Summary
GFP标记的蛋白质或个人的自体荧光结构的一种协议，用于实时成像
Abstract
果蝇的卵母细胞已被确立为一个多功能的系统调查的基本问题，如细 胞骨架功能，细胞组织和细胞器的结构和功能。各种GFP标记的蛋白质的可用性装置超过几分钟或几小时内的过程中，在活细胞中，使用这种技术可以监测许多细胞过程，如RNP运输，上皮形态和组织重塑过程中已经描述了非常详细在果蝇卵母细胞1,2。
的能力，在视频影像结合多样化的突变使一个巨大的各种基因和程序进行审查，令人难以置信的细节。这方面的一个例子是在卵子发生3,4中的过程的卵胞质流，从而启动。这种剧烈运动的空泡是微动蛋白依赖的，并提供了一个有用的系统在这几个阶段的调查骨架功能的温度。
在这里，我提出一个协议时间的推移生活卵母细胞成像的使用几乎任何激光共聚焦显微镜设置。
Protocol
1。准备苍蝇解剖
- 麻醉健康所需基因型（例如，表达的GFP-标记的蛋白质）是小于一周龄的苍蝇。选择10-15大的女性，圆形的奶油色的腹部。
- 传输所选的苍蝇和几个（3-5）的男性的小瓶中含有新的轻yeasted食品，并允许在25℃下的苍蝇催肥两天的果蝇准备的详细信息，请参阅威尔等6。育肥苍蝇确保各种阶段，尤其是阶段8-12，将可用于成像。不善的育肥或unfattened的，苍蝇通常只包含非常初期的阶段（1-6）和成熟（14期）卵母细胞。
2。使用一个直立的复合式显微镜的成像卵母细胞的制备
- 准备一个标准的玻璃贴上两个盖玻片相距约1厘米的幻灯片，，使用硅greas的幻灯片E。仅使用足够的润滑油，以确保良好的密封效果的盖玻片和幻灯片之间。用力按下每个盖玻片上传播的油脂薄且均匀。添加一些卤化烃油27（Sigma公司）的盖玻片和幻灯片之间的交界处。他们将作为衬垫，防止伤害孤立的卵母细胞在随后的步骤中。号1.5盖玻片很好地工作，与匹配的后期阶段的卵母细胞（0.16-0.18毫米）的平均厚度。
- 将2-3滴卤烃油27的表面上的一个22毫米2盖玻片。为了获得健康的卵母细胞，个别女从食品瓶用口吸液，并轻轻地敷的卤化烃油不先麻醉。
- 使用锋利的解剖镊子（如杜蒙第5），针对盖玻片飞和拉断尖的腹部。通过拖动它们沿盖玻片的表面，在油中取出的卵巢。这将促进表面粘附N的卵母细胞的盖玻片。
- 轻轻挑逗除了卵巢，寻找阶段10B的卵子发生的卵母细胞。在此阶段的卵母细胞，可以识别通过寻找蛋室，其中的卵母细胞占据的总体积的至少50％-60％的蛋室。在卵子发生在这一点上，覆盖在卵母细胞的卵泡细胞已成为柱状，和环绕护士细胞仍然连接到一个小区域以外的所有侧上的卵母细胞。使用钳删除单个卵母细胞从卵巢管套。
- 继续使用1-3女性，在盖玻片上，直到5-8完好的卵母细胞已被隔离。删除任何不能运行组织。
- 小心反转含有使预先准备好的滑动定位的两个隔离件之间的卵母细胞的卵母细胞上的盖玻片。不要按上倒盖玻片，因为这将损坏的卵母细胞。如有必要，添加少量卤烃油吨他边缘的“三明治”，以确保空间被填满。 （可选：让幻灯片休息的几分钟，以便解决盖玻片）。幻灯片已经准备好为成像。
3。卵母细胞的制备用倒置的复合式显微镜的成像
- 卵母细胞解剖基本上在第2条中所描述的，除了一个玻璃的的底部插入（MatTek，35毫米），小培养皿中的盖玻片上，而不是使用。这是不必要的覆盖标本，解剖后，组织可以直接成像的菜，但必须小心，以确保卵母细胞仍然满身油污，且不得干出来的。
4。实时成像
- 带来DIC或相差光学成为关注的焦点和研究的卵母细胞的卵母细胞的损害，如漏水的毛囊细胞的细胞质中，或膨出的任何迹象。图片健康和完好的卵母细胞出现。
- STREA明可以直接监控，而不需要为GFP标记，因为蛋黄囊泡在细胞质中自身荧光7。这个信号可以被捕获在FITC标记的范围的范围内，但可能会需要比那些用于GFP-标记的蛋白质更高的增益设置。
- 得到的流的最佳图像从光学部分的正下方的卵母细胞的表面，靠在玻璃盖玻片/的Petri玻璃。在这里，稍扁的卵母细胞，从而为更好地平面的焦点。可以拍摄的影像200X - 1000 X.使用这里描述的布置，空气的目标应可以使用，因为盖玻片形成的卵母细胞和目标之间的势垒。这是最佳的，因为它极大地减少样品的漂移和运动。
- 一旦一个地区的利益为重点，关闭brighfield的光学和切换到共聚焦成像。使用该软件的快速扫描/预览功能，调节焦距和获得是必要的。
- 用于捕获的设置会有所不同从显微镜显微镜，但一般的参数如下：使用〜488纳米的激发波长和发射波长为〜515 nm。设置Z轴捕获，使得Z轴保持恒定，10秒的帧与帧之间具有滞后。捕获的测试序列的5-10帧，以确保的卵母细胞是静止的，焦点的平面的是适当的。
- 一个典型的时间流逝的顺序将20 - 50之间的帧捕捉，并立即完成后，以评估视频质量可以评论。幻灯片中，该过程可重复进行其他细胞，或根据需要额外女性可以解剖。
5。故障排除和常见问题
- 漂移 - 当使用正置显微镜，细胞有时会漂移由于石油传播。这可以通过仅使用足够的油以覆盖盖玻片下的面积最小化。如果问题仍然存在，请使用较少的硅克rease贴上垫片幻灯片的。
注：有些聚焦软件包允许跟踪的细胞，但一般来说，最好是放弃漂流的卵母细胞的成像，而使用另一个标本。
- 无流的迹象 - 如果流并不明显，这可能是由于两个原因之一，无论是在焦平面图像采集是不正确的（通常也深入到内部的卵母细胞），或已损坏的卵母细胞。时间和实践都可以最大限度地减少错误。
Representative Results
GFP-标记的蛋白质的成像会有所不同，这取决于如何强烈的标签的蛋白的表达。一个中期阶段的卵母细胞表达的reticulon的如1（Rtnl-1），外显子8,9 GFP标记产生的强烈信号。 rtnl-1出现共同定位期间的卵胞质串流10（ 图1A）与的长微管本。 Rtnl-1是一个很好的观察数据流标记，也是中后期卵母细胞的微管组织的一个指标。
野生型蛋室卵胞质流中明显运动的自身荧光的蛋黄囊泡是显而易见的，因此，当使用一帧的捕获速率每10秒（ 图1B）。五帧可以产生的最大投影标记的路径移动泡。
图1。实时成像都autofluorescent和GFP标记的结构。A）单时间推移图像的一个阶段11个卵母细胞表达Rtnl1-GFP 400倍。 Rtnl1-GFP纤维移动流卵母细胞的波浪状运动。五架B）最大的一个阶段10B蛋室的自体荧光黄泡，每10秒拍摄50秒的总，在放大400倍的预测。比例尺= 30微米
Discussion
果蝇的卵母细胞是一种多功能的模型系统的功能和组织细胞和亚细胞成分有关解决各种问题。蛋白质的功能的一个完整的理解，需要的空间和时间方面的蛋白质行为的监测。成像系统和遗传工具提供给Drosophilists的进展有可能使即使是小规模的实验室，以进行高品质的成像实验，在生活的卵母细胞。在这里，我勾勒出一个协议分析GFP标记的自体荧光蛋白和结构的行为在中期到后期卵子发生与品种的遗传背景相结合，可用于探测蛋白质的功能。
在这个协议中，我描述的过程，卵母细胞成像的基本聚焦设置，使采集的视频经过时间的荧光蛋白和结构准备。额外的德泰韦伊等人所描述的6 LS对卵母细胞制备各种各样的飞菌株表达内源性蛋白质已被通过外显 子捕获标签8，无限多的蛋白质变体可设计，并重新引入苍蝇。
在与生物体组织时，试样的健康是非常重要的。蛋室从舞台10B的11基本上是自主的方式，完成卵子使他们短期成像研究的理想选择。必须采取的几个关键步骤，获得高品质的数据。在清扫期间，它是重要的操作尽可能少的卵巢和卵母细胞，并尽量减少解剖和成像的完成之间的时间量。理想的情况下，一个小夹层站应位于容纳共聚焦范围在同一房间内，并且应当被成像蛋室在一个时间只有少数。这个数字在这里推荐（5-8）确保清扫时间最小化，同时最大限度地获得良好的图像质量的可能性。我建议短的系列图像捕捉图像质量评估和确认，捕捉设置进行了优化，拍摄前一个较长的时间间隔序列。大多数软件允许单个帧被保存，然后，这些图像可以在各种使用ImageJ 12或其他软件的方式进行分析。
Disclosures
我什么都没有透露。
Acknowledgments
这项工作是支持由格兰特GM096076从NIH区计划。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Halocarbon oil 27 | Sigma-Aldrich | H8773-100ML | |
| #5SF Forceps | Fine Science Tools | 11252-00 | |
| Silicon grease | Sigma Aldrich | Z273554-1EA | |
| Glass-bottom Petri dishes | MatTek | P35G-0-20-C |
References
- Becalska, A. N., Gavis, E. R. Lighting up mRNA localization in Drosophila oogenesis. Dev. 136, 2493-2503 (2009).
- He, L., Wang, X., Montell, D. J. Shining light on Drosophila oogenesis: Live imaging of egg development. Curr. Opin. Gen. Dev. 21, 612-619 (2011).
- King, R. C. Ovarian development Drosophila melanogaster. , Academic Press. New York. (1970).
- Spradling, A. C. Developmental genetics of oogenesis. The Development of Drosophila melanogaster. Bate, M., Martinez-Arias, A. 1, Cold Spring Harbor Press. Cold Spring Harbor. 1-70 (1993).
- Serbus, L. R., Cha, B. -J., Theurkauf, W. E., Saxton, W. M. Dynein and the actin cytoskeleton control kinesin-driven cytoplasmic streaming in Drosophila oocytes. Dev. 132, 3743-3752 (2005).
- Weil, T. T., Parton, R. M., Davis, I. Preparing Individual Drosophila Egg Chambers for Live Imaging. J. Vis. Exp. (60), e3679 (2012).
- Theurkauf, W. E. Premature microtubule-dependent cytoplasmic streaming in cappuccino and spire mutant oocytes. Science. 265, 2093-2096 (1998).
- Morin, X., Daneman, R., Zavortink, M., Chia, W. A protein trap strategy to detect GFP-tagged proteins expressed from their endogenous loci in Drosophila. PNAS. 98, 15050-15055 (2001).
- Röper, K. Rtnl1 is enriched in a specialized germline ER that associates with ribonucleoprotein granule components. J. Cell Sci. 120, 1081-1092 (2007).
- Pokrywka, N. J., Payne-Tobin, A., Raley-Susman, K. M., Swartzman, S. Microtubules, the ER and Exu: New associations revealed by analysis of mini spindles mutations. Mech. Dev. 126, 289-300 (2009).
- Petri, W. H., Mindrinos, M. N., Lombard, M. F., Margaritis, L. H. In vitro development of the Drosophila chorion.ih a chemically defined organ culture medium. Wilhelm Roux's Arch., Devl. Biol. 186, 351-362 (1979).
- ImageJ [Internet]. , Available from: http://rsbweb.nih.gov/ij/index.html (2013).
