Summary
Bireyin GFP etiketli proteinlerin ya autofluorescent yapıların canlı görüntüleme için bir protokol
Abstract
Drosophila oosit gibi sitoskeletal fonksiyonu, hücre organizasyonu ve organel yapısı ve fonksiyonu gibi temel soruları araştırmak için çok yönlü bir sistem olarak kurulmuştur. Çeşitli GFP etiketli proteinlerin durumu birçok hücresel süreçleri dakika veya saat boyunca canlı hücreler ve bu tekniği kullanarak izlenebilir anlamına gelir, böyle RNP ulaşım, epitel morfolojilerinden ve doku remodeling gibi süreçler çok detaylı olarak tarif edilmiştir Drosophila oosit 1,2.
Mutantlar zengin repertuarı ile birlikte video görüntüleme gerçekleştirmek için yeteneği genler ve süreçleri muazzam bir çeşitlilik inanılmaz ayrıntılı olarak incelenecektir sağlar. Böyle bir örnek, orta oogenez 3,4 az başlatır ooplazmik akışı, bir süreçtir. Sitoplazmik veziküllerin Bu kuvvetli hareket mikrotübül ve kinesin-bağlı 5 ve yararlı bir sistemi içerirBu aşamada hücre iskeleti fonksiyonlarını araştırmak için tem.
Burada hemen hemen her konfokal mikroskopi kurulumu kullanarak yaşam oositlerin zaman atlamalı görüntüleme için bir protokol mevcut.
Protocol
1. Diseksiyon için Sinekler hazırlanması
- Eski bir haftadan daha kısa olan arzu edilen genotip (örneğin, bir GFP-etiketli protein eksprese eden) sağlıklı sinekleri anestetize. Yuvarlak krem renkli karınları ile 10-15 büyük kadın seçin.
- Yeni hafifçe mayalı gıda ihtiva eden bir şişeye, seçilen sinekler ve birkaç (3-5) erkek aktarın ve sinekler 25 ° C'de iki gün boyunca beslemek izin vermek Drosophila hazırlanması ile ilgili ayrıntılar için Weil ve diğ. 6'ya bakınız. Besi sinekler aşamalarında çeşitli, özellikle aşamaları 8-12, görüntüleme için kullanılabilir olmasını sağlar. Kötü besiye veya unfattened genellikle sadece çok erken dönemlerinde (1-6) ve olgun (evre 14) oosit içeren uçar.
2. Dik Bileşik Mikroskop Kullanarak Görüntüleme için Oosit hazırlanması
- Silikon greas kullanarak, yaklaşık 1 cm aralıklı, slayt iki lamelleri koymak suretiyle standart bir cam slayt hazırlayıne. Sadece lamel ve slayt arasında iyi bir sızdırmazlık sağlamak için yeterli gres kullanmayın. Her lamel bastırarak ince ve eşit gres yayılacak. Lamelleri ve slayt arasındaki noktada bazı Halokarbon yağı 27 (Sigma) ekleyin. Bunlar sonraki adımlarda izole oosit yaralanmasına önlemek için ayırıcılar olarak hizmet edecektir. No 1.5 lamelleri geç evre oositlerin eşleştiğini ortalama kalınlığı (0,16-0,18 mm) ile, iyi çalışır.
- 22 mm'lik 2 lamel yüzeyi üzerinde yer halokarbon yağ 27. 2-3 damla. Mümkün olan sağlıklı oosit elde etmek için tek başına bir dişi ağız pipetleme ile gıda tüpten çıkarıldı ve hafifçe anestezi olmadan önce halokarbon yağ yatırılır.
- Keskin diseksiyon forseps (örneğin Dumont # 5 gibi) kullanarak, lamel karşı sinek bacağına ve karın ucu çekin. Petrol altında, lamel yüzeyi boyunca sürükleyerek yumurtalık çıkarın. Bu adhesio teşvik edeceğizn lamel oositlerin.
- Yavaşça oogenezisin en az evre 10B olan oositlerin arıyor, yumurtalıklar dışında tease. Bu aşamada Oosit oosit yumurta odasının toplam hacminin en az% 50-60 kapladığı yumurta odaları arayan tarafından tespit edilebilir. Bu noktada hayvanlardaki anda, oosit örten folikül hücreleri kolumnar olur ve hemşire hücrelere bağlantıları kalır küçük bir bölge hariç her tarafta oosit çevreleyen var. Ovariole kılıf bireysel oosit kaldırmak için forseps kullanın.
- 5-8 hasarsız oosit lamel izole edilene kadar, 1-3 dişiler kullanarak, devam edin. Herhangi unuseable doku çıkarın.
- Dikkatlice oosit iki aralayıcı arasında konumlandırılmış şekilde önceden hazırlanmış slayt üzerine oosit içeren lamel ters. Bu oositlerin zarar verecektir ters lamel aşağı basmayın. Gerekirse, t halokarbon yağ az miktarda eklemek"sandviç" arasında o kenarlarında boşluk sağlamak için doldurulur. (Opsiyonel:. Lamel yerleşme için izin vermek için birkaç dakika için slayt dinlendirin) slayt artık görüntüleme için hazırdır.
3. Bir Ters Bileşik Mikroskop Kullanarak Görüntüleme için Oosit hazırlanması
- Oosit yerine lamelleri arasında kullanılan bir cam alt uç (Mattek, 35 mm) ile bu küçük Petri yemekler hariç, esas olarak Bölüm 2'de anlatılan disseke edilir. Bu örnek kapsayacak şekilde gereksiz ve diseksiyon sonrası, doku yemekler doğrudan yansıması olabilir, ancak bakım oosit yağ ile kaplı ve kurumasına izin verilmez kalmasını sağlamak için alınmalıdır.
4. Görüntüleme Canlı
- DIC veya faz kontrast optikler kullanılarak odak içine bir yumurta getir ve bu sitoplazma sızıntı veya folikül hücreleri şişkin olarak hasar herhangi bir işaret için oosit inceleyin. Sağlıklı ve hasarsız görünen Resim yalnızca oosit.
- Streasitoplazmada yumurta sarısı veziküllerin 7 autofluorescent olduğundan lama, GFP etiketleme için gerek olmaksızın, doğrudan izlenebilir. Bu sinyal kapsamı FITC aralığında yakalanabilir ama büyük olasılıkla GFP etiketli proteinlerin için kullanılandan daha yüksek kazanç ayarları gerektirir.
- Akışının en iyi görüntü sadece cam lamel / cam petri karşı duran bir yumurtanın yüzeyinin altında olan optik kesit elde edilir. İşte oosit biraz odak daha iyi bir uçak için yapım, düzleştirilir. Görüntüleri 200X de çekilebiliyor - 1,000 X. Lamel oosit ve objektif arasında bir bariyer oluşturur yana düzenleme kullanarak burada açıklanan, hava hedefleri kullanılmalıdır. Büyük ölçüde örnek sürüklenme ve hareketi en aza indirir, çünkü bu en uygunudur.
- Ilgilenilen bölge odak sonra, brighfield optik kapatın ve konfokal görüntüleme geçmek. Yazılım hızlı tarama / önizleme fonksiyonunu kullanarak, odak ayarı ve kazançGerekirse.
- Yakalama ayarları mikroskop mikroskop değişir, ancak genel parametreleri aşağıdaki gibidir: ~ 488 nm dalgaboyu ve ~ 515 nm dalgaboyuna kullanın. Z ekseni Z ekseni çerçeve arasında 10 saniyelik bir gecikme ile sabit kalır, böylece yakalama ayarlayın. Oosit dururken ve odak düzlemi uygun sağlamak için 5-10 kare bir test dizisi yakalayın.
- Tipik bir zaman atlamalı dizisi 20 arasında yakalayacaktır - 50 kare ve video kalitesini değerlendirmek için tamamlanmasından hemen sonra gözden geçirilebilir. Işlem slayt diğer hücreleri için tekrar edilebilir, ya da gerektiğinde ek parçalara dişi olabilir.
5. Sorun Giderme ve Ortak Sorunlar
- Drift - dik bir mikroskop kullanılarak, hücreler bazen nedeniyle petrol yayılmasına kayması olabilir. Bu lamel altındaki alanı kapsayacak şekilde sadece yeterli yağ kullanılarak minimize edilebilir. Sorun devam ederse, daha az silikon g kullanınslayda yapıştırmayın ayırıcılar için rease.
Not: Bazı konfokal yazılım paketleri hücre izleme için izin verir, ama genel olarak sürüklenen oosit görüntüleme terk edip onun yerine başka bir örnek kullanmak daha iyidir.
- Hiçbir akarsu belirtileri - akış belirgin değilse, büyük olasılıkla iki nedenlerinden biri nedeniyle, ya resim çekimi için odak düzlemi doğru değil (genellikle yumurtanın içine çok derin) veya oosit hasarlı. Zaman ve pratik hem hataları en aza indirebilirsiniz.
Representative Results
GFP etiketli proteinlerin Görüntüleme etiketli protein ifade ne kadar güçlü bağlı olarak değişir. Reticulon benzeri 1 (Rtnl-1), ekzon GFP 8,9 ile etiketlendi ifade Bir orta kademe oosit güçlü bir sinyal üretir. Rtnl-1 görünür 10 ooplazmik akışı (Şekil 1A) sırasında mevcut uzun mikrotübül ile işbirliği yerelleştirilmesine. Rtnl-1 akışı gözlemlemek için iyi bir belirteç olduğunu ve aynı zamanda geç evre oositlerinde mikrotübül organizasyonu bir göstergesidir.
Tek kare yakalama oranı her 10 sn (Şekil 1B) kullanırken bir yabani-tip yumurta odasında ooplazmik akarsu autofluorescent sarısı veziküllerin belirgin hareketi gibi açıktır. Beş kare bir maksimum hareket eden bir projeksiyon veziküllerin yol işaretlemek için oluşturulabilir.
Şekil 1. Autofl hem görüntüleme Canlıuorescent ve GFP etiketli yapılar. 400X az Rtnl1-GFP ifade eden bir sahne 11 oositin A) Tek time-lapse görüntü. Rtnl1-GFP elyaf akışı oosit bir dalga gibi hareket hareket. Autofluorescent sarısı veziküller 400X büyütmede, 50 sn toplam her 10 sn görüntülü edildiği bir sahne 10B yumurta odasının B) beş kare maksimum projeksiyon. Ölçek bar = 30 mikron
Discussion
Drosophila oosit hücreleri ve hücre içi bileşenlerin fonksiyon ve organizasyon ile ilgili çeşitli sorular ele almak için çok yönlü bir model sistem vardır. Protein fonksiyonu tam bir anlayış protein davranış hem mekansal ve zamansal yönleri izlenmesini gerektirir. Drosophilists kullanılabilir görüntüleme sistemleri ve genetik araçları hem ilerlemeler mümkün hatta küçük laboratuvarlarında yaşam oositler yüksek kaliteli görüntüleme deneyler gerçekleştirmek için yapmak. Burada protein işlevi yoklamak için genetik geçmişleri çeşitli ile birlikte kullanılabilir geç oogenez orta-sırasında GFP etiketli veya autofluorescent proteinler ve yapıların davranışını analiz etmek için bir protokol özetlemektedir.
Bu protokolde Ben oosit görüntüleme ve floresan proteinleri ve yapıların zaman atlamalı video edinimi sağlayacak temel konfokal ayarları için hazırlanan hangi işlemi açıklar. Ek detaioosit hazırlanması ls Weil ve arkadaşları tarafından tarif edilmiştir. 6 A çeşitli endojen ekson-bindirme ile etiketlenmiş proteinleri ifade sinek suşların 8 mevcuttur ve sonsuz daha fazla protein varyantları mühendislik ve sinekler için yeniden girmesini olabilir.
Canlı doku ile çalışma olarak, örneklerin sağlığı büyük önem taşımaktadır. Sahne 10B dan Yumurta odalarına kısa süreli görüntüleme çalışmaları için ideal bir aslında otonom moda 11 oogenezisin tamamlayabilirsiniz. Bakım kaliteli veri almak için birkaç temel adım at alınmalıdır. Diseksiyon sırasında mümkün olduğunca az yumurtalıklar ve oosit işlemek ve diseksiyon ve görüntüleme tamamlanması arasındaki süreyi en aza indirmek için önemlidir. İdeal olarak, küçük bir diseksiyon istasyonu konfokal kapsamı evler aynı odada yer almalıdır ve bir seferde sadece bir kaç yumurta odaları yansıması olmalıdır. Numarası (5-8 burada önerilen) Kaliteli görüntüler elde olasılığını maksimize ederken diseksiyon zamanı minimize edilmesini sağlar. Ben görüntü kalitesini değerlendirmek ve yakalama ayarları daha uzun bir zaman atlamalı dizisi yakalamadan önce, optimize edilmiş onaylamak için görüntüleri bir dizi kısa yakalama öneririz. Çoğu yazılım ayrı ayrı kareler kaydedilmesini sağlar, ve bu görüntü daha sonra ImageJ 12 ya da başka yazılım kullanarak çeşitli şekillerde olarak analiz edilebilir.
Disclosures
Ben ifşa etmek başka bir şey var.
Acknowledgments
Bu çalışma NIH ALAN programından hibe GM096076 tarafından desteklenmiştir.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Halocarbon oil 27 | Sigma-Aldrich | H8773-100ML | |
| #5SF Forceps | Fine Science Tools | 11252-00 | |
| Silicon grease | Sigma Aldrich | Z273554-1EA | |
| Glass-bottom Petri dishes | MatTek | P35G-0-20-C |
References
- Becalska, A. N., Gavis, E. R. Lighting up mRNA localization in Drosophila oogenesis. Dev. 136, 2493-2503 (2009).
- He, L., Wang, X., Montell, D. J. Shining light on Drosophila oogenesis: Live imaging of egg development. Curr. Opin. Gen. Dev. 21, 612-619 (2011).
- King, R. C. Ovarian development Drosophila melanogaster. , Academic Press. New York. (1970).
- Spradling, A. C. Developmental genetics of oogenesis. The Development of Drosophila melanogaster. Bate, M., Martinez-Arias, A. 1, Cold Spring Harbor Press. Cold Spring Harbor. 1-70 (1993).
- Serbus, L. R., Cha, B. -J., Theurkauf, W. E., Saxton, W. M. Dynein and the actin cytoskeleton control kinesin-driven cytoplasmic streaming in Drosophila oocytes. Dev. 132, 3743-3752 (2005).
- Weil, T. T., Parton, R. M., Davis, I. Preparing Individual Drosophila Egg Chambers for Live Imaging. J. Vis. Exp. (60), e3679 (2012).
- Theurkauf, W. E. Premature microtubule-dependent cytoplasmic streaming in cappuccino and spire mutant oocytes. Science. 265, 2093-2096 (1998).
- Morin, X., Daneman, R., Zavortink, M., Chia, W. A protein trap strategy to detect GFP-tagged proteins expressed from their endogenous loci in Drosophila. PNAS. 98, 15050-15055 (2001).
- Röper, K. Rtnl1 is enriched in a specialized germline ER that associates with ribonucleoprotein granule components. J. Cell Sci. 120, 1081-1092 (2007).
- Pokrywka, N. J., Payne-Tobin, A., Raley-Susman, K. M., Swartzman, S. Microtubules, the ER and Exu: New associations revealed by analysis of mini spindles mutations. Mech. Dev. 126, 289-300 (2009).
- Petri, W. H., Mindrinos, M. N., Lombard, M. F., Margaritis, L. H. In vitro development of the Drosophila chorion.ih a chemically defined organ culture medium. Wilhelm Roux's Arch., Devl. Biol. 186, 351-362 (1979).
- ImageJ [Internet]. , Available from: http://rsbweb.nih.gov/ij/index.html (2013).
