Summary
Un protocolo para la obtención de imágenes en directo de las proteínas GFP-etiquetados o estructuras autofluorescentes en particular
Abstract
El ovocito Drosophila se ha establecido como un sistema versátil para investigar cuestiones fundamentales tales como la función del citoesqueleto, la organización celular, y la estructura y función de orgánulo. La disponibilidad de varias proteínas etiquetadas con GFP-significa que muchos procesos celulares pueden ser controlados en células vivas en el transcurso de minutos u horas, y el uso de esta técnica, los procesos de transporte, tales como RNP, morfogénesis epitelial, y la remodelación de tejidos se han descrito en gran detalle en Drosophila 1,2 ovocitos.
La capacidad para realizar las imágenes de vídeo combinado con un rico repertorio de mutantes permite una enorme variedad de genes y procesos que se examinarán en detalle increíble. Un ejemplo de ello es el proceso de transmisión de ooplasmic, que se inicia en la mitad de la ovogénesis 3,4. Este vigoroso movimiento de las vesículas citoplasmáticas es microtúbulos y 5 kinesin-dependiente y proporciona un sistema útilTEM para la investigación de la función del citoesqueleto en estas etapas.
Aquí presento un protocolo para obtener imágenes de lapso de tiempo de vida de los ovocitos mediante prácticamente cualquier configuración de microscopía confocal.
Protocol
1. Preparación de moscas para la disección
- Anestesiar moscas sanas del genotipo deseado (por ejemplo, expresión de una proteína GFP-etiquetados) que están a menos de una semana de edad. Seleccione 10-15 hembras de gran tamaño con redondeados de color crema abdomen.
- Transfiera las moscas seleccionados y unos pocos machos (3-5) a un vial que contiene alimento nuevo a la ligera yeasted y permitir que las moscas para engordar durante dos días a 25 ° C. Consulte Weil et al. 6 para los detalles de la preparación de Drosophila. Engorde de las moscas se asegura de que una variedad de etapas, especialmente etapas 8-12, estará disponible para la formación de imágenes. Mal cebados o unfattened vuela por lo general contienen sólo etapas muy tempranas (1-6) y maduros ovocitos (fase 14).
2. Preparación de Ovocitos de Imagen Usando un microscopio compuesto Upright
- Preparar un portaobjetos de vidrio estándar mediante la colocación de dos cubreobjetos al portaobjetos, aproximadamente 1 cm de separación, utilizando de engrase de siliconae. Utilice sólo grasa suficiente para asegurar un buen sellado entre el cubreobjetos y portaobjetos. Presionando firmemente sobre cada cubreobjetos se extienda la grasa de la capa fina y uniforme. Añadir un poco de aceite de halocarbono 27 (Sigma) para la unión entre los cubreobjetos y se deslizan. Servirán como espaciadores para evitar herir a los ovocitos aislados en los pasos siguientes. No. de 1,5 cubreobjetos trabajar bien, con un espesor medio (0,16 a 0,18 mm) que coincide con la de ovocitos en fase tardía.
- Colocar 2-3 gotas de aceite de halocarbono 27 sobre la superficie de un cubreobjetos de 22 mm 2. Para obtener los ovocitos sanos posibles, una hembra se retira del vial alimentos utilizando pipeteo con la boca y suavemente depositado en el aceite de halocarbono sin anestesiar primero.
- Con fuertes pinzas de disección (como Dumont # 5), echar la mosca contra el cubreobjetos y salga de la punta del abdomen. Eliminar los ovarios arrastrándolos a lo largo de la superficie del cubreobjetos, bajo el aceite. Esto promoverá la adhesion de los oocitos para el cubreobjetos.
- Con cuidado separar los ovarios, en busca de ovocitos que son al menos 10B etapa de la ovogénesis. Los ovocitos en esta etapa pueden ser identificados mediante la búsqueda de cámaras de huevo en el que el ovocito ocupa al menos el 50-60% del volumen total de la cámara de huevos. En este punto de la ovogénesis, las células del folículo que recubren el ovocito se han convertido en columnar, y rodean el ovocito en todos los lados excepto por una pequeña región donde las conexiones con las células nodrizas permanecer. Usa los fórceps para extraer ovocitos individuales de la vaina ovariole.
- Proceder, usando a las mujeres 1-3, 5-8 oocitos intactos hasta que se han aislado en el cubreobjetos. Retire cualquier tejido inutilizable.
- Invierta cuidadosamente los cubreobjetos que contiene los ovocitos en el portaobjetos pre-preparado para que los oocitos se coloca entre los dos espaciadores. No ejerza presión sobre el cubreobjetos invertido como que dañará los ovocitos. Si es necesario, agregue una pequeña cantidad de aceite de hidrocarburo halogenado para tél bordes del "sandwich" para asegurar el espacio está lleno. (Opcional:. Dejar reposar diapositiva durante varios minutos para permitir la sedimentación de cubreobjetos) El portaobjetos ahora está listo para formación de imágenes.
3. Preparación de Ovocitos de Imagen Usando un microscopio compuesto invertido
- Los ovocitos se disecan esencialmente como se describe en la sección 2, excepto que las pequeñas cajas de Petri con una pieza de fondo de cristal (MatTek, 35 mm) se utilizan en lugar de cubreobjetos. No es necesario para cubrir la muestra, y después de la disección, el tejido puede ser captado directamente en los platos, pero se debe tener cuidado para asegurar que los oocitos permanecen cubiertos con aceite y no se permite que se seque.
4. Imágenes en directo
- Trae un ovocito en el foco o utilizando DIC óptica de contraste de fases y examinar el ovocito para detectar cualquier signo de daño, tales como fugas de citoplasma, o abombamiento de las células del folículo. Sólo imagen ovocitos que parecen sanos y en buen estado.
- Streaming se puede controlar directamente, sin la necesidad de etiquetado GFP, desde vesículas de yema en el citoplasma son autofluorescentes 7. Esta señal puede ser considerado en el rango FITC del alcance pero es probable que requiera más altos valores de ganancia que los utilizados para las proteínas GFP-etiquetados.
- Las mejores imágenes de transmisión se obtienen a partir de secciones ópticas que están justo debajo de la superficie del ovocito que descansa sobre el cubreobjetos de vidrio / Petri de vidrio. Aquí, el ovocito es ligeramente aplanada, para hacer un mejor plano de foco. Las imágenes pueden capturarse a 200X - 1.000 X. Usando la disposición descrita aquí, los objetivos de aire se debe utilizar, ya que el cubreobjetos forma una barrera entre el ovocito y objetivo. Esto es óptimo debido a que minimiza en gran medida la deriva y el movimiento de la muestra.
- Una vez que una región de interés está en el foco, desconecte la óptica brighfield y cambiar a imagen confocal. Con el rápido escaneo / función de vista previa del software, ajustar el enfoque y ganarsegún sea necesario.
- Configuración para la captura variará de microscopio para microscopio, pero los parámetros generales son las siguientes: Utilice una longitud de onda de excitación de ~ 488 nm y una longitud de onda de emisión de ~ 515 nm. Configurar eje Z de la captura de manera que el eje Z permanece constante, con un retraso de 10 segundos entre los marcos. Capturar una secuencia de ensayo de tramas 5-10 para asegurar el ovocito es estacionario y el plano de enfoque es apropiado.
- Una secuencia de lapso de tiempo típico capturar entre 20 a 50 marcos, y puede ser crítica inmediatamente después de la finalización para evaluar la calidad de vídeo. El proceso se puede repetir para otras células en el portaobjetos, o hembras adicionales puede ser diseccionado, según sea necesario.
5. Solución de problemas y común
- Drift - Cuando se utiliza un microscopio vertical, las células pueden desplazarse a veces debido a la propagación del petróleo. Esto puede minimizarse mediante el uso de sólo aceite suficiente para cubrir el área bajo el cubreobjetos. Si los problemas persisten, use menos g de siliconaREase para separadores colocará en la diapositiva.
Nota: Algunos paquetes de software confocal permite el seguimiento de células, pero en general es mejor abandonar formación de imágenes de los ovocitos de la deriva, y utilizar en su lugar otro espécimen.
- No hay señales de transmisión streaming - Si no es evidente, es probable que se deba a una de dos causas: o bien el plano focal para la captura de la imagen no es correcto (por lo general demasiado profundamente en el interior del ovocito) o el ovocito está dañado. El tiempo y la práctica puede minimizar tanto los errores.
Representative Results
Obtención de imágenes de las proteínas marcadas con GFP puede variar dependiendo de la fuerza con la proteína de la etiqueta se expresa. A mediados de los ovocitos que expresan etapa Reticulon-like 1 (Rtnl-1), el exón etiquetado con GFP 8,9 produce señal fuerte. Rtnl-1 parece co-localizar con los microtúbulos largas presentes durante el flujo ooplasmic 10 (Figura 1A). Rtnl-1 es un buen marcador para la observación de streaming, y es también un indicador de organización de microtúbulos en los ovocitos en fase tardía.
Streaming de Ooplasmic en una cámara de huevos de tipo salvaje es evidente tan notable movimiento de vesículas de yema de autofluorescentes cuando se utiliza una velocidad de captura de un cuadro cada 10 seg (Figura 1B). Una proyección máximo de cinco marcos pueden ser generados para marcar el camino de vesículas que se mueven.
Figura 1. Vivir formación de imágenes de ambos autofluorescentes y GFP-etiquetados estructuras. A) Una sola vez-lapse de imágenes de una etapa de 11 ovocitos que expresan GFP en Rtnl1-400X. Rtnl1-GFP fibras se mueven con un movimiento ondulatorio en los ovocitos de streaming. B) una proyección a cinco máximo de trama de una cámara de la etapa de huevo 10B en la que las vesículas autofluorescentes yema fueron imágenes cada 10 seg para 50 total seg, la ampliación de 400X. Barra de escala = 30 m
Discussion
Drosophila ovocitos son un sistema modelo versátil para abordar una variedad de cuestiones relacionadas con el funcionamiento y organización de las células y componentes subcelulares. Una comprensión completa de la función de las proteínas requiere la supervisión de los aspectos espaciales y temporales de la conducta de proteínas. Los avances en ambos sistemas de formación de imágenes y las herramientas genéticas disponibles para Drosophilists hacer posible que incluso pequeños laboratorios para llevar a cabo experimentos de imagen de alta calidad en los ovocitos de vida. Aquí destaco un protocolo para analizar el comportamiento de las proteínas GFP-etiquetados o autofluorescente y estructuras a mediados o finales de la ovogénesis que se puede utilizar en combinación con una variedad de bases genéticas para investigar la función de proteínas.
En este protocolo de describir el proceso por el que los oocitos están preparados para la formación de imágenes y los ajustes básicos confocal que permitan la adquisición de vídeo de lapso de tiempo de proteínas fluorescentes y estructuras. Adicional details en la preparación de los ovocitos se describen por Weil et al. 6 Una amplia variedad de cepas de moscas que expresan proteínas que han sido etiquetados endógenamente a través de exón-atrapamiento están disponibles 8, e infinitamente más variantes de la proteína puede ser diseñado y reintroducidos en las moscas.
En el trabajo con tejido vivo, la salud de los especímenes es de suma importancia. Cámaras de huevo de la etapa 10B Puede completar la ovogénesis de una manera esencialmente autónomo 11, lo que es ideal para los estudios de imagen a corto plazo. Se debe tener cuidado en varias etapas clave para obtener datos de alta calidad. Durante la disección es importante para manipular ovarios y ovocitos en tan poco como sea posible, y para reducir al mínimo la cantidad de tiempo entre la disección y la terminación de formación de imágenes. Idealmente, una estación pequeña disección debe estar ubicado en la misma sala que alberga el ámbito confocal, y sólo unas pocas cámaras de huevo a la vez debe ser fotografiado. El número recomendado aquí (5-8) Asegura que el tiempo disección se minimiza mientras que maximiza la probabilidad de obtener imágenes de buena calidad. Recomiendo la captura de una corta serie de imágenes para evaluar la calidad de imagen y confirmar que los ajustes de captura están optimizados, antes de capturar una secuencia de lapso de tiempo más largo. La mayoría del software permite que las imágenes individuales para ser salvo, y estas imágenes se pueden analizar en una variedad de maneras usando ImageJ 12 u otro software.
Disclosures
No tengo nada que revelar.
Acknowledgments
Este trabajo fue apoyado por el subsidio GM096076 del programa AREA NIH.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Halocarbon oil 27 | Sigma-Aldrich | H8773-100ML | |
| #5SF Forceps | Fine Science Tools | 11252-00 | |
| Silicon grease | Sigma Aldrich | Z273554-1EA | |
| Glass-bottom Petri dishes | MatTek | P35G-0-20-C |
References
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