Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Biology

التحليل الكمي الالتهام الذاتي باستخدام المجهر مضان المتقدم 3D

doi: 10.3791/50047 Published: May 3, 2013

Summary

الالتهام الذاتي هو عملية في كل مكان التي تمكن الخلايا تتحلل وإعادة تدوير البروتينات والعضيات. نحن نطبق المجهري مضان متقدمة لتصور وقياس صغيرة، ولكن التغييرات الأساسية، المادية المرتبطة تحريض الالتهام الذاتي، بما في ذلك تشكيل وتوزيع autophagosomes والجسيمات الحالة، والانصهار بهم إلى autolysosomes.

Abstract

سرطان البروستاتا هو الشكل الرائدة في مجال الأورام الخبيثة بين الرجال في الولايات المتحدة، بينما جراحة يحمل مخاطر كبيرة من العجز الجنسي وسلس البول، وقد كان النهج العلاج الكيميائي التقليدي غير ناجحة إلى حد كبير. العلاج الهرموني فعال في مرحلة مبكرة، ولكن غالبا ما يفشل مع التنمية في نهاية المطاف من الأورام هرمون الحرارية. لقد تم مهتمة في تطوير علاجات تستهدف نقص التمثيل الغذائي محددة من الخلايا السرطانية. أظهرنا مؤخرا أن الخلايا السرطانية تفتقر البروستاتا على وجه التحديد انزيم (سينسيز أرجينينوسكسينات، أو ASS) تشارك في تركيب الأحماض الأمينية أرجينين 1. هذا الشرط يسبب الخلايا السرطانية لتصبح تعتمد على أرجينين الخارجية، وأنها تخضع الإجهاد الأيضي عندما يتم استنفاد أرجينين مجانا من أرجينين deiminase (ADI) 1،10. في الواقع، ونحن قد أظهرت أن خلايا سرطان البروستاتا البشرية CWR22 RV1 يتعرضون للقتل على نحو فعال من قبل ADI مع موت الخلايا المبرمج كاسباس مستقلة وautopha العدوانيةغراي (أو macroautophagy) 1،2،3. الالتهام الذاتي هو عملية تطويريا-الحفظ التي تسمح الخلايا على استقلاب البروتينات غير المرغوب فيها من قبل انهيار الليزوزومية خلال المجاعة الغذائية 4،5. على الرغم من أن المكونات الأساسية لهذا المسار جيدا يتميز 6،7،8،9، العديد من جوانب الآلية الجزيئية لا تزال غير واضحة - على وجه الخصوص، ما هو دور الالتهام الذاتي في وفاة والاستجابة من خلايا سرطان البروستاتا بعد العلاج ADI ؟ من أجل معالجة هذه المسألة، ونحن يتطلب المنهج التجريبي لقياس مستوى ومدى استجابة autophagic في الخلايا - وبما أنه لا توجد الواسمات الجزيئية المعروفة التي يمكن أن تتبع بدقة هذه العملية، اخترنا لتطوير نهج قائم على التصوير، وذلك باستخدام الكمية المجهري مضان 3D 11،12.

باستخدام CWR22Rv1 الخلايا على وجه التحديد المسمى مع تحقيقات الفلورسنت لautophagosomes والجسيمات الحالة، وتبين لنا أن مداخن صورة 3D المكتسبة مع أي وايdefield المجهر deconvolution (وفيما بعد، مع فائق الدقة، المجهري منظم في الإضاءة) يمكن التقاط بوضوح المراحل المبكرة من تحريض الالتهام الذاتي. مع المتاحة تجاريا تطبيقات تحليل الصور الرقمية، ويمكننا الحصول بسهولة على معلومات إحصائية عن عدد جسيم بلعمي ذاتي ويحلول والحجم والتوزيع، ودرجة colocalization من أي خلية المصورة. هذه المعلومات يسمح لنا لتتبع بدقة التقدم من الالتهام الذاتي في الخلايا الحية، ويمكن استمرار تحقيقاتنا في دور الالتهام الذاتي في العلاج الكيميائي للسرطان.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

1. الجزء 1: خلية ثقافة وصفها المناعية فلوري

  1. تنمو الخلايا السرطانية CWR22 RV1 البروستاتا الذي يصيب الانسان على الزجاج coverslips على (# 1.5 أو 170 ميكرون سمك) وضعت في 6 لوحات جيدا، مع RPMI (Mediatech، VA) تحتوي على 10٪ مصل بقري جنيني (FBS) و 1٪ البنسلين / الستربتوميسين / الجلوتامين.
  2. لحث الالتهام الذاتي عن طريق التعامل مع عينات مختارة أرجينين deiminase (ADI، 0.3 ميكروغرام / مل) في الفوسفات مخزنة المالحة (PBS).
  3. إصلاح الخلايا مع بارافورمالدهيد 4٪ (PFA، فيشر العلمية، NH) المخفف في برنامج تلفزيوني و 100 ميكرولتر في ساترة، لمدة 10 دقيقة في RT.
  4. غسل الخلايا 3x مع 1 مل HBS / BSA.
  5. Permeabilize الخلايا مع سابونين 0.05٪ (سيغما، MO) في HEPES (HBS) / BSA، و 100 ميكرولتر في ساترة، لمدة 15 دقيقة في RT.
  6. قبل المناعية وضع العلامات، وعينات كتلة مع 2.5٪ الكازين (سيغما، MO) في HBS / BSA، و 100 ميكرولتر في ساترة، لمدة 1 ساعة على RT.
  7. احتضان خلايا ثابتة مع الأجسام المضادة الأولية مخففة في 2.5٪ الكازين / HBS / BSA، و 100 ميكرولتر لكل coverslIP، O / N عند 4 درجة مئوية.
  8. غسل الخلايا 3x مع 1 مل HBS / BSA.
  9. احتضان خلايا ثابتة مع الأجسام المضادة الثانوية المخفف في 2.5٪ الكازين / HBS / BSA، و 100 ميكرولتر في ساترة، لمدة 1 ساعة على RT.
  10. غسل الخلايا 3x مع 1 مل HBS / BSA.
  11. جبل coverslips على استعداد على الشرائح العادية المجهر والزجاج مع الذهب SlowFade أو إطالة الذهب كاشف antifade (إينفيتروجن، CA) التي تحتوي على 4 '،6-diamidino-2-phenylindole (دابي).
  12. حواف ختم ساترة مع طلاء الأظافر. للحصول على أفضل نتائج التصوير، إتاحة الوقت (مثالي O / N) لوسائل الإعلام لمكافحة تتلاشى تماما تتخلل الخلايا.
  13. تنظيف سطح ساترة مع الميثانول و / أو الكلوروفورم.
  14. إضافة زيت الغمر (معامل الانكسار 1.520 عند التصوير عند 37 درجة مئوية، أو 1.516 عند التصوير في RT) إلى 60X 1.42 NA عدسة الهدف (أوليمبوس، اليابان).
  15. الشريحة موقف على المسرح المجهر ووضع التركيز مع خلايا الفائدة.

2. الجزء 2: خلايا التحضير لتصوير لايف

  1. تنمو CWR22 RV1 الخلايا معربا عن الفلورية الخضراء البروتين يقترن ضوء سلسلة 3 (LC3-GFP) في وسائل الإعلام ثقافة RPMI تحتوي على FBS 10٪ و 1٪ على المضادات الحيوية 35 ملم بولي-D-يسين المغلفة أطباق ثقافة زجاج القاع (ماتيك، MA). ينبغي مطلي الخلايا في كثافة كافية لتسهيل الانتشار السريع، ولكن ليس كثيرا أن الخلايا هي متضخمة وتجمعت بحلول موعد التصوير.
  2. علاج عينات الخلية المحددة مع ADI (0.3 ميكروغرام / مل) في برنامج تلفزيوني.
  3. حوالي 1 ساعة قبل التصوير، وتمييع 1.5 ميكرولتر من LysoTracker الأحمر DND-99 (إينفيتروجن، كاليفورنيا) مع 20 مل RPMI. تحتوي على 10٪ FBS و 1٪ المضادات الحيوية. استخدام المحاليل المحتوية على ADI للعينات المختارة. الحارة جميع وسائل الإعلام إلى 37 درجة مئوية قبل إضافة إلى الطبق الثقافة.
  4. احتضان الخلايا مع RPMI تحتوي على LysoTracker الأحمر DND-99 ل15-45 دقيقة عند 37 درجة مئوية.
  5. ما يقرب من 30 دقيقة قبل التصوير، بدوره على العلبة البيئية WeatherStation والسماح لتتوازن إلى 37 درجة مئوية و 5٪ CO 2 (مع humidifالهواء IED).
  6. غسل الخلايا مع برنامج تلفزيوني واستبدال وسائل الإعلام مع معيار RPMI FBS تحتوي على 10٪ فقط، و 1٪ المضادات الحيوية. أضف إلى ADI عينات كما هو محدد.
  7. جبل 35 مم ساترة القاع أطباق الثقافة في محول حسب اختيارك (الدقة، وشركة، WA)، وموقف على المسرح المجهر. استخدام زيت الغمر (معامل الانكسار 1.520) على 60X 1.42 NA عدسة الهدف، ووضع الطبق الثقافة التي شنت على خشبة المسرح.

3. الجزء 3: الميكروسكوب Deconvolution وتحليل

بروتوكول في هذا القسم يفترض استخدام DeltaVision الشخصية DV المجهر deconvolution وما يرتبط بها من SoftWorX تطبيق جناح (الدقة، وشركة، WA).

  1. بدوره على نظام المجهر، بما في ذلك محطة اقتناء وحدة تحكم الصك. فتح تطبيق Resolve3D لتهيئة المسرح المجهر وبدوره على مصدر ضوء زينون. سماح 10 دقيقة لمصدر الضوء في عملية الاحماء والوصول إلى ظروف مستقرة.
  2. إضافةقطرة من زيت الغمر (معامل الانكسار 1.520 للعينات الحية عند 37 درجة مئوية أو 1.516 لعينات ثابتة في RT) على 60X 1.42 NA عدسة الهدف، وعينة الشريحة المركز (زلة تغطية الوجه لأسفل) على عدسة الهدف.
  3. إما باستخدام الإضاءة مشرق الميدان أو الخارجية والتركيز الخشنة ضبط مقبض الباب، رفع ببطء عدسة الهدف حتى حبة من النفط الغمر يجعل الاتصال مع غطاء زجاجي مقلوب. (من هذه النقطة، يجب أن تأتي طبقة الخلايا إلى التركيز في غضون بضعة يتحول من التركيز غرامة ضبط مقبض الباب). عند العمل مع عينات ثابتة على الشرائح، فمن المستحسن تجنب الخلايا داخل أي مجال من المجالات مع فقاعات أو بالقرب منها. عند عرض مع عينات حية على طبق زجاج القاع، وتجنب تحريك عدسة الهدف خارج حدود ساترة الزجاج.
  4. ويمكن تحديد Autophagosomes بواسطة EGFP إشارة (الخضراء). ويتم تحديد الجسيمات الحالة من قبل LysoTracker الأحمر (عينة حية) أو الأجسام المضادة الفلورسنت مكافحة Lamp1 (عينة ثابتة). ويتم تحديد نوى الخلايا بواسطة دابي شارعaining (عينة ثابتة).
  5. حدد الحقل المطلوب من الرأي. من الناحية المثالية، ينبغي أن الخلايا تظهر إشارة الفلورسنت جيدة في جميع القنوات المناسبة، وتعلق، وانتشرت على سطح ساترة بحيث محتويات الخلايا من السهل تصور بما فيه الكفاية. تعديلات صغيرة في العاشر الوحشي، Y، Z والتركيز يمكن التحكم عن طريق الكمبيوتر باستخدام واجهة Acquire3D. تعيين binning إلى 1X1 أو 2X2، اعتمادا على الحقل المطلوب من عرض (ويمكن رؤية أكثر من الخلايا في الحقل عند تعيين binning إلى 2X2).
  6. للحصول على صورة معينة من خلال القسم الوسطي للخلية، تعيين المعلمات التعرض (مثل٪ انتقال السلطة وزمن التعرض) مثل أن الحد الأقصى لكثافة بكسل لا يتجاوز 3،000 التهم الموجهة إليه. عموما، يجب تعيين انتقال٪ عند أدنى مستوى ممكن، من دون التطرق الى زمن التعرض المقابلة أكثر من 1 ثانية. كرر هذا الإجراء كل لون مضان ليمكن تصوير ولكل حقل منفصل من أجل الحصول على صور عالية الجودة.
  7. تعيين Uحدود pper والسفلي من Z-مكدس عن طريق ضبط التركيز فقط قليلا عبر الجزء العلوي والسفلي من عينة الخلية، على التوالي. العدد الكلي من الصور في إعطاء Z-مكدس وهكذا يحدده هذه الحدود والتباعد بين الطبقات (القيمة الافتراضية: 0.2 ميكرون).
  8. لتقليل الحركة الفنية خلال الحصول على الصور، ونحن نوصي تحديد طريقة الحصول على الصور ل"الطول الموجي ثم ض المكدس" للعينات ثابتة، و "ض المكدس ثم الطول الموجي" للحصول على عينات حية.
  9. وdeconvolved الصور مضان باستخدام SoftWorX (الدقة التطبيقية، WA) وتحليلها لاحقا باستخدام VoloCITY (الارتجال، والآن بيركن إلمر، MA).

4. جزء 4: سوبر القرار، منظم في الإضاءة (OMX) الميكروسكوب

بروتوكول في هذا القسم ينطبق على استخدام OMX مجهر الإضاءة الهيكلية (الدقة التطبيقية، WA).

  1. تبديل على السلطة الرئيسية والليزر المطلوبة (410 نانومتر، 488 نانومتر، و / أو 532 نانومتر). الانتظار لمدة 20 ميلn للحصول على أشعة الليزر لأن يستقر حراريا.
  2. إضافة زيت الغمر (معامل الانكسار 1.516 للعينات ثابتة في RT) على 60X 1.42 NA عدسة الهدف. إذا كان ينظر إلى فقاعات في قطيرة الزيت، وتنظيف موضوعية وإضافة زيت مرة أخرى.
  3. ضع الشريحة عينة على المسرح وإذا لزم الأمر، والسماح 10 دقيقة للخلايا ليستقر على ساترة.
  4. تهيئة برنامج الاستحواذ. استخدام الإضاءة مضان لضبط التركيز حتى يمكن رؤية الخطوط العريضة الحادة للخلية. (وينبغي توخي الحذر في جميع الأوقات للحد من التعرض للخلايا لإثارة مضان، حتى الحصول على الصور الفعلية).
  5. يمكن الحصول على تفحص فسيفساء دوامة لمعاينة مناطق أوسع من العينة لتحديد الخلايا أو المناطق ذات الاهتمام. فمن المستحسن استخدام مرات التعرض قصير (1-10 مللي ثانية)، وانخفاض القوة الإثارة (0.1-1٪ انتقال)، في حين مسح العينة أو العثور الأهداف.
  6. تحديد autophagosomes بواسطة GFP-LC3 مضان. تحديد الجسيمات الحالة من قبل اليكسا فلور 555 المضادة للLAMP(بروتين غشاء يحلول المصاحب) ونوى الخلايا باستخدام دابي (عينات ثابتة).
  7. اختيار الظروف التجريبية بما في ذلك الطول الموجي الإثارة، مساحة الصورة (على سبيل المثال 512X512)، سمك مكدس، وقت التعرض، ونسبة انتقال الليزر. عن Super الصور حل، وضمان أن يتم تمكين الخيار إضاءة منظم. للفحص المجهري deconvolution على OMX، حدد خيار الإضاءة التقليدية.
  8. للحصول على أفضل النتائج التعمير، حدد الظروف التجريبية مثل أن الحد الأقصى لكثافة عدد ما بين 10،000 و 15،000 خلال عملية الاستحواذ. إذا photobleaching هو مصدر قلق، والتصوير في انخفاض التعرض (التهم بين 5،000 و 10،000) يمكن استخدامها. من الناحية المثالية، ينبغي أن التهم ولا تنقص أكثر من عامل من اثنين خلال اقتناء كامل، وينبغي تجنب انخفاض بأكثر من أربعة أضعاف. إذا لزم الأمر، والحد من سماكة كومة لضمان العد شدة المستدام. الكاميرا التشبع في 64،000 التهم، والحد الأقصى وذلك فيتوتر لا ينبغي أبدا تتجاوز هذا. للحصول على عينات جيدة، وجدنا الظروف التجريبية لتكون 10 ~ 50 ميللي ثانية زمن التعرض مع انتقال الليزر 1٪. ويفضل عينات مشرق وصامد التي يمكن تصويرها مرارا وتكرارا. مطلوب مستقرة وصمة عار لمرور الزمن، سوبر الصور حلها.
  9. للحد من الضوضاء، سرعة قراءات 95MHz (الخيار سرعة متوسطة) واكتساب الوقت من 2 ميللي ثانية أو أكثر يوصى. ويتم الحصول على زيادة الأعمال الفنية المصورة في إعادة بنائها، وعندما يتحرك عينة خلال عملية الاستحواذ. ونتيجة لهذا التأثير، ينصح التعرض القصير لخلايا غير ملتصقة أو سريعة الحركة.
  10. لا يمكن أن يؤديها التصوير متعددة في وقت واحد أو بالتتابع. وهكذا أوصى غلة وضع متتابعة أقل عبر الحديث و.
  11. للحد من photobleaching، فمن المستحسن عموما إلى صورة مع موجات أطول الإثارة الأول (532 نانومتر، 488 نانومتر، ومن ثم 410 نانومتر). ومع ذلك، من أجل النتائج التجريبية هو مبين في الشكل (3)، وكان هذا ترتيب عكسيد (أي 48 نانومتر، 532 نانومتر و 410 نانومتر) وذلك بسبب صمود هذه عينة معينة.
  12. تعيين الحد العلوي / السفلي من Z-مكدس عن طريق تحريك خشبة المسرح المجهر حتى أعلى / أسفل الخلايا قليلا من التركيز. ينبغي أن تعقد المسافة المطلوبة بين كل صورة ثابتة عند 0.125 ميكرون لسوبر القرار التصوير، كبرنامج إعادة الإعمار ستستغرق هذه القيمة كما الافتراضي.
  13. إعادة بناء مداخن صورة باستخدام SoftWorX (الدقة التطبيقية، WA) وتحليل باستخدام VoloCITY 6.0 (بيركن إلمر، MA).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

تسلسل الصور هو مبين في الشكل 1 يبين التغيرات الجسدية التي تحدث في CWR22 الخلايا خلال 80 دقيقة الأولى من تحريض الالتهام الذاتي. في هذه الدراسات وغيرها (لا يظهر) لاحظنا باستمرار: (1) النزوح من النواة بعيدا عن مركز الخلية، (2) الحد من التصاق نقطة الوصل، و (3) إزفاء العام للautophagosomes والجسيمات الحالة نحو مركز لل الخلية. وبالإضافة إلى ذلك، لاحظنا أيضا زيادة طفيفة في colocalization (المشار إليها باللون الأصفر) بين autophagosomes (الخضراء) والجسيمات الحالة (الحمراء)، في نقاط وقت لاحق.

كدليل على الخلوي المستندة إلى الصورة، استخدمنا VoloCITY التصوير الرقمي تطبيق جناح (الإصدار 6.0، الارتجال / بيركن، إلمر) لتحديد والعد، وجمع بيانات إحصائية عن autophagosomes وصفت والجسيمات الحالة في الصور من الخلايا CWR22 هو مبين في الشكل 1. كما يتضح من الرسم البياني في الشكل 2، وعدد وحجم رانه جسيم بلعمي ذاتي (بعد تشكيل الأولي والمظهر) لا تختلف مع مرور الوقت: بعد 80 دقيقة من تحريض الالتهام الذاتي، كان هناك انخفاض تدريجي ولكن صافية في عدد من autophagosomes (الشكل 2A) مع زيادة مقابلة في متوسط ​​حجم autophagosomes ( الشكل 2B). وبالإضافة إلى ذلك، كانت هناك زيادة قابلة للقياس في colocalization من autophagosomes والجسيمات الحالة، على أساس تحليل معامل ارتباط بيرسون (الشكل 2C). معا، واقترح أن هذه النتائج، والعديد من autophagosomes صغيرة تلتحم على التحفيز من الالتهام الذاتي لتشكيل autophagosomes أكبر مع مرور الوقت (الشكل 2D). بينما الشكلان 1 و 2 عكست نتائج دراسة التصوير فقط واحد، وسوف تكون هناك حاجة إلى مزيد من التحليل الكمي الدقيق لاستخلاص النتائج شركة، فإنه لم توضح ملامح ومزايا المجهري مضان الكمي. ونحن بنشاط باستخدام هذه التقنية في أووR استمرار التحقيق في آلية الجزيئية والخلوية عملية الالتهام الذاتي.

الشكل 3A يظهر مقارنة جنبا إلى جنب من الصور المكتسبة وإعادة بنائها في DV وضع (محاكاة widefield deconvolution، يسار) في مقابل وضع منظم في الإضاءة باستخدام المجهر OMX (يمين). وتحسنت القرار الوحشي ليصل إلى 120 نانومتر، أي ضعف القرار من التقليدية المجهري الحيود محدودة 14،15. كانت colocalization الصغيرة من autophagosomes والجسيمات الحالة (الشكل 3B، يتبين من السهام) واضح واضح مع المجهري فائقة الدقة، في حين أنهم كانوا بالكاد واضح مع التصوير مضان التقليدية.

واحدة من مزايا استخدام الميكروسكوب Deconvolution هو إعادة جميع الصور في نموذج 3D من شأنها أن تكشف عن معلومات مكانية أكثر دقة بين جزيئات مختلفة. فيلم 1 يظهر الصورة الشاملة للCWR22 RV1 خلية undergoiنانوغرام الالتهام الذاتي في نقطة وقت لاحق، حيث كمية كبيرة من colocalization بين جسيم بلعمي ذاتي ويحلول تبدأ تحدث. تلطيخ E-كادهيرين (كما هو مبين في اللون الأبيض) يكشف عن مخطط للخلية الهدف. في فيلم 2، نموذج أعيد بناؤه 3D يوفر المزيد من التفاصيل المكانية للانصهار بين autophagosomes والجسيمات الحالة (كما هو مبين في اللون الأصفر). يمكننا أن نرى بوضوح التفاعل بين الأخضر LC3 إشارات وإشارات يحلول الأحمر، ودمج اثنين من الإشارات لإنتاج إشارات صفراء.

الشكل 1
الشكل 1. الوقت الفاصل بين الصور من CWR22 RV1 الخلايا تعامل مع ADI. تسلسل صورة تظهر CWR22 RV1 الخلايا تعامل مع ADI لمدة 80 دقيقة. (الصور 2D تم الحصول عليها من مداخن الصورة الأصلية عن طريق الإسقاط أقصى Z). وWHالفنار خط منقط يمثل الخطوط العريضة للخلية، وتمثل المنطقة المظللة ضوء موقف النواة.

الشكل 2
الشكل 2. التحليل الإحصائي. الاتجاهات الإحصائية استخرجت من خلال تحليل تسلسل الصور هو مبين في الشكل (1)، مظاهرة أن البيانات صورة غير قابلة للقياس الكمي. انقر هنا لعرض أكبر شخصية .

الشكل (3)
الشكل (3). توزيع جسيم بلعمي ذاتي ويحلول في الخلية. A. أعلى) جنبا إلى جنب مقارنة بين الصور التي اكتسبوها وأعيد بناؤها في DV وضع (محاكاة widefield deconvolution، يسار) ووضع منظم في الإضاءة باستخدام المجهر OMX (يمين). يمثل شريط نطاق 5 ميكرون. B. القاع) colocalization على نطاق صغير من autophagosomes والجسيمات الحالة (المشار إليها السهام).

الفيلم 1 و 2 فيلم. 3D إعادة إعمار CWR22 RV1 الخليوي الالتهام الذاتي تمر بها. هذا الفيلم يوضح تحريض الالتهام الذاتي طبيعي بعد العلاج ADI. تم بناؤها الصور ض المكدس الى نموذج 3 الأبعاد. تم إنشاء هذا الفيلم عن طريق تناوب الخلية 360 درجة أفقيا و 360 درجة عموديا. إشارة خضراء تمثل LC3، إشارة حمراء تمثل يحلول، إشارة الأبيض يمثل E-كادهيرين، وإشارة اللون الأزرق يمثل النواة. انقر هنا لعرض الفيلم 1 أو= "_blank"> اضغط هنا لمشاهدة الفيلم 2.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

في حين أن الملاحظة المباشرة من الخلايا المسمى مع تحقيقات الفلورسنت ضد LC3 مقبولة على نطاق واسع كوسيلة القياسية لتأكيد استجابة autophagic والتصوير 3D الكمي من النظام نفسه (كما فعلنا) يقدم معلومات غير مسبوقة والتفاصيل حول عملية معقدة من الالتهام الذاتي الخلوي . على وجه الخصوص، ونحن نلاحظ أن مئات (إن لم يكن الآلاف) من autophagosomes في الخلايا الحية تتشكل في غضون 80 دقيقة من تحريض الالتهام الذاتي. وبالمثل، نلاحظ تغيرات شكلية مثيرة جدا للاهتمام في توزيع المقصورات الليزوزومية خلال تحريض الالتهام الذاتي. داخل خلية معينة، انخفاض في عدد جسيم بلعمي ذاتي والزيادة المقابلة في متوسط ​​حجمها مع مرور الوقت، تشير إلى أن autophagosomes تنمو أكبر من قبل التفجير مع بعضها البعض، قبل الجمع مع الجسيمات الحالة لautolysosomes النموذج. عالية الدقة 3D التصوير مضان من الخلايا الحية تمكننا من تحقيق في ما إذا autophagosomes يجب أن تصل قبل احتساب الحجم الحرجه الصمامات مع الجسيمات الحالة، أو ما إذا كان الالتهام الذاتي قد مضي قدما ببساطة في الحجم الفعلي أصغر. في الواقع، نظرا لعدد autophagosomes الصغيرة جدا التي تظهر على تنشيط مبكر فقط في قرار الحد من المجهر deconvolution، وحلها بصورة أكثر وضوحا على منظم OMX-إضاءة المجهر 13، فإنه قد يكون صحيحا أن الجزء الأكبر من النشاط autophagic الواقع يحدث على هذا المستوى.

القدرة على رصد الخلايا الحية أثناء الالتهام الذاتي مهم للغاية، حيث أن التغيرات في عدد وحجم autophagosomes في خلية معينة يمكن أن تكون صغيرة، نسبة إلى أشكال مختلفة من هذه المعلمات من خلية إلى أخرى. من خلال دراسة واحدة، خلية حية على مر الزمن - يمكن أن نكون أكثر يقينا بأن التغيرات المورفولوجية التي نلاحظها هي نتيجة لظروف تجريبية، بدلا من التباين الإحصائي.

وأخيرا، مع الواسمات الجزيئية محددة، يمكننا تطبيق هذه التقنيات لدراسة التصويرالتعجيل بتشكيل autophagosomes، لتتبع المنشأ للأغشية autophagosomal، وتحديد العضيات ممكن و / أو مكونات داخل الخلايا التي تم اجتاحت تحديدا في autophagosomes خلال تحريض الالتهام الذاتي. نأمل أيضا أن هذا النهج سوف تمكننا من تحقيق دور الالتهام الذاتي في الخلايا بقاء وموت الخلايا، وتوصيف أفضل من آثار المخدرات ومثبطات على الالتهام الذاتي المحتملة.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

الإعلان عن أي تضارب في المصالح.

Acknowledgments

الدعم المنحة: المعاهد الوطنية للصحة CA165263، المعاهد الوطنية للصحة CA150197، المعاهد الوطنية للصحة CA150197S1 (HJ الكونغ)، NIH CA150197S1 (CA Changou)، NSF PHY-0120999 مركز بيوفوتونيك علوم والتكنولوجيا (DL ولفسون، FYS تشوانغ)، وزارة الدفاع PC073420 (RJ بولد)، والبحوث مجلس النرويج، ييف ايريكسون السفر جرانت 209286/F11 (BS أهلواليا). كما يقر HJ الكونغ بدعم من صندوق أوبورن السرطان جماعة الوقف. كما يقر RJ بولد بدعم من جون ماكدونالد الوقف.

نشكر الدكتور جيني وي جين الكونغ والدكتور بوروسيا ون وو في DesigneRx لتوريد سخية من ADI.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Arginine Deiminase (ADI) DesigneRx
HEPES Sigma H4034
Casein Sigma C5890
Paraformaldehyde Fisher 4042
Saponin Sigma S4521
Alexa anti-mouse 555 Invitrogen A21422
Alexa anti-rabbit 647 Invitrogen A21244
LysoTracker Red DND-99 Invitrogen L7528
anti-Lamp1 DSHB H4A3
anti-Cadherin Cell Signaling #3195
SlowFade Gold Invitrogen S36936
35 mm poly-d-lysine coated glass bottom plate MatTek P35GC-1.5-1.4-C
No.1, 22 mm coverslip Corning #2865-22
Microscope slides Globe Scientific 1324G

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Kim, R. H., Coates, J. M., Bowles, T. L., McNerney, G. P., Sutcliffe, J., Jung, J. U., Gandour-Edwards, R., Chuang, F. Y., Bold, R. J., Kung, H. J. Arginine deiminase as a novel therapy for prostate cancer induces autophagy and caspase-independent apoptosis. Cancer Res. 69, (2), 700-708 (2009).
  2. Miyazaki, K., Takaku, H., Umeda, M., et al. Potent growth inhibition of human tumor cells in culture by arginine deiminase purified from a culture medium of a Mycoplasma-infected cell line. Cancer Res. 50, 4522-4527 (1990).
  3. Takaku, H., Matsumoto, M., Misawa, S., Miyazaki, K. Anti-tumor activity of arginine deiminase from Mycoplasma argini and its growth-inhibitory mechanism. Jpn. J. Cancer Res. 86, 840-846 (1995).
  4. Levine, B., Klionsky, D. J. Development by self-digestion: molecular mechanisms and biological functions of autophagy. Dev. Cell. 6, 463-477 (2004).
  5. Mizushima, N., Levine, B., Cuervo, A. M., Klionsky, D. J. Autophagy fights disease through cellular self-digestion. Nature. 451, 1069-1075 (2008).
  6. Kabeya, Y., Mizushima, N., Ueno, T. LC3, a mammalian homologue of yeast Apg8p, is localized in autophagosome membranes after processing. EMBO J. 19, 5720-5728 (2000).
  7. Pattingre, S., Espert, L., Biard-Piechaczyk, M., Codogno, P. Regulation of macroautophagy by mTOR and Beclin 1 complexes. Biochimie. 90, 313-323 (2008).
  8. Maiuri, M. C., Criollo, A., Tasdemir, E., et al. BH3-only proteins and BH3mimetics induce autophagy by competitively disrupting the interaction between Beclin 1 and Bcl-2/Bcl-X(L). Autophagy. 3, 374-376 (2007).
  9. Crighton, D., Wilkinson, S., O'Prey, J., et al. DRAM, a p53-induced modulator of autophagy, is critical for apoptosis. Cell. 126, 121-134 (2008).
  10. Dillon, B. J., Prieto, V. G., Curley, S. A., et al. Incidence and distribution of argininosuccinate synthetase deficiency in human cancers: a method for identifying cancers sensitive to arginine deprivation. Cancer. 100, 826-833 (2004).
  11. Dale, B. M., McNerney, G. P., Thompson, D. L., et al. Cell-to-cell transfer of HIV-1 via virological synapses leads to endosomal virion maturation that activates viral membrane fusion. Cell Host & Microbe. 10, (6), 551-562 (2011).
  12. Cogger, V. C., McNerney, G. P., Nyunt, T., et al. Three-dimensional structured illumination microscopy of liver sinusoidal endothelial cell fenestrations. J. Struct. Biol. 171, (3), 382-388 (2010).
  13. York, A. G., Parekh, S. H., Nogare, D. D., et al. Resolution doubling in live, multicellular organisms via multifocal structured illumination microscopy. Nat. Methods. 9, (7), 749-754 (2012).
  14. Gustafsson, M. G. L. Surpassing the lateral resolution limit by factor of two using structured illumination microscopy. Journal of Microscopy. 198, 82-87 (2000).
  15. Shao, L., Kner, P., Rego, E. H., Gustaffson, M. G. Super-resolution 3D microscopy of live whole cells using structured illumination. Nat. Method. 8, (12), 1044-1046 (2011).
التحليل الكمي الالتهام الذاتي باستخدام المجهر مضان المتقدم 3D
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Changou, C. A., Wolfson, D. L., Ahluwalia, B. S., Bold, R. J., Kung, H. J., Chuang, F. Y. S. Quantitative Analysis of Autophagy using Advanced 3D Fluorescence Microscopy. J. Vis. Exp. (75), e50047, doi:10.3791/50047 (2013).More

Changou, C. A., Wolfson, D. L., Ahluwalia, B. S., Bold, R. J., Kung, H. J., Chuang, F. Y. S. Quantitative Analysis of Autophagy using Advanced 3D Fluorescence Microscopy. J. Vis. Exp. (75), e50047, doi:10.3791/50047 (2013).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter