में प्रोटीन GFP लेबल की इमेजिंग लाइव Published: March 29, 2013 doi: 10.3791/50044

DOI

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Nancy Jo Pokrywka¹

¹Department of Biology, Vassar College

Summary

GFP टैग या व्यक्ति में प्रोटीन autofluorescent संरचनाओं का जीना इमेजिंग के लिए एक प्रोटोकॉल

Abstract

ड्रोसोफिला oocyte cytoskeletal समारोह, सेल, संगठन और organelle संरचना और समारोह के रूप में मौलिक सवालों की जांच के लिए एक बहुमुखी प्रणाली के रूप में स्थापित किया गया है. विभिन्न GFP टैग प्रोटीन की उपलब्धता का मतलब है कि कई सेलुलर प्रक्रियाओं मिनट या घंटे के कोर्स पर जीवित कोशिकाओं, और इस तकनीक का उपयोग करने में नजर रखी जा सकती है, RNP परिवहन, उपकला morphogenesis, और ऊतक remodeling जैसे प्रक्रियाओं महान विस्तार में वर्णित किया गया ड्रोसोफिला oocytes ^1,2 में.

म्यूटेंट के एक अमीर प्रदर्शनों की सूची के साथ संयुक्त वीडियो इमेजिंग प्रदर्शन करने की क्षमता जीन और प्रक्रियाओं की एक विशाल विविधता अविश्वसनीय विस्तार में जांच करने के लिए अनुमति देता है. ऐसा ही एक उदाहरण ooplasmic स्ट्रीमिंग, की प्रक्रिया जो मध्य - oogenesis ^3,4 में initiates है. Cytoplasmic vesicles के इस जोरदार आंदोलन microtubule और ⁵ kinesin पर निर्भर है और एक उपयोगी व्यवस्था प्रदान करता हैइन चरणों में cytoskeleton समारोह की जांच के लिए मंदिर.

मैं यहाँ रहने वाले वस्तुतः किसी भी confocal माइक्रोस्कोपी सेटअप का उपयोग oocytes के समय चूक इमेजिंग के लिए एक प्रोटोकॉल प्रस्तुत करते हैं.

Protocol

1. विच्छेदन के लिए मक्खियों की तैयारी

1. वांछित (उदाहरण के लिए, एक प्रोटीन GFP लेबल व्यक्त) जीनोटाइप है कि कम से कम एक सप्ताह पुराना स्वस्थ मक्खियों anesthetize. गोल क्रीम रंग का पेट के साथ 10-15 बड़े महिलाओं का चयन करें.
2. एक नए हल्के yeasted भोजन युक्त शीशी स्थानांतरण चयनित मक्खियों और कुछ पुरुषों (3-5) और मक्खियों को दो दिनों के लिए 25 डिग्री सेल्सियस पर मोटा करने के लिए अनुमति देते हैं Weil एट अल. ⁶ ड्रोसोफिला तैयारी के विवरण के लिए संदर्भ लें. मेद मक्खियों को सुनिश्चित करता है कि चरणों की एक किस्म है, विशेष रूप से 8-12 चरणों, इमेजिंग के लिए उपलब्ध हो जाएगा. खराब पला है या unfattened मक्खियों आमतौर पर केवल बहुत जल्दी (1-6) चरणों और परिपक्व oocytes (14 चरण) होते.

2. Oocytes की इमेजिंग के लिए तैयार एक ईमानदार यौगिक सूक्ष्मदर्शी का प्रयोग

1. स्लाइड दो coverslips में affixing, के अलावा लगभग 1 सेमी, सिलिकॉन Greas का उपयोग एक मानक गिलास स्लाइड तैयारई. केवल coverslip और स्लाइड के बीच एक अच्छा मुहर सुनिश्चित करने के लिए पर्याप्त तेल का उपयोग करने के लिए. नीचे प्रत्येक coverslip पर मजबूती से दबाने तेल बारीकी और समान रूप से फैल जाएगा. कुछ हेलोकार्बन तेल coverslips और स्लाइड के बीच समय के लिए 27 (सिग्मा). वे spacers के रूप में सेवा के बाद के चरणों में पृथक oocytes घायल को रोकने जाएगा. सं 1.5 coverslips अच्छी तरह से एक औसत मोटाई (0.16-0.18 मिमी) कि देर चरण oocytes की है कि मैच के साथ काम करते हैं.
2. हेलोकार्बन 27 तेल की 2-3 बूंदों एक 22 मिमी ² coverslip की सतह पर रखें. स्वास्थ्यप्रद संभव oocytes प्राप्त करने के लिए, एक व्यक्ति महिला भोजन मुंह pipetting का उपयोग शीशी से निकाल दिया जाता है और धीरे 1 anesthetizing बिना हेलोकार्बन तेल में जमा.
3. तेज विदारक संदंश (# 5 Dumont जैसे) का उपयोग coverslip खिलाफ मक्खी पिन और पेट की नोक खींच. उन्हें coverslip की सतह के साथ तेल के तहत खींचकर अंडाशय निकालें. इस चिपकाव को बढ़ावा देंगेn coverslip के लिए oocytes की.
4. धीरे अलग अंडाशय तंग है, oocytes है कि कम से कम oogenesis के चरण 10B कर रहे हैं के लिए देख रहे हैं. इस स्तर पर oocytes जिसमें oocyte अंडा चैम्बर के कुल मात्रा का कम से कम 50-60% पर अंडा कक्षों के लिए तलाश द्वारा पहचाना जा सकता है. Oogenesis में इस बिंदु पर, कूप oocyte overlying कोशिकाओं खानेदार बन गए हैं, और एक छोटे से क्षेत्र है जहां नर्स कोशिकाओं को कनेक्शन रहते हैं के लिए छोड़कर सभी पक्षों पर oocyte चारों ओर. संदंश का उपयोग करने के लिए व्यक्तिगत oocytes ovariole म्यान से निकाल.
5. आगे बढ़ो, 1-3 महिलाओं का उपयोग करते हुए, जब तक 5-8 undamaged oocytes coverslip पर पृथक किया गया है. किसी भी unuseable ऊतक निकालें.
6. ध्यान से पूर्व तैयार स्लाइड इतना है कि oocytes दो spacers के बीच तैनात हैं पर oocytes युक्त coverslip पलटना. उल्टे coverslip पर प्रेस मत नीचे के रूप में है कि oocytes नुकसान होगा. यदि आवश्यक हो, टी हेलोकार्बन तेल की एक छोटी राशि जोड़वह "सैंडविच" के किनारों को सुनिश्चित करने के लिए अंतरिक्ष भरा है. (वैकल्पिक: कई मिनट के लिए स्लाइड आराम करने दो. coverslip के बसने के लिए अनुमति देने के) स्लाइड इमेजिंग के लिए तैयार है.

3. Oocytes की इमेजिंग के लिए तैयार एक उल्टे यौगिक सूक्ष्मदर्शी का प्रयोग

1. Oocytes अनिवार्य रूप से 2 खंड में वर्णित विच्छेदित कर रहे हैं, कि एक गिलास नीचे डालने (मटेक, 35 मिमी) के साथ छोटे पेट्री डिश को छोड़कर coverslips के बजाय इस्तेमाल कर रहे हैं. यह नमूने को कवर करने के लिए अनावश्यक है, और विच्छेदन के बाद, ऊतक बर्तन में सीधे imaged कर सकते हैं, लेकिन देखभाल सुनिश्चित करने के oocytes तेल के साथ कवर कर रहे हैं और अनुमति के बाहर सूखी नहीं रहते हैं लिया जाना चाहिए.

4. इमेजिंग लाइव

1. डीआईसी या चरण विपरीत प्रकाशिकी का उपयोग करते हुए ध्यान में एक oocyte लाओ और cytoplasm से लीक है, या कूप कोशिकाओं उभड़ा के रूप में इस तरह के नुकसान के किसी भी लक्षण के लिए oocyte की जांच. छवि केवल oocytes कि स्वस्थ और undamaged दिखाई.
2. Streaमिंग GFP लेबलिंग के लिए आवश्यकता के बिना सीधे निगरानी कर सकते हैं, के बाद से cytoplasm में जर्दी vesicles ⁷ autofluorescent हैं. यह संकेत गुंजाइश की FITC रेंज में कब्जा किया जा सकता है, लेकिन संभावना GFP-लेबल प्रोटीन के लिए इस्तेमाल उन लोगों की तुलना में उच्च लाभ सेटिंग्स की आवश्यकता होगी.
3. स्ट्रीमिंग का सबसे अच्छा चित्र ऑप्टिकल वर्गों कि oocyte कि गिलास कांच / coverslip पेट्री के खिलाफ आराम कर रहा है की सतह के ठीक नीचे हैं से प्राप्त कर रहे हैं. यहाँ oocyte थोड़ा चपटा है, ध्यान केंद्रित करने का एक बेहतर विमान के लिए कर रही है. छवियाँ 200X पर कब्जा किया जा सकता है - एक्स हज़ार व्यवस्था का उपयोग कर यहाँ वर्णित है, हवा उद्देश्यों, इस्तेमाल किया जा चाहिए क्योंकि coverslip oocyte और उद्देश्य के बीच एक बाधा रूपों. इस इष्टतम है क्योंकि यह काफी कम से कम और नमूने के बहाव आंदोलन.
4. एक बार ब्याज की एक क्षेत्र के ध्यान में है, बंद brighfield प्रकाशिकी बारी और confocal इमेजिंग स्विच. सॉफ्टवेयर के तेजी से स्कैन / पूर्वावलोकन समारोह का प्रयोग, ध्यान समायोजित और लाभआवश्यक के रूप में.
5. खुर्दबीन से कब्जा करने के लिए सेटिंग्स माइक्रोस्कोप भिन्न हो सकते हैं, लेकिन सामान्य पैरामीटर के रूप में निम्नानुसार हैं: ~ 488 एनएम और ~ 515 एनएम की एक तरंग दैर्ध्य उत्सर्जन के एक उत्तेजना तरंग दैर्ध्य का उपयोग करें. सेट अप z-अक्ष पर कब्जा Z-अक्ष लगातार फ्रेम के बीच 10 सेकंड के अंतराल के साथ रहता है. 5-10 फ्रेम के एक परीक्षण अनुक्रम पर कब्जा करने के लिए सुनिश्चित करें oocyte स्थिर है और ध्यान के विमान उपयुक्त है.
6. 20 के बीच एक विशिष्ट समय व्यतीत हो जाने के अनुक्रम कब्जा होगा - 50 फ्रेम, और तुरंत पूरा होने के बाद की समीक्षा करने के लिए वीडियो की गुणवत्ता का आकलन किया जा सकता है. प्रक्रिया अन्य कोशिकाओं के लिए स्लाइड में दोहराया जा सकता है, या अतिरिक्त महिलाओं के रूप में की जरूरत है dissected किया जा सकता है.

5. समस्या निवारण और आम समस्याएं

1. बहाव - जब एक ईमानदार माइक्रोस्कोप का उपयोग कर, कोशिकाओं कभी कभी तेल के प्रसार की वजह से बहाव कर सकते हैं. यह केवल पर्याप्त तेल का उपयोग coverslip के तहत क्षेत्र को कवर के द्वारा कम किया जा सकता है. यदि समस्या जारी रहती है, कम सिलिकॉन जी का उपयोग करेंस्लाइड को जोड़ना spacers rease.

नोट: कुछ confocal सॉफ्टवेयर संकुल सेल पर नज़र रखने के लिए अनुमति देते हैं, लेकिन सामान्य तौर पर यह बेहतर है बहती oocytes की इमेजिंग का परित्याग करने के लिए और बदले में एक और नमूना का उपयोग करें.

2. स्ट्रीमिंग के कोई संकेत नहीं - यदि स्ट्रीमिंग स्पष्ट नहीं है, यह संभावना है एक दो कारणों की वजह से, या तो छवि पर कब्जा करने के लिए फोकल हवाई जहाज़ सही नहीं है (आमतौर पर oocyte के इंटीरियर में भी गहरी) या oocyte क्षतिग्रस्त है. समय और अभ्यास दोनों त्रुटियों को कम कर सकते हैं.

Representative Results

GFP-लेबल प्रोटीन की इमेजिंग पर निर्भर करता है दृढ़ता से कैसे टैग प्रोटीन व्यक्त की है अलग अलग होंगे. एक मध्य चरण व्यक्त reticulon तरह 1 (Rtnl-1), एक्सॉन GFP ^8,9 के साथ टैग oocyte मजबूत संकेत पैदा करता है. 1-Rtnl करने के लिए प्रकट होता है लंबे समय ooplasmic ¹⁰ स्ट्रीमिंग (चित्रा 1 ए) के दौरान मौजूद सूक्ष्मनलिकाएं के साथ सह स्थानीयकरण का. Rtnl-1 स्ट्रीमिंग के अवलोकन के लिए एक अच्छा मार्कर है, और भी देर से मंच oocytes में microtubule संगठन के एक संकेतक है.

एक wildtype अंडा कक्ष में Ooplasmic स्ट्रीमिंग autofluorescent जर्दी vesicles की नजर आंदोलन के रूप में स्पष्ट है जब एक फ्रेम के कब्जा दर हर 10 सेकंड (चित्रा 1 बी) का उपयोग कर रहा है. पांच तख्तों की एक अधिकतम प्रक्षेपण चलती vesicles के पथ को चिह्नित करने के लिए उत्पन्न किया जा सकता है.

चित्रा 1. दोनों autofl की इमेजिंग जीतेuorescent और GFP टैग संरचनाओं. ए) एक मंच 11 oocyte 400x पर Rtnl1 GFP व्यक्त की एक एकल छवि समय चूक. स्ट्रीमिंग oocytes में एक लहर की तरह गति के साथ Rtnl1 - GFP फाइबर बी) एक मंच 10B अंडा कक्ष में जो autofluorescent जर्दी vesicles 50 सेकंड के कुल के लिए हर 10 सेकंड imaged थे 400x बढ़ाई, के एक पांच फ्रेम अधिकतम प्रक्षेपण चाल. पैमाने बार = 30 सुक्ष्ममापी

Discussion

ड्रोसोफिला oocytes और कोशिकाओं और subcellular घटकों के समारोह में संगठन से संबंधित सवालों की एक किस्म को संबोधित करने के लिए एक बहुमुखी मॉडल व्यवस्था कर रहे हैं. प्रोटीन समारोह की पूरी समझ प्रोटीन व्यवहार के दोनों स्थानिक और लौकिक पहलुओं की निगरानी की आवश्यकता है. दोनों इमेजिंग सिस्टम और आनुवंशिक Drosophilists के लिए उपलब्ध उपकरण के क्षेत्र में अग्रिम लिए भी छोटे प्रयोगशालाओं में रहने वाले oocytes में उच्च गुणवत्ता इमेजिंग प्रयोगों प्रदर्शन करने के लिए यह संभव बनाते हैं. यहाँ मैं देर oogenesis कि आनुवंशिक पृष्ठभूमि की एक किस्म के साथ संयोजन के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है प्रोटीन समारोह की जांच के मध्य के दौरान GFP टैग या autofluorescent प्रोटीन और संरचनाओं के व्यवहार का विश्लेषण करने के लिए एक प्रोटोकॉल रूपरेखा.

इस प्रोटोकॉल में मैं प्रक्रिया है जिसके द्वारा oocytes इमेजिंग और बुनियादी confocal सेटिंग्स कि फ्लोरोसेंट प्रोटीन और संरचनाओं के समय चूक वीडियो के अधिग्रहण सक्षम हो जाएगा के लिए तैयार कर रहे हैं का वर्णन करता है. अतिरिक्त detaioocyte तैयारी पर रास Weil एट अल द्वारा वर्णित हैं ^6. एक मक्खी प्रोटीन है कि endogenously एक्सॉन फँसाने के माध्यम से टैग किया गया है व्यक्त उपभेदों की एक विस्तृत विविधता ⁸ उपलब्ध हैं, और असीम रूप से अधिक प्रोटीन वेरिएंट और इंजीनियर हो सकता है मक्खियों reintroduced.

जीवित ऊतक के साथ काम करने में, नमूनों की स्वास्थ्य सर्वोपरि महत्व का है. चरण 10B से अंडे कक्षों अनिवार्य रूप से एक स्वायत्त ¹¹ फैशन में oogenesis को पूरा करने के लिए, उन्हें अल्पावधि इमेजिंग अध्ययन के लिए आदर्श बना सकते हैं. केयर कई महत्वपूर्ण कदम में लिया जाना चाहिए करने के लिए उच्च गुणवत्ता वाले डेटा प्राप्त कर सकते हैं. विच्छेदन के दौरान यह महत्वपूर्ण है संभव के रूप में छोटे रूप में अंडाशय और oocytes में हेरफेर, और विच्छेदन और इमेजिंग के पूरा होने के बीच समय की राशि को कम करने. आदर्श रूप में, एक छोटे से विच्छेदन स्टेशन है कि confocal गुंजाइश घरों में एक ही कमरे में स्थित होना चाहिए, और एक बार में केवल एक कुछ अंडे कक्षों imaged किया जाना चाहिए. यहाँ की सिफारिश (5-8) यह सुनिश्चित करता है कि विच्छेदन समय कम से कम है जबकि अच्छी गुणवत्ता की छवियों को प्राप्त करने की संभावना को अधिकतम. मैं छवियों की एक छोटी श्रृंखला पर कब्जा करने के लिए छवि गुणवत्ता का आकलन और पुष्टि करते हैं कि कब्जा सेटिंग्स अनुकूलित कर रहे हैं, एक लंबे समय चूक अनुक्रम कब्जा करने से पहले सलाह देते हैं. सबसे सॉफ्टवेयर व्यक्तिगत तख्ते बचाया जा करने की अनुमति देता है, और इन छवियों को तो ¹² ImageJ या अन्य सॉफ्टवेयर का उपयोग करने के तरीके की एक किस्म में विश्लेषण किया जा सकता है.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Halocarbon oil 27	Sigma-Aldrich	H8773-100ML
#5SF Forceps	Fine Science Tools	11252-00
Silicon grease	Sigma Aldrich	Z273554-1EA
Glass-bottom Petri dishes	MatTek	P35G-0-20-C