Summary
Ein Protokoll für die Live-Darstellung von GFP-markierten Proteine oder autofluoreszierenden Strukturen in den einzelnen
Abstract
Die Drosophila Eizelle wurde als vielseitiges System für die Untersuchung grundlegender Fragen wie Zytoskelett-Funktion, Zellorganisation und Organellen Struktur und Funktion etabliert. Die Verfügbarkeit verschiedener GFP-markierten Proteinen bedeutet, dass viele zelluläre Prozesse in lebenden Zellen im Laufe von Minuten oder Stunden, und unter Verwendung dieser Technik überwacht werden können, sind Prozesse wie RNP Transport, epithelialen Morphogenese und Geweberemodellierung sehr ausführlich beschrieben worden in Drosophila Oozyten 1,2.
Die Fähigkeit, Video-Bildgebung mit einem reichen Repertoire an Mutanten kombiniert durchführen können eine enorme Vielfalt von Genen und Prozesse in unglaublicher Detail untersucht werden. Ein solches Beispiel ist das Verfahren der ooplasmic Streaming, die in der Mitte der Oogenese 3,4 einleitet. Diese kräftige Bewegung der zytoplasmatischen Vesikeln Mikrotubuli und Kinesin-abhängigen 5 und bietet eine nützliche system für die Untersuchung von Zytoskelett-Funktion in diesen Stadien.
Hier stelle ich ein Protokoll für die Zeitspanne Bildgebung von lebenden Eizellen mit praktisch jeder konfokale Mikroskopie Setup.
Protocol
Ein. Vorbereiten Flies für Dissection
- Anesthetize gesunde Fliegen des gewünschten Genotyps (zum Beispiel Ausdruck einer GFP-markierten Protein), die weniger als eine Woche alt sind. Wählen 10-15 große Weibchen mit abgerundeten cremefarbenen Bauch.
- Übertragen Sie die ausgewählten Fliegen und ein paar (3-5) Männchen in ein Fläschchen mit neuen leicht enthefte Essen und ermöglichen die Fliegen für zwei Tage bei 25 ° C zu mästen Siehe Weil et al. 6 für Details von Drosophila Vorbereitung. Mast die Fliegen sicher, dass eine Vielzahl von Stufen, speziell Stufen 8-12, wird für Bildgebung. Schlecht gemästet oder unfattened fliegt enthalten in der Regel nur sehr frühen Stadien (1-6) und reife (Stufe 14) Oozyten.
2. Vorbereitung der Oozyten for Imaging Mit einem Upright Compound Microscope
- Bereiten Sie eine Standard-Objektträger aus Glas mit der Anbringung zwei Deckgläschen auf den Objektträger, ca. 1 cm Abstand, mit Silikon greasE. Verwenden Sie nur wenig Fett, um eine gute Abdichtung zwischen dem Deckglas und Rutsche zu gewährleisten. Drücken Sie fest auf jede dem Deckglas wird das Fett dünn und gleichmäßig verteilt. Fügen Sie einige Halocarbonöl 27 (Sigma) an der Verbindungsstelle zwischen den Deckgläsern und Rutsche. Sie werden als Abstandshalter dienen, um zu verhindern verletzt isolierte Eizellen in den nachfolgenden Schritten. Nr. 1,5 Deckgläser funktionieren gut, mit einer durchschnittlichen Dicke (0,16-0,18 mm), die der späten Phase Eizellen übereinstimmt.
- Platz 2-3 Tropfen Halocarbonöl 27 auf der Oberfläche eines Deckglases 22 mm 2. Um die gesündesten Eizellen zu erhalten, wird eine einzelne Frau aus der Lebensmittel-Fläschchen mit Pipettieren mit dem Mund entfernt und vorsichtig hinterlegt in der Halocarbonöl ohne vorher betäubende.
- Mit scharfen Pinzette (wie Dumont # 5), Pin die Fliege gegen die Deckglas und ziehen Sie die Spitze des Bauches. Entfernen der Eierstöcke, indem sie entlang der Oberfläche des Deckglases unter dem Öl. Dies fördert adhesion der Oozyten dem Deckglas.
- Gently necken neben der Eierstöcke, auf der Suche nach Eizellen, die mindestens Stufe 10B des Oogenese sind. Oozyten in dieser Phase kann durch die Suche nach Ei Kammern in dem die Oocyte einnimmt mindestens 50-60% des Gesamtvolumens des Eikammer identifiziert werden. An diesem Punkt in Oogenese haben die Follikelzellen, die über der Oozyte geworden säulenförmig, und umgeben die Oozyte allseitig mit Ausnahme eines kleinen Bereichs, wo Verbindungen mit den Nährzellen bleiben. Verwenden Sie die Pinzette einzelnen Oozyten aus dem Ovariole Mantel zu entfernen.
- Fortzufahren, mit 1-3 Weibchen, bis 5-8 unbeschädigten Oozyten auf dem Deckglas isoliert worden sind. Entfernen Sie alle unbrauchbar Gewebe.
- Vorsichtig invertiert das Deckglas mit den Eizellen auf die vorbereiteten so ein, dass die Eizellen zwischen den beiden Abstandshaltern positioniert sind. Drücken Sie nicht auf den invertierten Deckglas, das die Eizellen beschädigen. Falls erforderlich, fügen Sie eine kleine Menge von Halocarbonöl ter Kanten des "Sandwich", um den Raum zu gewährleisten gefüllt ist. (Optional:. Lassen slide rest für ein paar Minuten, um zur Beilegung des Deckglases zu ermöglichen) Der Schlitten ist nun bereit für die Bildgebung.
3. Vorbereitung der Oozyten for Imaging Mit einem Inverted Compound Microscope
- Eizellen werden seziert im Wesentlichen wie in Abschnitt 2 beschrieben, außer dass kleine Petrischalen mit Glasboden Einsatz (MatTek, 35 mm) werden anstelle der Deckgläser verwendet. Es ist nicht notwendig, die Probe zu bedecken, und nach der Sektion, Gewebe können direkt in den Gerichten abgebildet werden, sondern muss darauf geachtet werden, um sicherzustellen, werden die Eizellen bleiben bedeckt mit Öl und dürfen nicht austrocknen.
4. Live-Imaging
- Bringen Sie eine Eizelle in den Fokus unter Verwendung von DIC oder Phasenkontrast-Optik und untersuchen die Eizelle auf Anzeichen von Schäden, wie Austreten von Zytoplasma oder Vorwölbung der Follikelzellen. Nur Bild Eizellen, die gesund und unbeschädigt erscheinen.
- Streaming kann direkt ohne die Notwendigkeit für GFP-Markierungen überwacht werden, da Dotter Vesikel im Zytoplasma autofluoreszierenden 7 sind. Dieses Signal kann im Bereich von FITC Rahmen erfasst werden aber wahrscheinlich erfordern höhere Verstärkungseinstellungen als die für GFP-markierten Proteinen verwendet.
- Die besten Bilder der Streaming werden aus optischen Schnitte, die knapp unterhalb der Oberfläche der Oocyte, die gegen das Deckglas / Petri Glas aufliegt sind erhalten. Hier die Eizelle ist leicht abgeflacht, so dass für eine bessere Fokusebene. Bilder können bei 200X erfasst werden - 1.000 X. Mit der hier beschriebenen Anordnung, sollte die Luft Ziele verwendet werden, da das Deckglas bildet eine Barriere zwischen der Eizelle und objektiv. Dies ist optimal, weil es stark minimiert Drift und Bewegung der Probe.
- Sobald ein Bereich von Interesse ist im Fokus, schalten Sie die brighfield Optik und wechseln konfokale Bildgebung. Mit der schnellen Scan / Vorschau-Funktion der Software, stellen Sie konzentrieren und gewinnenwie nötig.
- Einstellungen für die Aufnahme wird von Mikroskop zu Mikroskop variieren, aber die allgemeinen Parameter sind wie folgt: Verwenden Sie eine Anregungswellenlänge von ~ 488 nm und einer Emissionswellenlänge von ~ 515 nm. Einrichten Z-Achse erfasst, so dass die Z-Achse konstant bleibt, mit einer Verzögerung von 10 Sekunden zwischen den Frames. Erfassen einer Testsequenz von 5-10 Frames um sicherzustellen der Oozyt stationär ist und der Fokusebene angemessen ist.
- Eine typische Zeitspanne Sequenz zwischen 20 einzufangen - 50 Frames und kann sofort nach Fertigstellung, um die Videoqualität zu beurteilen überprüft werden. Das Verfahren kann für andere Zellen im Schieber wiederholt werden, oder zusätzliche Weibchen können wie erforderlich zerlegt werden.
5. Fehlersuche und häufig auftretende Probleme
- Drift - Bei Verwendung eines aufrechten Mikroskop, Zellen können manchmal aufgrund der Verbreitung von Öl treiben. Dies kann durch Verwendung nur soviel Öl, um den Bereich unter dem Deckglas abzudecken minimiert werden. Sollten die Probleme fortbestehen, weniger Silikon-gRease anzubringen Abstandshalter auf die Folie.
Hinweis: Einige konfokalen Softwarepakete ermöglichen cell tracking, aber im Allgemeinen ist es besser, Bildgebung treiben Eizellen verzichten und stattdessen ein anderes Exemplar.
- Keine Anzeichen von Streaming - Wenn Streaming ist nicht ersichtlich, ist es wahrscheinlich auf eine von zwei Ursachen: entweder die Brennebene für die Bilderfassung nicht korrekt ist (in der Regel zu tief in das Innere der Oozyte) oder der Eizelle ist beschädigt. Zeit und Praxis minimieren können sowohl Fehler.
Representative Results
Imaging von GFP-markierten Proteinen wird davon abhängen, wie stark das markierte Protein exprimiert wird. A Mid-Stage Eizelle Ausdruck Retikulon-like 1 (Rtnl-1), Exon mit GFP 8,9 getaggt produziert starkes Signal. Rtnl-1 scheint co-lokalisieren mit den langen Mikrotubuli, die während ooplasmic Streaming 10 (Abbildung 1A). Rtnl-1 ist ein guter Marker für die Beobachtung Streaming und ist auch ein Indikator der Mikrotubuli Organisation im späten Stadium Oozyten.
Ooplasmic Streaming in einem Wildtyp Eikammer ist offensichtlich so stark bemerkbar Bewegung autofluoreszierenden Eigelb Vesikel, wenn ein Capture Rate von einem Frame alle 10 Sekunden (Abbildung 1B). Eine maximale Projektionsfläche von fünf Rahmen erzeugt werden, um den Weg des sich bewegenden Vesikel markieren.
Abbildung 1. Live-imaging sowohl autofluorescent und GFP-markierten Strukturen. A) Ein einzelnes Zeitraffer-Bild von einer Stufe 11 Eizelle Ausdruck Rtnl1-GFP bei 400X. Rtnl1-GFP Fasern bewegen sich mit einer wellenförmigen Bewegung in Streaming Oozyten. B) Ein fünf Rahmen maximalen Projektion einer Stufe 10B Eikammer in dem die Vesikel autofluoreszierenden Dotter alle 10 sec abzubildenden für 50 Sekunden insgesamt wurden, bei 400-facher Vergrößerung. Maßstab = 30 um
Discussion
Drosophila Oozyten sind ein vielseitiges Modellsystem für die Bewältigung einer Vielzahl von Fragen im Zusammenhang mit der Funktion und Organisation von Zellen und Zellbestandteilen. Ein vollständiges Verständnis der Funktion von Proteinen erfordert die Überwachung der beiden räumlichen und zeitlichen Aspekte von Protein Verhalten. Advances in beiden bildgebenden Systemen und den genetischen Werkzeuge zur Verfügung, Drosophilists machen es möglich, auch kleine Labors, um hohe Bildqualität Experimente in lebenden Eizellen durchzuführen. Hier skizziere ich ein Protokoll, das Verhalten von GFP-markierten oder autofluoreszierende Proteine und Strukturen während der mittleren bis späten Oogenese, die in Verbindung mit einer Vielzahl von genetischen Hintergründen verwendet werden kann, um Protein-Funktion untersuchen zu analysieren.
In diesem Protokoll beschreibe ich den Prozess, durch den Eizellen für die Bildgebung und die grundlegenden konfokalen Einstellungen, die Übernahme von Zeitraffer-Video von fluoreszierenden Proteinen und Strukturen ermöglichen wird vorbereitet sind. Zusätzliche details auf Oozyte Herstellung sind von Weil et al. 6 Eine große Vielzahl von Flug-Stämmen exprimierenden Proteine, die endogen sind über Exon-Trapping markiert sind 8 und unendlich Proteinvarianten können entworfen werden und wieder eingeführt, um Fliegen.
In Zusammenarbeit mit lebendem Gewebe, ist die Gesundheit der Proben von größter Bedeutung. Egg Kammern von Stufe 10B Oogenese im Wesentlichen autonom 11 abzuschließen, wodurch sie ideal für kurzfristige Bildgebung. Es muss in mehreren wichtigen Schritte unternommen werden, um qualitativ hochwertige Daten zu erhalten. Beim Präparieren ist es wichtig, Ovarien und Oozyten so wenig wie möglich zu manipulieren, und die Menge an Zeit zwischen Dissektion und der Fertigstellung der Bildgebung zu minimieren. Idealerweise sollte eine kleine Dissektion Sender im gleichen Raum mit dem konfokalen Umfang beherbergt angeordnet sein und nur wenige Kammern Ei zu einem Zeitpunkt abgebildet werden sollte. Die Zahl hier (5-8 empfohlen) Sorgt dafür, dass Dissektion minimiert wird bei gleichzeitiger Maximierung der Wahrscheinlichkeit der Erlangung Bilder von guter Qualität. Ich empfehle Aufnahme eine kurze Serie von Bildern, um die Bildqualität zu beurteilen und bestätigen, dass Capture-Einstellungen optimiert werden, vor der Aufnahme eine längere Zeitspanne Sequenz. Die meisten Software ermöglicht Einzelbildern gespeichert werden, und diese Bilder dann in einer Vielzahl von Wegen mit ImageJ 12 oder andere Software analysiert werden.
Disclosures
Ich habe nichts zu offenbaren.
Acknowledgments
Diese Arbeit wurde durch Zuschüsse GM096076 vom NIH AREA-Programm unterstützt.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Halocarbon oil 27 | Sigma-Aldrich | H8773-100ML | |
| #5SF Forceps | Fine Science Tools | 11252-00 | |
| Silicon grease | Sigma Aldrich | Z273554-1EA | |
| Glass-bottom Petri dishes | MatTek | P35G-0-20-C |
References
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