au-dessous de la surface de l'ovocyte qui est en appui contre la vitre couvre-objet / de Petri en verre. Ici, l'ovocyte est légèrement aplati, de permettre une meilleure plan de mise au point. Les images peuvent être capturées à 200X - 1.000 X. En utilisant le dispositif décrit ici, les objectifs de l'air doit être utilisé, puisque la lamelle forme une barrière entre l'ovocyte et objective. Ceci est optimale car elle minimise grandement la dérive et le mouvement de l'échantillon.
- Une fois une région d'intérêt est mis au point, éteignez l'optique brighfield et passer à l'imagerie confocale. Utilisation du balayage rapide / preview fonction du logiciel, ajuster et d'acquérirle cas échéant.
- Les paramètres de capture varie d'un microscope à microscope, mais les paramètres généraux sont les suivants: Utilisation d'une longueur d'onde d'excitation de 488 nm et ~ une longueur d'onde d'émission de ~ 515 nm. Mise en place de l'axe Z de telle sorte que la capture de l'axe Z reste constante, avec un délai de 10 secondes entre les images. Capturer une séquence test de trames de 5-10 pour assurer l'ovocyte est fixe et le plan de focalisation est approprié.
- Une séquence typique de temps écoulé entre la capture sera de 20 à 50 cadres, et peut être examinée immédiatement après l'achèvement d'évaluer la qualité vidéo. Le processus peut être répété pour d'autres cellules dans la diapositive, ou de femelles supplémentaires peuvent être disséqués selon les besoins.
5. Dépannage et commune
- Drift - Lors de l'utilisation d'un microscope droit, les cellules peuvent parfois dérives dues à la diffusion de l'huile. Cela peut être minimisé en utilisant juste assez d'huile pour couvrir la zone sous la lamelle. Si le problème persiste, utilisez g de moins en siliconeRease au intercalaires apposer à la diapositive.
Remarque: Certains logiciels permettent le suivi confocale de cellules, mais en général, il est préférable de renoncer à l'imagerie d'ovocytes à la dérive et au lieu d'utiliser un autre spécimen.
- Aucun signe de streaming - Si le streaming n'est pas évident, il est probablement dû à l'une des deux causes: soit le plan focal pour la capture d'image n'est pas correcte (généralement trop profondément à l'intérieur de l'ovocyte) ou l'ovocyte est endommagé. Temps et la pratique peut réduire à la fois les erreurs.
Representative Results
Imagerie de protéines GFP-marqués varie en fonction de la force avec la protéine marquée est exprimée. Un ovocyte à mi-étape exprimer reticulon-like 1 (Rtnl-1), l'exon étiquetés avec la GFP 8,9 produit un signal fort. Rtnl-1 semble co-localisés avec les microtubules présents pendant de longues continu ovoplasmique 10 (figure 1A). Rtnl-1 est un bon marqueur pour observer en continu, et est également un indicateur de l'organisation des microtubules dans les ovocytes à un stade avancé.
Le streaming ovoplasmique dans une chambre d'œufs de type sauvage est évident que le mouvement notable de vésicules vitellines autofluorescentes lorsque vous utilisez un taux de capture d'une image à chaque (figure 1B) 10 sec. Une projection maximale de cinq images peuvent être générés pour marquer le chemin de vésicules mobiles.
Figure 1. Vivez l'imagerie à la fois autoflstructures uorescentes et GFP-étiqueté. A) Un seul time-lapse image d'une étape 11 ovocytes exprimant Rtnl1-GFP à 400X. Rtnl1-GFP fibres se déplacent avec un mouvement ondulatoire dans les ovocytes en streaming. B) Une projection maximale de cinq châssis d'une chambre oeufs de stade 10B dans laquelle les vésicules vitellines autofluorescentes ont été imagées toutes les 10 secondes pendant 50 sec au total, à un grossissement de 400X. Barre d'échelle = 30 um
Discussion
Ovocytes chez la drosophile constituent un système modèle polyvalent pour traiter une variété de questions liées à la fonction et l'organisation des cellules et des composants subcellulaires. Une compréhension complète de la fonction des protéines nécessite le suivi de ces deux aspects spatiaux et temporels du comportement des protéines. Les progrès dans les deux systèmes d'imagerie et les outils génétiques disponibles pour Drosophilists rendre possible, même pour les petits laboratoires pour effectuer des expériences d'imagerie de haute qualité dans des ovocytes de vie. Ici, je ébaucher un protocole d'analyser le comportement des protéines GFP-étiqueté ou autofluorescente et les structures du milieu à la fin de l'ovogenèse qui peut être utilisé en conjonction avec une variété de contextes génétiques pour sonder la fonction des protéines.
Dans ce protocole I décrire le processus par lequel les ovocytes sont préparés pour l'imagerie et les réglages de base confocaux qui permettront d'acquisition vidéo laps de temps de protéines fluorescentes et des structures. Supplémentaires details sur la préparation des ovocytes sont décrits par Weil et al. 6 Une grande variété de souches de mouches exprimant des protéines qui ont été marqués de façon endogène par l'intermédiaire de l'exon de piégeage sont disponibles 8 et variants de la protéine infiniment plus peuvent être conçus et réintroduite pour les mouches.
En travaillant avec les tissus vivants, la santé des spécimens est d'une importance primordiale. Chambres d'œufs de stade 10B pouvez compléter ovogenèse d'une manière essentiellement autonome 11, ce qui les rend idéales pour des études à court terme d'imagerie. Des précautions doivent être prises lors de plusieurs étapes clés pour obtenir des données de haute qualité. Lors de la dissection, il est important de manipuler les ovaires et d'ovocytes aussi peu que possible, et de minimiser la quantité de temps entre la dissection et l'achèvement de l'imagerie. Idéalement, une station de dissection petite doit être situé dans la même pièce où se trouve le champ confocal, et seulement quelques chambres d'œufs en plusieurs fois devrait être imagé. Le nombre recommandé ici (5-8) Garantit que le temps de dissection est réduit au minimum tout en maximisant la probabilité d'obtenir des images de bonne qualité. Je recommande la capture d'une courte série d'images pour évaluer la qualité d'image et de confirmer que les paramètres de capture sont optimisés, avant de capturer une séquence plus longue laps de temps. La plupart des logiciels permettant d'images individuelles pour être sauvé, et ces images peuvent ensuite être analysées dans une variété de façons en utilisant ImageJ 12 ou d'autres logiciels.
Disclosures
Je n'ai rien à déclarer.
Acknowledgments
Ce travail a été soutenu par des subventions GM096076 du programme AREA NIH.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Halocarbon oil 27 | Sigma-Aldrich | H8773-100ML | |
| #5SF Forceps | Fine Science Tools | 11252-00 | |
| Silicon grease | Sigma Aldrich | Z273554-1EA | |
| Glass-bottom Petri dishes | MatTek | P35G-0-20-C |
References
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