Summary
Um protocolo para geração de imagens ao vivo das proteínas GFP-tagged ou estruturas autofluorescente no indivíduo
Abstract
O oócito Drosophila tem sido estabelecido como um sistema versátil para a investigação de questões fundamentais, como função do citoesqueleto, a organização das células e organelas estrutura e função. A disponibilidade de várias proteínas GFP-tagged significa que muitos processos celulares podem ser controlados em células vivas ao longo de alguns minutos ou horas, e usando esta técnica, os processos tais como o transporte de RNP, morfogénese epitelial, e remodelação de tecidos têm sido descritos em grande detalhe em Drosophila 1,2 oócitos.
A capacidade de realizar imagens de vídeo combinado com um rico repertório de mutantes permite uma enorme variedade de genes e processos a serem examinados em detalhe incrível. Um exemplo disso é o processo de fluxo contínuo, que inicia ooplasmic em meados de oogénese 3,4. Este movimento vigoroso de vesículas citoplasmáticas é microtúbulos e kinesin-dependente 5 e fornece um sis úteisma de investigação da função do citoesqueleto desses estágios.
Aqui eu apresento um protocolo para imagens de lapso de tempo de oócitos de vida de praticamente qualquer configuração de microscopia confocal.
Protocol
1. Preparando Moscas para Dissecção
- Anestesiar moscas saudáveis com o genótipo desejado (por exemplo, expressando uma proteína marcada com GFP) que estão a menos de uma semana de idade. Selecione 10-15 fêmeas grandes com arredondadas de cor creme abdomens.
- Transferir as moscas seleccionados e alguns (3-5) do sexo masculino para um frasco contendo alimentos ligeiramente fermentado novo e permitir que as moscas para engordar durante dois dias a 25 ° C. Referem-se a Weil et al. 6 para detalhes de preparação Drosophila. Engorda as moscas garante que uma variedade de fases, especialmente fases de 8-12, estará disponível para a imagem latente. Mal engordados ou unfattened voa geralmente contêm apenas estágios iniciais (1-6) e de maturação (estádio 14) ovócitos.
2. Preparação de oócitos for Imaging Usando um microscópio composto Vertical
- Prepare uma lâmina de vidro padrão pela aposição duas lamínulas para o slide, cerca de 1 cm de distância, usando greas siliconee. Só use graxa suficiente para garantir uma boa vedação entre a lamela e slides. Pressionando firmemente em cada lamínula a vai se espalhar a massa fina e uniforme. Adicionar algum óleo halocarbono 27 (Sigma) para a junção entre as lamelas e corrediça. Eles servirão como espaçadores para evitar ferir ovócitos isolados em etapas subseqüentes. Não. 1,5 lamínulas trabalhar bem, com uma espessura média (0,16-,18 mm) que coincide com a de oócitos no estágio final.
- Colocar 2-3 gotas de óleo de halocarbono 27 sobre a superfície de uma lamela de 22 mm 2. Para a obtenção dos oócitos saudáveis possíveis, uma fêmea individual é removida do frasco através de pipetagem alimento boca e suavemente depositada no óleo hidrocarboneto halogenado sem anestesiante primeiro.
- Usando afiadas pinças de dissecação (como Dumont n º 5), pino a voar contra a lamínula e retirar a ponta do abdômen. Remover os ovários, arrastando-os ao longo da superfície da lamela, ao abrigo do óleo. Isto promoverá adhesion dos oócitos para a lamela.
- Suavemente separar os ovários, procurando oócitos que são pelo menos 10B fase de oogênese. Oócitos, nesta fase pode ser identificada por câmaras de ovo em que o oócito ocupa, pelo menos, 50-60% do volume total da câmara do ovo. Neste ponto da oogênese, as células foliculares que recobrem o oócito se tornaram colunar, e rodeiam o oócito em todos os lados com excepção de uma pequena região onde as ligações para as células permanecem enfermeira. Use a pinça para remover oócitos individuais da bainha ovaríolo.
- Prossiga, usando fêmeas 1-3, 5-8 até oócitos não danificados foram isolados na lamela. Remova qualquer tecido inutilizável.
- Cuidadosamente inverter a lamela contendo os oócitos na lâmina pré-preparada de modo a que os oócitos estão posicionadas entre os dois espaçadores. Não pressione a lamela invertido como que vai danificar os ovócitos. Se for necessário, adicionar uma pequena quantidade de óleo de halocarbono para tele bordas do "sanduíche" para garantir o espaço é preenchido. (Opcional:. Deixe resto corrediça durante vários minutos para permitir a sedimentação de lamela) A lâmina está agora pronto para a imagiologia.
3. Preparação de oócitos for Imaging Usando um microscópio composto invertido
- Os oócitos são dissecados, essencialmente como descrito na secção 2, exceto que as pequenas placas de Petri com um inserto de fundo de vidro (MatTek, 35 mm) são usados em vez de lamelas. Não é necessário para cobrir a amostra, e após o esvaziamento, o tecido pode ser trabalhada diretamente nos pratos, mas os cuidados devem ser tomados para garantir os oócitos permanecem cobertas com óleo e não são autorizados a secar.
4. Imagens ao vivo
- Traga um ovócito em foco usando DIC ou óptica de contraste de fase e examinar o oócito por quaisquer sinais de danos, tais como vazamento de citoplasma, ou abaulamento de células do folículo. Oócitos imagem apenas de aparência saudável e sem danos.
- Streaming pode ser monitorada directamente, sem a necessidade de rotulagem GFP, uma vez que as vesículas de gema no citoplasma são autofluorescente 7. Este sinal pode ser captado na faixa FITC do escopo, mas provavelmente vai exigir ajustes de ganho mais elevado do que os utilizados para proteínas GFP-rotulados.
- As melhores imagens do fluxo são obtidas a partir de secções ópticas que estão logo abaixo da superfície do oócito que está encostada ao vidro de vidro lamela / Petri. Aqui, o oócito é ligeiramente achatada, para fazer um melhor plano de foco. As imagens podem ser capturadas a 200X - 1000 X. Usando a disposição aqui descrita, os objectivos de ar deve ser utilizado, uma vez que a lamela forma uma barreira entre o oócito e objectiva. Isto é óptimo porque minimiza bastante deriva e movimento da amostra.
- Uma vez que uma região de interesse está em foco, desligue a ótica brighfield e mudar para imagem confocal. Usando a função de digitalização / visualização rápida do software, ajustar o foco e ganharna medida do necessário.
- Definições para captura irão variar de microscópio para microscópio, mas parâmetros gerais são as seguintes: Utilizar um comprimento de onda de excitação de ~ 488 nm e um comprimento de onda de emissão de ~ 515 nm. Defina-se a captura do eixo Z de modo que o eixo Z permanece constante, com um atraso de 10 segundos entre os quadros. Capturar uma sequência de teste de quadros 5-10 para assegurar o ovócito é estacionário e o plano de foco é apropriado.
- Uma sequência típica de lapso de tempo irá capturar entre 20 - 50 quadros, e podem ser analisados imediatamente após a conclusão de avaliar a qualidade de vídeo. O processo pode ser repetido para outras células do slide, ou fêmeas adicionais podem ser dissecados conforme necessário.
5. Solução de problemas e comum
- Deriva - Ao utilizar um microscópio vertical, as células podem, por vezes, deriva devido à propagação de óleo. Isto pode ser minimizado utilizando apenas óleo suficiente para cobrir a área sob a lamela. Se o problema persistir, use g menos siliconerease a espaçadores colar no slide.
Nota: Alguns pacotes de software permitem confocal para rastreamento de células, mas em geral, é melhor abandonar imagem de oócitos à deriva e, em vez usar um outro espécime.
- Sem sinais de transmissão de streaming - Se não é evidente, é provável devido a uma de duas causas: ou o plano focal para a captura de imagem não está correto (geralmente muito profundamente no interior do ovócito) ou o oócito está danificado. O tempo ea prática pode minimizar os erros.
Representative Results
Imagiologia de proteínas GFP marcadas com variará dependendo de quão fortemente a proteína marcada é expresso. A fase mid-oócito expressando Reticulon-like 1 (Rtnl-1), marcado com GFP exon 8,9 produz um sinal forte. Rtnl-1 parece co-localizar com os microtúbulos longas presentes durante o fluxo ooplasmic 10 (Figura 1A). Rtnl-1 é um bom marcador para a observação de transmissão, e é também um indicador de organização de microtúbulos em oócitos de fase tardia.
Streaming de Ooplasmic numa câmara de ovo tipo selvagem é evidente que o movimento perceptível de vesículas gema autofluorescente ao usar uma taxa de captura de um quadro a cada 10 segundos (Figura 1B). Uma projecção máxima de cinco quadros podem ser gerados para marcar o caminho de vesículas em movimento.
Figura 1. Vivo imaging de ambos autofluorescent e GFP-estruturas. marcado A) Uma imagem lapso de tempo único de um oócito fase 11 Rtnl1 expressando-GFP em 400X. Rtnl1-GFP fibras mover com um movimento ondulatório em oócitos streaming. B) A projeção máxima de cinco quadros de uma câmara de ovo fase 10B em que as vesículas autofluorescente gema foram fotografadas a cada 10 segundos para 50 total seg, com ampliação de 400X. Barra de escala = 30 mm
Discussion
Oócitos Drosophila são um sistema modelo versátil para abordar uma série de questões relacionadas com o funcionamento e organização das células e componentes subcelulares. Uma compreensão completa da função da proteína requer a monitorização de ambos os aspectos espacial e temporal do comportamento de proteínas. Avanços em ambos os sistemas de imagiologia e as ferramentas genéticas disponíveis para Drosophilists tornar possível, mesmo para pequenos laboratórios para executar as experiências de imagiologia de alta qualidade em oócitos de vida. Aqui I delinear um protocolo para analisar o comportamento das proteínas GFP marcadas com ou autofluorescente e estruturas durante a oogénese mid-late-que pode ser utilizado em conjunto com uma variedade de origens genéticas para sondar a função da proteína.
Neste protocolo I descrever o processo pelo qual os oócitos são preparadas para a imagem latente e as configurações básicas confocal que permitirão aquisição de vídeo de lapso de tempo de proteínas fluorescentes e estruturas. Detai adicionalls de preparação de um oócito são descritos por Weil et al. 6 Uma grande variedade de linhagens de moscas que expressam proteínas que foram marcadas endogenamente via exon-trapping estão disponíveis 8, e suas variantes proteicas infinitamente mais podem ser manipuladas e reintroduzidos moscas.
Ao trabalhar com o tecido vivo, a saúde dos espécimes é de importância primordial. Câmaras de ovos de 10B estágio pode completar oogênese de uma forma essencialmente autônomos 11, tornando-os ideais para estudos de curto prazo de imagem. Cuidados devem ser tomados em vários passos-chave para obter dados de alta qualidade. Durante a dissecção, é importante para manipular ovários e oócitos tão pouco quanto possível, e para minimizar a quantidade de tempo entre a dissecção e a conclusão de imagiologia. Idealmente, uma estação de dissecção pequena deve estar localizado na mesma sala que abriga o escopo confocal, e apenas a poucas câmaras de ovos de uma vez deve ser trabalhada. O número recomendado aqui (5-8) Garante que o tempo de dissecção é minimizada, enquanto maximiza a probabilidade de obtenção de imagens de boa qualidade. Eu recomendo capturar uma pequena série de imagens para avaliar a qualidade de imagem e confirmar que as configurações de captura são otimizados, antes de capturar uma sequência mais lapso de tempo. A maioria dos softwares permite quadros individuais a ser salva, e essas imagens podem então ser analisados numa variedade de maneiras, usando ImageJ 12 ou outro software.
Disclosures
Eu não tenho nada para divulgar.
Acknowledgments
Este trabalho foi financiado por subvenções GM096076 do programa ÁREA NIH.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Halocarbon oil 27 | Sigma-Aldrich | H8773-100ML | |
| #5SF Forceps | Fine Science Tools | 11252-00 | |
| Silicon grease | Sigma Aldrich | Z273554-1EA | |
| Glass-bottom Petri dishes | MatTek | P35G-0-20-C |
References
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