Live avbildning av GFP-märkta proteiner i Published: March 29, 2013 doi: 10.3791/50044

DOI

Automatic Translation

• English (Original)
• العربية (Arabic)
• 中文 (Chinese)
• dansk (Danish)
• Nederlands (Dutch)
• français (French)
• Deutsch (German)
• עברית (Hebrew)
• हिंदी (Hindi)
• italiano (Italian)
• 日本語 (Japanese)
• 한국어 (Korean)
• norsk (Norwegian)
• português (Portugese)
• русский (Russian)
• español (Spanish)
• svenska (Swedish)
• Türkçe (Turkish)

Nancy Jo Pokrywka¹

¹Department of Biology, Vassar College

Summary

Ett protokoll för levande avbildning av GFP-märkta proteiner eller autofluorescerande strukturer i enskilda

Abstract

Drosophila äggcellen har etablerats som ett mångsidigt system för att utreda grundläggande frågor såsom cytoskelett funktion, cell organisation och organell struktur och funktion. Tillgången på olika GFP-märkta proteiner innebär att många cellulära processer kan övervakas i levande celler under loppet av minuter eller timmar, och med hjälp av denna teknik har processer såsom RNP transporter, epitelial morfogenes och vävnadsombildning beskrivits i detalj i Drosophila oocyter ^1,2.

Förmågan att utföra videobildhanteringsutrustning kombinerat med en rik repertoar av mutanter möjliggör en enorm variation av gener och processer som ska undersökas i otrolig detaljrikedom. Ett sådant exempel är processen att ooplasmic streaming, som initierar vid mitten oogenes ^3,4. Denna kraftiga rörelse av cytoplasmiska blåsor är mikrotubuli och kinesin beroende ⁵ och ger en bra systemTEM för att utreda cytoskelett funktion på dessa stadier.

Här presenterar jag ett protokoll för tiden lapse avbildning av levande oocyter med praktiskt taget alla konfokalmikroskopi inställningar.

Protocol

1. Förbereda Flugor för Dissection

1. Söva friska flugor av den önskade genotypen (t.ex. uttrycker en GFP-märkt protein) som är mindre än en vecka gammal. Välj 10-15 stora honor med rundade gräddfärgade bakkroppen.
2. Överför valda flugor och några (3-5) män till en flaska innehållande ny lätt yeasted mat och låta flugorna att göda under två dagar vid 25 ° C. Se Weil et al. ⁶ för information om Drosophila beredning. Gödning flugorna gör att en mängd steg, speciellt stegen 8-12, kommer att finnas tillgänglig för avbildning. Dåligt göds eller unfattened flyger innehåller vanligtvis endast mycket tidiga stadier (1-6) och mogna (steg 14) oocyter.

2. Framställning av Oocyter för avbildning med en Upprätt förening Mikroskop

1. Förbered en standard glasskiva genom att fästa två täckglas till bilden, ca 1 cm från varandra, med hjälp av silikon grease. Använd endast tillräckligt fett för att säkerställa en god tätning mellan täckglas och objektglas. Trycka ordentligt på var och täckglaset sprider fettet tunt och jämnt. Lägg till lite Halocarbon Oil 27 (Sigma) till övergången mellan täckglasen och bildspel. De kommer att fungera som distanser för att förhindra skada isolerade oocyter i efterföljande steg. Nej 1,5 täckglas fungerar bra, med en genomsnittlig tjocklek (0,16 till 0,18 mm) som matchar sent stadium oocyter.
2. Placera 2-3 droppar Halocarbon Oil 27 på ytan av en 22 mm ² täckglas. För att få de mest hälsosamma oocyter möjligt görs en individuell kvinna ur maten injektionsflaskan med Munpipettering och försiktigt deponeras i halogenkolvätet oljan utan att först söva.
3. Använda vassa dissekera pincett (som Dumont # 5), stift flugan mot täckglas och dra av spetsen på buken. Avlägsna äggstockarna genom att dra dem längs ytan av täckglaset, under oljan. Detta kommer att främja adhesion av oocyter till täckglaset.
4. Försiktigt retas isär äggstockarna, leta efter oocyter som åtminstone skede 10B oogenes. Oocyter i detta skede kan identifieras genom att leta efter ägg kammare där oocyten upptar minst 50-60% av den totala volymen av ägget kammaren. Vid denna punkt i oogenes har follikelceller överliggande äggcellen blir kolumner och omger äggcellen på alla sidor utom en liten region där anslutningar till sjuksköterska cellerna kvar. Använd pincett för att avlägsna enskilda oocyter från ovariole manteln.
5. Fortsätt genom att använda 1-3 honor, tills 5-8 oskadade oocyter har isolerats på täckglaset. Ta bort alla unuseable vävnad.
6. Försiktigt invertera täckglaset innehållande oocyter på den förberedda bilden så att oocyterna är placerade mellan de två distansorganen. Tryck inte ner den inverterade täckglas som skadar oocyter. Om det behövs, tillsätt en liten mängd halogenkolväte olja till than kanter "sandwich" för att säkerställa att utrymmet fylls. (Valfritt:. Låt bilden vila under flera minuter för att tillåta sedimentering av täckglas) Bilden är nu klar för avbildning.

3. Beredning av Oocyter för avbildning med en inverterad sammansatt mikroskop

1. Oocyter dissekeras huvudsakligen som beskrivs i avsnitt 2, förutom att små petriskålar med ett glas botten insats (Mattek, 35 mm) används istället för täckglas. Det är onödigt att täcka provet, och efter dissektion kan vävnad avbildas direkt i rätter, men man måste vara uppmärksam för att säkerställa att oocyter förblir täckt med olja och får inte torka ut.

4. Realtidsundersökningen

1. Ta en oocyt i fokus med DIC eller fas optik kontrast och undersöka äggcellen för eventuella skador, till exempel läckage av cytoplasma eller utbuktning av follikelceller. Endast bild oocyter som visas friska och oskadade.
2. Streaming kan övervakas direkt utan behov för GFP märkning, eftersom äggula vesiklar i cytoplasman är autofluorescerande ^7. Denna signal kan fångas i FITC intervallet omfattningen men kommer sannolikt att kräva större förstärkning inställningar än de som används för GFP-märkta proteiner.
3. De bästa bilderna av streaming erhålls från optiska delar som är strax under ytan av oocyten som vilar mot täckglas / Petri glas. Här äggcellen är något tillplattad, vilket leder till en bättre plan fokus. Bilder kan tas vid 200X - 1.000 X. Använda arrangemanget som beskrivs här, bör luft mål skall användas, eftersom täckglas bildar en barriär mellan äggcellen och objektiv. Detta är optimalt eftersom det i hög grad minimerar avdrift och rörelse av provet.
4. När ett område av intresse är i fokus, stäng av brighfield optik och byta till konfokal avbildning. Använda snabb skanning / förhandsvisning funktion av programvaran, justera fokus och fåbehov.
5. Inställningar för infångning varierar från mikroskop till mikroskop, men allmänna parametrar är följande: Använd en excitationsvåglängd av ~ 488 nm och en emissionsvåglängd av ~ 515 nm. Ställ in Z-axeln fånga så att Z-axeln förblir konstant, med en eftersläpning på 10 sekunder mellan bilderna. Fånga en testsekvens av 5-10 ramar för att säkerställa att oocyten är stationär och fokalplanet är lämpligt.
6. En typisk tid förflutit sekvens kommer att fånga mellan 20 - 50 bildrutor, och kan ses omedelbart efter att bedöma videokvalitet. Processen kan upprepas för andra celler i sliden, eller ytterligare honor kan dissekeras behov.

5. Felsökning och vanliga problem

1. Drift - När du använder en upprätt mikroskop, kan celler ibland driva på grund av spridning av olja. Detta kan minimeras genom att använda endast tillräckligt med olja för att täcka området under täckglaset. Om problemen kvarstår, använder mindre silikon grease att anbringa distanser till bilden.

Obs! Vissa konfokala programvaror tillåter cell spårning, men i allmänhet är det bättre att överge avbildning av drivande oocyter och istället använda ett annat provexemplar.

2. Inga tecken på streaming - Om streaming inte är uppenbart, är det förmodligen på en av två orsaker, antingen fokalplanet för Bildinsamling inte är korrekt (vanligtvis för djupt i det inre av äggcellen) eller ägget är skadad. Tid och praktik kan minimera båda fel.

Representative Results

Avbildning av GFP-märkta proteiner kommer att variera beroende på hur starkt det märkta proteinet uttrycks. En utvärdering efter halva steg oocyt uttrycker reticulon-liknande 1 (Rtnl-1), exon taggade med GFP ^8,9 producerar stark signal. Rtnl-1 verkar tillsammans lokalisera de långa mikrotubuli närvarande under ooplasmic streaming ¹⁰ (Figur 1A). Rtnl-1 är en bra markör för att observera strömmande, och är också en indikator på mikrotubuli organisation sent stadium oocyter.

Ooplasmic streaming i en vildtyp ägg kammare är uppenbart så märkbar rörelse autofluorescerande äggula vesiklar vid användning av en fångst hastighet av en ram var 10 sek (Figur 1B). En maximal projektion av fem bildrutor kan genereras för att markera väg rörliga blåsor.

Figur 1. Realtidsundersökningen av både autofluorescent och GFP-märkta strukturer. A) En enda time-lapse bild av en scen 11 oocyt uttrycker Rtnl1-GFP vid 400X. Rtnl1-GFP fibrer rör sig med en vågliknande rörelse i strömmande oocyter. B) En fem ram maximal projektion av ett steg 10B ägg kammare i vilken autofluorescerande äggula vesiklarna avbildades varje 10 sek för 50 sek totalt, vid 400X förstoring. Skala bar = 30 | im

Discussion

Drosophila oocyter är ett mångsidigt modellsystem för adressering olika frågor som rör funktion och organisation av celler och subcellulära komponenter. En fullständig förståelse av proteiners funktion kräver övervakning av både rumsliga och tidsmässiga aspekter av protein beteende. Framsteg inom både bildsystem och genetiska verktyg som finns för Drosophilists gör det möjligt även för små laboratorier för att utföra hög experiment bildkvalitet i levande oocyter. Här har jag beskriva ett protokoll för att analysera beteendet hos GFP-märkta eller autofluorescerande proteiner och strukturer under mitten till slutet-oogenes som kan användas tillsammans med en mängd genetiska bakgrunder för att undersöka proteiners funktion.

I detta protokoll beskriver jag den process genom vilken äggceller är förberedda för avbildning och de grundläggande konfokala inställningar som gör det möjligt förvärv av time lapse video av fluorescerande proteiner och strukturer. Ytterligare DetaiÄr på oocyt framställning beskrivs av Weil et al. Ett brett utbud av flyga stammar som uttrycker proteiner som har endogent taggade via exon-svällning är tillgängliga ^8, och oändligt mycket mer protein varianter kan konstrueras och återinföras till flugor ^6.

I arbetet med levande vävnad, är hälsa proverna av största vikt. Egg kammare från steg 10B kan fylla oogenes i ett väsentligen oberoende sätt ^11, vilket gör dem idealiska för kortsiktiga imaging studier. Man måste vara försiktig vid flera viktiga steg för att få högkvalitativa data. Vid dissektion är det viktigt att manipulera äggstockar och oocyter så lite som möjligt, och för att minimera mängden tid mellan dissektion och slutförandet av avbildning. Helst ska en liten dissektion station placerad i samma rum som rymmer konfokala omfattning och endast ett fåtal ägg kammare i taget bör avbildas. Antalet rekommenderas här (5-8) Ser till att dissektion minimeras samtidigt som man maximerar sannolikheten att erhålla god kvalitet bilder. Jag rekommenderar att fånga en kort serie bilder för att bedöma bildkvalitet och bekräfta att fotograferingsinställningarna optimeras, innan du tar en längre sekvens tid förflutit. De flesta program tillåter enskilda bildrutor som ska sparas och dessa bilder kan sedan analyseras på olika sätt med hjälp av ImageJ ¹² eller annan programvara.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Halocarbon oil 27	Sigma-Aldrich	H8773-100ML
#5SF Forceps	Fine Science Tools	11252-00
Silicon grease	Sigma Aldrich	Z273554-1EA
Glass-bottom Petri dishes	MatTek	P35G-0-20-C