Summary
個々のGFPタグ付きタンパク質または構造体の自家蛍光ライブイメージングのためのプロトコル
Abstract
ショウジョウバエ卵母細胞は、細胞骨格の機能、細胞組織、細胞小器官の構造と機能などの基本的な疑問を調査するための汎用性の高いシステムとして確立されている。各種のGFPタグ融合タンパク質の有用性は、多くの細胞プロセスは数分または数時間かけて生きた細胞で監視されており、この技術を用いてすることができ、そのようなRNP輸送、上皮の形態形成、組織の再構築などのプロセスが非常に詳細に記載されていることを意味しますショウジョウバエ卵母細胞の1,2インチ
変異体の豊かなレパートリーと組み合わせるビデオイメージングを実行する能力は、信じられないほど詳細に検討すべき遺伝子とプロセスの巨大な様々なことができます。その一例が半ば卵形成3,4で開始する卵細胞質のストリーミングのプロセスです。質小胞のこの活発な動きは微小管とキネシン依存5であると便利sysを提供これらの段階で細胞骨格の機能を調べるためのTEM。
ここで私は、ほぼすべての共焦点顕微鏡のセットアップを使用して生きている卵母細胞のタイムラプスイメージングのためのプロトコルを提示。
Protocol
1。解離のハエの準備
- 古い1週間未満アール所望の遺伝子（例えば、GFP標識タンパク質を発現する）の健康なハエを麻酔。丸みを帯びたクリーム色の腹部に10月15日大きなメスを選択します。
- 新しい軽くyeasted食品を含むバイアルに選択されたハエや少数（3-5）男性を転送し、ハエは25℃で2日間太らせることができショウジョウバエの準備の詳細については、ワイルら 6を参照してください。肥育ハエは、ステージの様々な、特にステージ8月12日は、イメージングに利用できることが保証されます。不十分肥育またはunfattenedすると、通常はごく初期段階（1-6）と成熟（ステージ14）卵母細胞が含まれて飛ぶ。
2。直立複式顕微鏡を用いたイメージングのための卵母細胞の調製
- シリコーンgreasを使用して、約1cm離れて、スライドにカバーガラス2を貼付することによって、標準ガラススライドを準備電子。唯一のカバーガラスとスライドとの間の良好なシール性を確保するのに十分なグリスを使用しています。各カバースリップをしっかりと押すと、薄く均一にグリスを広めるでしょう。カバーガラスとスライド間の接合部にいくつかのハロカーボン油27（シグマ）を追加します。彼らは、以降の手順で隔離された卵母細胞を傷つけることを防ぐためにスペーサーとして機能します。第1.5カバーガラスは、後期の卵母細胞のものと一致する平均厚さ（0.16〜0.18ミリメートル）で、うまく機能します。
- 場所2-3は、22ミリメートル2カバーガラスの表面にハロカーボン油27滴。できるだけ健康な卵母細胞を得るためには、個々の女性は、口ピペッティングを用いた食品のバイアルから削除され、静かに第一麻酔なしでハロカーボン油に堆積される。
- 鋭い解剖鉗子（例えばデュモン＃5など）を使用し、カバースリップに対するハエを固定し、腹部の先端をやってのける。油の下、カバースリップの表面に沿ってドラッグすることにより、卵巣を取り外します。これは、索状帯を推進していきますカバースリップに卵母細胞のn。
- そっと卵形成の少なくともステージ10Bアール卵母細胞を探し、卵巣を離れていじめる。この段階での卵母細胞は、卵母細胞、卵室の総容積の少なくとも50から60パーセントを占めている卵室を検索することで識別することができます。卵形成のこの時点では、卵母細胞を覆う包細胞は円柱状となっており、ナース細胞への接続が残っている小さな領域を除いて、すべての側面に卵母細胞を囲む。卵巣管シースから個々の卵母細胞を除去するためにピンセットを使用しています。
- 5月8日無傷の卵母細胞をカバーガラスで隔離されるまで、1〜3人の女性を使用して、進みます。任意の利用不能組織を除去する。
- 慎重に卵母細胞が2つのスペーサーとの間に配置されるように、あらかじめ用意したスライド上に卵母細胞を含むカバースリップを反転させる。それは卵母細胞を傷めますので、反転カバースリップを押し下げないでください。必要であれば、tにハロカーボンオイルを少量加える"サンドイッチ"の彼は縁のスペースを確保するためには満たされている。 （オプション：カバースリップの沈降を可能にするために数分間スライド休息しましょう）のスライドは今イメージングのための準備ができています。
3。倒立複合顕微鏡を用いたイメージングのための卵母細胞の調製
- セクション2で説明したようにガラス底のインサート（マテック、35ミリメートル）でその小さなペトリ皿をカバーガラスの代わりに使用された卵母細胞を除いては、基本的に解剖されています。これは、検体をカバーする必要がなく、解剖後、組織を皿で直接画像化することができますが、注意が卵母細胞は油で覆われており、完全に乾くことは許されません残っているように注意する必要があります。
4。ライブイメージング
- DICや位相コントラスト光学系を用いた焦点に卵を持参し、そのような細胞質の漏出、または包細胞の膨らみなどの損傷の形跡がないかを卵母細胞を調べます。健康で損傷していない画像のみが表示された卵母細胞。
- Strea細胞質内に卵黄胞が7自家あるので銘は、GFP標識を必要とせずに、直接監視することができます。この信号は、オシロスコープのFITCの範囲に取り込むことができますが、可能性が高いGFP標識タンパク質で使用されているものよりも高いゲイン設定が必要になります。
- ストリーミングの最高のイメージがちょうどガラスカバースリップ/ペトリガラスに載っている卵母細胞の表面の下にある光のセクションから取得されます。ここでは卵母細胞は、わずかにピントの良い面のために作り、平坦化される。画像は200Xで捕捉することができます - 千X.カバースリップが卵母細胞と客観の間に障壁を形成するので、ここで説明した構成を使用して、空気の目的は、使用されるべきである。それが大幅にサンプルのドリフトや動きを最小限に抑えられるため、これが最適です。
- 関心領域が合うと、brighfield光学系をオフにして、共焦点イメージングに切り替えます。ソフトウェアの高速スキャン/プレビュー機能を使用して、フォーカス調整とゲイン必要に応じて。
- キャプチャの設定は顕微鏡から顕微鏡に異なりますが、一般的なパラメータは次のとおりです。〜488nmの励起波長および〜515nmの発光波長を使用します。 Z軸はZ軸がフレームの間に10秒の遅れで、一定になるようにキャプチャを設定します。卵母細胞は静止しており、焦点面が適切であることを確認するために5から10フレームのテストシーケンスをキャプチャします。
- 典型的な時間経過のシーケンスは、20の間にキャプチャされます - 50フレーム、ビデオ品質を評価するために、完成した直後に確認することができます。プロセスは、スライド内の他のセルに対して繰り返すことができる、または、必要に応じて追加の女性を解剖することができます。
5。トラブルシューティングとよくある問題
- ドリフトは - 正立顕微鏡を使用する場合、細胞は時々油の拡散のためにドリフトすることができます。これは、カバーガラスの下の面積をカバーするために必要なだけのオイルを使用することによって最小限に抑えることができます。問題が解決しない場合は、少ないシリコーンgを使用するスライドに接辞スペーサーにrease。
注：一部の共焦点ソフトウェアパッケージは細胞追跡を可能にするが、一般的にそれが漂って卵母細胞のイメージングを断念し、代わりに別の試験片を使用することをお勧めします。
- ストリーミングの兆候は - ストリーミングが明らかでない場合、それはおそらく2つの原因のいずれかが原因ではない、どちらかの画像キャプチャのためのフォーカルプレーンが正しくありません（卵母細胞の内部に通常は深すぎる）または卵母細胞が損傷しています。時間と練習が両方のエラーを最小限に抑えることができます。
Representative Results
GFP標識タンパク質のイメージングは、タグ付けされたタンパク質が発現さどれだけ強くかによって異なります。 reticulon様1（Rtnl-1）を発現する中期段階の卵母細胞は、GFP 8,9でタグ付けエクソンは、強い信号を生成する。 Rtnl-1は卵細胞質のストリーミング10（ 図1A）中に存在する長い微小管と共局在することが表示されます。 Rtnl-1は、ストリーミングを観察するための優れたマーカーであり、また、後期の卵母細胞における微小管の組織の指標である。
1フレームのキャプチャレート10秒毎（ 図1B）を使用する際に野生の卵室における卵細胞質のストリーミングは自家卵黄胞の顕著な動きとしては明らかである。 5フレームの最大投影は小胞の移動パスをマークするために生成することができます。
図1。 autofl両方のイメージングを生きるuorescentとGFPタグ構造。400XでRtnl1-GFPを発現する卵母細胞のステージ11）は、単一のタイムラプス画像。 Rtnl1-GFPの繊維はストリーミング卵母細胞における波のような動きで移動します。自家卵黄小胞が400Xの倍率で、50秒の合計10秒ごとに結像されたステージ10B卵室のB）は 5フレームの最大投影。スケールバー=30μmで
Discussion
ショウジョウバエの卵母細胞は、細胞と細胞内の成分の機能と組織に関連するさまざまな質問に対処するための汎用性の高いモデル系です。タンパク質の機能を完全に理解するには、タンパク質の挙動の空間的および時間的な側面の両方の監視が必要です。 Drosophilists利用できるイメージングシステムと遺伝の両方のツールの進歩は、それが可能であっても、小さなラボが生きた卵母細胞では、高品質のイメージング実験を実行するために作る。ここで私は、タンパク質の機能を調べるために遺伝的背景の様々な組み合わせで使用することができます後期卵形成半ばから中にGFPタグや自家蛍光タンパク質や構造物の挙動を解析するためのプロトコルの概要を示します。
このプロトコルでは、私は卵母細胞イメージングと蛍光タンパク質との構造の時間経過のビデオの取得を可能にする基本的な共焦点の設定のために準備されるプロセスを説明します。追加のdetai卵母細胞の調製上のlsは、ワイルらによって記載されています。6は 、多種多様な内因エクソントラッピング経由でタグ付けされているタンパク質を発現するハエ株の8入手可能であり、無限に多くのタンパク質変異体を設計し、ハエに再導入することができる。
生体組織での作業では、標本の健康が最も重要である。ステージ10Bから卵室は短期イメージング研究に最適です、基本的には自律ファッション11に卵形成を完了することができます。ケアは、高品質のデータを得るために、いくつかの重要な手順で注意しなければなりません。郭の間にそれはできるだけ少なく卵巣と卵母細胞を操作すると、切開及び撮像が完了するまでの時間を最小限に抑えることが重要です。理想的には、小さな切開ステーションが焦点範囲を収容する同じ部屋に配置されるべきであり、一度に少数の卵室が画像化されるべきである。ここで推奨されている数字（5-8）良い品質の画像を得ることの可能性を最大化しながら、解剖時間を最小にすることを保証します。私は、画像の質を評価し、キャプチャの設定が長い時間経過のシーケンスをキャプチャする前に、最適化されていることを確認するために、画像の短いシリーズを取り込むことをお勧めします。ほとんどのソフトウェアは個々のフレームが保存されることを可能にし、これらの画像は、ImageJの12または他のソフトウェアを使用して様々な方法で分析することができます。
Disclosures
私は、開示することは何もありません。
Acknowledgments
この作品は、NIHの領域のプログラムからの助成金GM096076によってサポートされていました。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Halocarbon oil 27 | Sigma-Aldrich | H8773-100ML | |
| #5SF Forceps | Fine Science Tools | 11252-00 | |
| Silicon grease | Sigma Aldrich | Z273554-1EA | |
| Glass-bottom Petri dishes | MatTek | P35G-0-20-C |
References
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