Summary
개인의 GFP 태그 단백질 또는 autofluorescent 구조의 라이브 영상을위한 프로토콜
Abstract
Drosophila의 난 모세포는 같은 cytoskeletal 기능, 세포 조직 및 세포 기관의 구조와 기능 등의 근본적인 질문에 대해 조사를위한 다양한 시스템으로 설립되었습니다. 다양한 GFP 태그 단백질의 가용성은 여러 세포 프로세스가 몇 분, 아님 몇 시간의 과정을 통해 세포를 사는,이 기술을 사용하여 모니터링 할 수 있다는 것을 의미합니다, 이러한 RNP 교통, 상피 morphogenesis 및 조직 리모델링과 같은 프로세스는 훌륭한 자세히 설명되어 Drosophila의 oocytes의 1,2 인치
돌연변이의 풍부한 레퍼토리와 함께 비디오 이미징을 수행 할 수있는 능력은 유전자 및 프로세스의 거대한 다양한 종류의 놀라운 세부 사항에서 검토 할 수 있습니다. 하나의 예는 중간 oogenesis 3,4에서 시작 ooplasmic 스트리밍의 과정입니다. 세포질 소포의 활발한 움직임은 미세 소관과 kinesin 종속적 인 5 및 유용한 치세요을 제공합니다이 단계에서 세포 골격 기능을 조사하는 TEM.
난 여기 거의 모든 공 촛점 현미경 설정을 사용하여 생활 oocytes의 시간 경과 영상을위한 프로토콜을 제시한다.
Protocol
1. 해부를위한 파리 준비
- 이전보다 일주하는 원하는 유전자형 (예를 들어, GFP-라벨 단백질을 표현)의 건강 파리를 마취. 둥근 크림색 abdomens으로 10-15 대 여성을 선택합니다.
- 새로운 가볍게 yeasted 음식을 포함하는 유리 병에 선택한 파리와 몇 가지 (3-5) 남성을 송금 파리 25 ° C.에서 이틀 동안 살찌 울 수 Drosophila 준비에 대한 자세한 내용은 Weil 외 6.를 참조하십시오. 대비해 한참 지방을 축적 파리 단계의 다양한, 특히 단계 8-12은 이미지에 사용할 수 있도록합니다. 제대로 살 찌우는 또는 unfattened하는 것이 매우 초기 단계 (1-6)과 성숙 (무대 14) oocytes를 포함 이동합니다.
2. 입식 복합 현미경을 사용하여 이미징을위한 Oocytes의 작성
- 실리콘 그리이스를 사용하여 약 1cm 간격의 슬라이드에 두 coverslips을 affixing하여 표준 유리 슬라이드를 준비5. 만 coverslip 및 슬라이드 사이 좋은 도장을 보장하기 위해 충분한 기름을 사용합니다. 각 coverslip에 단단히 아래로 누르면 얇게하고 균일하게 기름을 전파합니다. coverslips 및 슬라이드 사이의 시점에 일부 할로 카본 오일에게 27 일 (시그마)를 추가합니다. 그들은 다음 단계로 분리 oocytes의 손상 방지하기 위해 스페이서 역할을합니다. 번호 1.5 coverslips 늦게 무대 oocytes의 것이 일치하는 평균 두께 (0.16-0.18 mm)로 잘 작동합니다.
- 22mm 2 coverslip의 표면에 장소 할로 카본 오일 27로부터 2-3 방울을. 가능한 가장 건강 oocytes를 구하려면 개인 여자는 입 pipetting을 사용하여 식품 유리 병에서 제거하고 부드럽게 첫번째 anesthetizing없이 할로 카본 오일로 입금됩니다.
- 날카로운 해부 포셉 (예 : 뒤몽 # 5)를 사용하여 coverslip에 대한 플라이를 핀과 복부의 끝을 당겨. 기름 아래에있는 coverslip의 표면을 따라 드래그하여 난소를 제거합니다. 이 adhesio을 촉진합니다N coverslip에 oocytes의.
- 부드럽게 oogenesis 중 적어도 무대 10B 아르 oocytes를 찾고, 난소를 분리 애타게. 이 단계에서 Oocytes는 난 모세포가 난자 챔버의 전체 볼륨의 최소 50~60%를 차지하고있는 계란 챔버를 찾아 식별 할 수 있습니다. 이 시점 oogenesis의에서, 난 모세포 놓인 소낭 세포는 원주가 있으며, 간호사 세포에 대한 연결이 남아 작은 지역을 제외한 모든면에서 난 모세포를 둘러싸고 있습니다. ovariole 칼집에서 개별 oocytes을 제거 포셉을 사용합니다.
- 5-8 큰 피해를 oocytes가 coverslip에 격리 될 때까지, 1-3 여성을 사용하여 진행합니다. 모든 unuseable 조직을 제거합니다.
- 조심스럽게 oocytes가 두 스페이서 사이에 위치되도록 사전 준비를 슬라이드에 oocytes가 포함 된 coverslip을 반전. 그 oocytes를 손상시킬 수로 역 coverslip에 눌러하지 마십시오. 필요한 경우, t에 할로 카본 오일의 작은 금액을 추가"샌드위치"의 그 가장자리 공간 확보를 보장하기위한 가득 차 있습니다. (옵션 :. coverslip의 정착이 가능하도록하기 위해서 몇 분 동안 슬라이드 나머지를 보자) 슬라이드는 이제 이미지에 대한 준비가되었습니다.
3. 역 복합 현미경을 사용하여 이미징을위한 Oocytes의 작성
- Oocytes 대신 coverslips의 사용이 유리 하단 삽입 (MatTek 35 ㎜)과 그 작은 페트리 요리를 제외하고 기본적으로 2 절에서 설명 해부 있습니다. 이 표본을 충당 할 필요가 있으며, 절개 후 조직은 요리에 직접 이미징 될 수 있지만, 치료가 oocytes 기름으로 덮여 들어갔다 건조 할 수 없습니다 유지하기 위해주의해야합니다.
4. 영상 라이브
- DIC 또는 위상 대비 광학을 사용하여 초점에 난 모세포를 가져와 같은 세포질의 누출, 또는 소낭 세포의 불룩 등의 손상의 징후가 난 모세포을 확인합니다. 건강하고 큰 피해가 표시 이미지 만 oocytes.
- Strea세포질에 난황의 소포는 7 autofluorescent 때문에 명나라는 GFP 라벨 필요없이 직접 모니터링 할 수 있습니다. 이 신호는 범위의 FITC 범위에서 캡처 할 수 있지만 가능성이 GFP-라벨 단백질에 사용되는보다 높은 게인 설정이 필요합니다.
- 스트리밍의 가장 좋은 이미지는 단지 유리 coverslip / 페트리 유리에 대해 쉬고 난 모세포의 표면 이하의 광학 섹션에서 얻을 수 있습니다. 다음은 난 모세포가 약간 초점이 더 나은 비행기를 만들고 평평하게되어 있습니다. 이미지는 200X에서 캡처 할 수 - 1,000 X. coverslip의 난 모세포와 목표 사이에 장벽을 형성부터 배열을 사용하면 여기에 설명 된, 공기의 목표는 사용해야합니다. 가 크게 샘플의 드리프트와 움직임을 최소화하기 때문에 최적입니다.
- 관심 지역 초점이되면 brighfield 광학을 해제하고 공 촛점 이미징로 전환합니다. 소프트웨어의 빠른 검색 / 미리보기 기능을 사용하여 초점을 조정하고 얻을 수필요에 따라.
- 캡처를위한 설정 현미경의 현미경을 다를 수 있지만, 일반적으로 매개 변수는 다음과 같습니다 ~ 488 nm의 여기 파장과 ~ 515 nm의 방출 파장을 사용합니다. Z-축 Z 축 프레임 사이의 10 초를 지연으로 일정하게 유지되도록 캡처 설정합니다. 난 모세포는 고정하고 초점 비행기가 적절한 보장하기 위해 5-10 프레임의 테스트 시퀀스를 캡처합니다.
- 전형적인 시간 경과 순서는 20 사이에 캡처됩니다 - 50 프레임, 및 비디오 품질을 평가하는 종료 후 즉시 확인 할 수 있습니다. 과정은 슬라이드에있는 다른 세포에 대해 반복 할 수 있습니다, 또는 필요에 따라 추가 여성은 해부 할 수 있습니다.
5. 문제 해결 및 일반적인 문제
- 드리프트 - 수직 현미경을 사용하는 경우, 전지는 때때로 인해 기름의 확산에 표류 할 수 있습니다. 이것은 coverslip 아래 영역을 커버 만 충분한 오일을 사용하여 최소화 할 수 있습니다. 문제가 계속되면, 더 적은 실리콘 g를 사용하여슬라이드에 부착 스페이서에 rease.
참고 : 일부 공 촛점 소프트웨어 패키지가 셀 추적 할 수 있지만, 일반적으로는 떠도는 oocytes의 이미지를 포기하고 대신 다른 표본을 사용하는 것이 좋습니다.
- 더 스트리밍의 흔적 - 스트리밍이 분명하지 않은 경우가 주로 두 원인 중 하나 일 수 있습니다, 두 이미지 캡처에 대한 초점 평면이 정확하지 않습니다 (보통 난 모세포의 내부에 너무 깊이) 또는 난 모세포가 손상되었습니다. 시간과 연습은 모두 오류를 최소화 할 수 있습니다.
Representative Results
GFP-분류 단백질의 영상은 태그 단백질이 표현되는 방식을 강하게에 따라 달라집니다. reticulon은과 같은 1 (Rtnl-1), 엑손은 GFP 8,9 태그를 표현하는 중간 단계 난 모세포는 강력한 신호를 생성한다. Rtnl-1에 나타납니다 10 ooplasmic 스트리밍 (그림 1A) 동안 현재의 긴 미소와 함께 공동 현지화. Rtnl-1 스트리밍을 관찰하기에 좋은 표시입니다, 또한 늦은 무대 oocytes의 미세 소관 기관의 지표입니다.
한 프레임의 캡쳐 속도마다 10 초 (그림 1B)를 사용할 때 wildtype 달걀 챔버에서 Ooplasmic 스트리밍은 autofluorescent 난황의 소포의 눈에 띄는 움직임으로 분명하다. 다섯 프레임의 최대 돌출부는 이동 소포의 경로를 표시 생성 할 수 있습니다.
1 그림. autofl 모두의 영상을 라이브uorescent와 GFP 태그 구조. 400 배로 확대 한 Rtnl1-GFP를 표현 무대 11 난 모세포의 A) 하나의 시간 경과 이미지입니다. Rtnl1-GFP 섬유는 스트리밍 oocytes의 파도와 같은 모션으로 이동합니다. autofluorescent 난황의 소포가 400 배로 확대 한 확대, 50 초 총마다 10 초를 이미지로 된에 무대 10B 계란 챔버의 B)는 5 프레임 최대 프로젝션입니다. 스케일 바 = 30 μm
Discussion
Drosophila의 oocytes는 세포와 subcellular 구성 요소의 기능과 조직에 관한 질문의 다양한 해결을 위해 다양한 모델 시스템입니다. 단백질 기능의 전체 이해 단백질 행동 모두 공간과 시간적 측면의 모니터링이 필요합니다. Drosophilists 사용할 수 이미징 시스템과 유전 도구 모두에서 진보는 가능도 작은 실험실 생활 oocytes에서 고품질의 영상 실험을 수행 할 수 있도록. 난 여기 단백질 기능을 조사하기 위해 유전 배경을 다양한와 함께 사용할 수있는 늦은 oogenesis 중순에하는 동안 GFP-태그 또는 autofluorescent 단백질과 구조의 동작을 분석 할 수있는 프로토콜을 설명합니다.
이 프로토콜에서 나는 oocytes는 이미징 및 형광 단백질과 구조의 시간 경과 영상 취득이 활성화됩니다 기본 공 촛점 설정을 위해 준비하는 과정을 설명합니다. 추가 detai난 모세포 준비에이게는 Weil 외 의해 설명되어 있습니다. 6 다양한 endogenously 엑손 - 트래핑를 통해 태그 된 단백질을 표현 플라이 변종 8 이용하실 수 있으며, 무한 더 많은 단백질 변형이 설계 및 파리에 다시 제출 할 수 있습니다.
생활 조직과 협력에서, 표본의 건강은 가장 중요한 중요합니다. 무대 10B에서 알 챔버는 단기 이미징 연구에 이상적입니다, 기본적으로 자율적 인 방식으로 11 oogenesis을 완료 할 수 있습니다. 케어는 고품질의 데이터를 얻을 수 몇 가지 주요 단계에서 촬영해야합니다. 해부하는 동안은 가능한 한 작은으로 난소와 oocytes를 조작하고, 해부 및 이미징의 완료 사이의 시간의 양을 최소화하는 것이 중요합니다. 이상적으로, 작은 절개 역은 공 촛점 범위를 소장 같은 방에 있어야하고, 한 번에 몇 계란 챔버는 이미징해야합니다. 번호 (5-8 여기에 권장) 좋은 품질의 이미지를 얻을 가능성을 극대화 해부 시간이 최소화 될 수 있도록합니다. I 이미지 품질을 평가하고 캡처 설정이 더 이상 시간 경과 순서를 캡처하기 전에 최적화되어 있는지 확인 이미지의 짧은 시리즈를 캡처하는 것이 좋습니다. 대부분의 소프트웨어는 개별 프레임을 저장할 수 있으며, 이러한 이미지는 다음 ImageJ 12 다른 소프트웨어를 사용하여 다양한 방법으로 분석 할 수 있습니다.
Disclosures
나는 공개 할 아무 것도 없습니다.
Acknowledgments
이 작품은 NIH 지역 프로그램에서 보조금 GM096076에 의해 지원되었다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Halocarbon oil 27 | Sigma-Aldrich | H8773-100ML | |
| #5SF Forceps | Fine Science Tools | 11252-00 | |
| Silicon grease | Sigma Aldrich | Z273554-1EA | |
| Glass-bottom Petri dishes | MatTek | P35G-0-20-C |
References
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