Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Biology

Kvantitativ analyse af Autophagy hjælp Advanced 3D fluorescensmikroskopi

doi: 10.3791/50047 Published: May 3, 2013

Summary

Autophagy er en allestedsnærværende proces, der gør det muligt for cellerne at nedbryde og genbruge proteiner og organeller. Vi anvender avanceret fluorescens mikroskopi til at visualisere og kvantificere små, men vigtige, fysiske ændringer i forbindelse med induktion af autophagy, herunder dannelse og distribution af autophagosomes og lysosomer, samt deres fusion i autolysosomes.

Abstract

Prostatakræft er den førende form af maligne sygdomme blandt mænd i USA Mens kirurgi indebærer en væsentlig risiko for impotens og inkontinens, har traditionelle kemoterapeutiske tilgange stort set været forgæves. Hormonbehandling er effektiv på et tidligt tidspunkt, men ofte mislykkes med den endelige udvikling af hormon-ildfaste tumorer. Vi har været interesseret i at udvikle lægemidler rettet mod specifikke metaboliske mangel af tumorceller. Vi har for nylig vist, at prostata tumorceller specifikt mangler et enzym (argininosuccinate syntase, eller ASS) involveret i syntesen af aminosyren arginin 1.. Denne betingelse forårsager tumorcellerne at blive afhængig af eksogene arginin, og de ​​gennemgår metabolisk stress, når fri arginin er forårsaget af arginindeiminase (ADI) 1,10. Vi har faktisk vist, at humane prostata cancer celler CWR22 RV1 effektivt dræbt af ADI med caspase-uafhængig apoptose og aggressive autophagy (eller macroautophagy) 1,2,3. Autophagy er en evolutionært-bevarede proces, der tillader celler at metabolisere uønskede proteiner ved lysosomal nedbrydning under ernæringsmæssige sult 4,5. Selvom de væsentlige elementer i denne vej er godt præget 6,7,8,9, mange aspekter af den molekylære mekanisme er stadig uklart - i særdeleshed, er hvilken rolle autophagy i død-respons af prostatakræft celler efter ADI behandling ? For at løse dette spørgsmål, vi krævede en eksperimentel metode til at måle niveauet og omfanget af autophagic respons i celler - og da der er ingen kendte molekylære markører, der kan præcist spore denne proces, valgte vi at udvikle en imaging tilgang, ved hjælp af kvantitativ 3D fluorescensmikroskopi 11,12.

Brug CWR22Rv1 celler specifikt-mærket med fluorescerende prober til autophagosomes og lysosomer, viser vi, at 3D billedstakke erhverves med enten widefield deconvolution mikroskopi (og senere, med super-opløsning, struktureret-belysning mikroskopi) kan tydeligt fange de tidlige stadier af autophagy induktion. Med kommercielt tilgængelige digitale billedanalyse applikationer, kan vi let få statistiske oplysninger om autophagosome og lysosom antal, størrelse, distribution, og graden af ​​colokalisering fra enhver afbildet celle. Denne information giver os mulighed for præcist at spore fremskridt af autophagy i levende celler og giver vores fortsatte undersøgelse af rolle autophagy i cancer kemoterapi.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

1.. Del 1: Cellekultur og immuno-fluorescerende mærkning

  1. Grow CWR22 RV1 humane prostata tumorceller på dækglas (# 1.5 eller 170 um tykkelse) anbragt i 6-brønds plader, med RPMI (Mediatech, VA) indeholdende 10% kalvefosterserum (FBS) og 1% penicillin / streptomycin / glutamin.
  2. Fremkalde autophagy ved behandling udvalgte prøver med arginindeiminase (ADI, 0,3 ug / ml) i phosphatpufret saltvand (PBS).
  3. Lave celler med 4% paraformaldehyd (PFA, Fisher Scientific, NH) fortyndet i PBS, 100 pi pr dækglas i 10 minutter ved stuetemperatur.
  4. Vask cellerne 3x med 1 ml HBS / BSA.
  5. Permeabilisere celler med 0,05% saponin (Sigma, MO) i HEPES (HB) / BSA, 100 pi pr dækglas i 15 minutter ved stuetemperatur.
  6. Forud for immuno-mærkning blok prøver med 2,5% kasein (Sigma, MO) i HBS / BSA, 100 pi pr dækglas, i 1 time ved stuetemperatur.
  7. Inkuber fikserede celler med primære antistoffer fortyndet i 2,5% casein / HBS / BSA, 100 pi pr coverslip, O / N ved 4 ° C.
  8. Vask cellerne 3x med 1 ml HBS / BSA.
  9. Inkuber fikserede celler med sekundære antistoffer fortyndet i 2,5% casein / HBS / BSA, 100 pi pr dækglas, i 1 time ved stuetemperatur.
  10. Vask cellerne 3x med 1 ml HBS / BSA.
  11. Monter forberedte dækglas på almindelige objektglas med SlowFade Gold eller forlænge Guld antiblegemiddel reagens (Invitrogen, CA) indeholdende 4 ',6-diamidino-2-phenylindol (DAPI).
  12. Seal dækglas kanter med neglelak. For de bedste imaging resultater, give tid (ideelt O / N) for anti-fade medier til grundigt gennemtrænge celler.
  13. Ren dækglas overflade med methanol og / eller chloroform.
  14. Tilføj nedsænkning olie (brydningsindeks 1.520 da imaging ved 37 ° C eller 1,516 da billeddannelse ved RT) til 60X 1,42 NA objektiv (Olympus, Japan).
  15. Position slide på mikroskopet scenen og etablere fokus med cellerne af interesse.

2.. Del 2: Forberedelse Celler til Live-Imaging

  1. Grow CWR22 RV1 celler, der udtrykker grønt fluorescerende protein-koblede lyskæde 3 (LC3-GFP) i RPMI dyrkningsmedier indeholdende 10% FBS og 1% antibiotika på 35 mm poly-D-lysin-overtrukne glasbund dyrkningsskåle (Mattek, MA). Cellerne skal være belagt med tilstrækkelig tæthed at fremme en hurtig spredning, men ikke så meget, at cellerne er overgroet og klumpet på tidspunktet for billeddannelse.
  2. Behandling af udvalgte celleprøver med ADI (0,3 mikrogram / ml) i PBS.
  3. Ca. 1 time før billedbehandling, fortynde 1,5 pi LysoTracker Red DND-99 (Invitrogen, CA) med 20 ml RPMI. indeholdende 10% FBS og 1% antibiotika. Brug opløsninger indeholdende ADI for udvalgte prøver. Varm alle medier til 37 ° C før tilsætning til dyrkningsskålen.
  4. Cellerne inkuberes med RPMI indeholdende LysoTracker Red DND-99 for 15-45 min ved 37 ° C.
  5. Ca. 30 minutter før billeddannelse, tænde vejrstation miljømæssige kabinettet og lad afbalancere til 37 ° C og 5% CO 2 (med humidifIED luft).
  6. Vask cellerne med PBS og erstatte medier med standard RPMI indeholdende kun 10% FBS og 1% antibiotika. Tilføj ADI til prøver som angivet.
  7. Mount 35 mm dækglas-bottom kultur retter i tilpassede adapter (Applied Precision, Inc., WA), og position på mikroskopet scenen. Brug immersionsolie (brydningsindeks 1.520) på 60X 1,42 NA objektiv, og placer den monterede dyrkningsskålen på scenen.

3.. Del 3: Dekonvolution Microscopy og analyse

Protokollen i dette afsnit forudsætter brugen af ​​DeltaVision Personal DV deconvolution mikroskop og tilhørende SoftWorX ansøgning suite (Applied Precision, Inc., WA).

  1. Tænd mikroskop, herunder erhvervelse arbejdsstation og instrument controller. Åbn Resolve3D ansøgning til initialisere mikroskopbordet og tænd xenon lyskilde. Tillad 10 min i lyskilde at varme op og nå stabile forhold.
  2. Tilføj etdråbe immersionsolie (brydningsindeks 1.520 for levende prøver ved 37 ° C eller 1,516 for faste prøver ved RT) på 60X 1,42 NA objektiv, og center slide prøven (dækglas nedad) i objektivlinsen.
  3. Brug enten lyse-field eller ekstern belysning og den grove fokus justering knop, langsomt hæve målet objektivet, indtil perlen af ​​fordybelse olie kommer i kontakt med det omvendte låg glas. (Fra dette punkt, bør cellen laget kommet i fokus inden for et par omgange af den fine fokus justering knop). Når du arbejder med faste prøver på de dias, anbefales det at undgå celler inden for eller i nærheden af ​​områder med bobler. Ved visning med levende prøver på glasbund fad, undgå at flytte objektivlinsen udenfor grænsen af ​​dækglas.
  4. Autophagosomes kan identificeres ved eGFP signal (grøn). Lysosomer identificeres ved LysoTracker Rød (live prøve) eller anti-Lamp1 fluorescerende antistof (fast prøve). Cellekerner identificeres ved DAPI staining (fast prøve).
  5. Vælg den ønskede synsfelt. Ideelt bør celler udviser god fluorescerende signal i alle relevante kanaler, og tilstrækkeligt fastgjort og spredt ud på dækglasset overflade, så de intracellulære indhold er nemme at visualisere. Små justeringer i laterale x, y og z-fokus kan styres af computeren ved hjælp af Acquire3D interface. Indstil binning til 1x1 eller 2x2, afhængigt af den ønskede synsfelt (flere celler kan ses i feltet, når arkivering er sat til 2x2).
  6. For en given billede gennem midtersektionen i en celle, skal du indstille eksponering parametre (f.eks% sendeeffekt og eksponering tid), således at den maksimale pixelintensitet ikke overstiger 3.000 tæller. Generelt bør% transmission sættes så lavt som muligt, uden at hæve den tilsvarende eksponeringstid over 1 sek. Gentag denne procedure for hver fluorescens farve, der skal afbildes, og for hver særskilt synsfelt for at opnå den højeste kvalitet billeder.
  7. Sæt upper og nedre grænser for Z-stakken ved at justere fokus bare lidt over toppen og bunden af ​​cellen prøven hhv. Det samlede antal billeder i en given Z-stakken vil således blive bestemt af disse grænser og af afstanden mellem lagene (standard værdi: 0,2 um).
  8. For at minimere bevægelsesartefakter under billedet erhvervelse, anbefaler vi at indstille billede erhvervelse til "bølgelængde og derefter z-stack" til faste prøver, og "z-stak derefter bølgelængde" for levende prøver.
  9. Fluorescens billeder er udfoldede hjælp SoftWorX (Applied Precision, WA) og senere analyseret ved hjælp Volocity (Improvision, nu Perkin Elmer, MA).

4.. Del 4: Super-opløsning, strukturerede belysning (OMX) Microscopy

Protokollen i dette afsnit gælder for brugen af ​​OMX Structured Illumination Microscope (Applied Precision, WA).

  1. Tænd for hovedafbryderen og ønskede lasere (410 nm, 488 nm og / eller 532 nm). Vent i 20 min for lasere til at blive termisk stabiliseret.
  2. Tilføj nedsænkning olie (brydningsindeks 1,516 for faste prøver ved RT) på 60X 1,42 NA objektiv. Hvis bobler ses i olien dråbe, rense objektiv og tilsæt olie igen.
  3. Placer prøven glider på scenen og om nødvendigt tillade 10 min for celler til at bosætte sig på dækglas.
  4. Initialiser købet programmet. Brug fluorescensbelysning at justere fokus, indtil en skarp kontur af cellen kan ses. (Der bør udvises forsigtighed på alle tidspunkter for at minimere eksponeringen af ​​celler til fluorescens excitation, indtil den faktiske billede erhvervelse).
  5. En spiral mosaik scanning kan erhverves til at få vist større områder af prøven for at vælge celler eller områder af interesse. Det anbefales at bruge korte eksponeringstider (1-10 msek) og lav magnetisering magt (0,1-1% transmission) under scanning af prøven eller finde mål.
  6. Identificer autophagosomes af GFP-LC3 fluorescens. Identificer lysosomer af Alexa Fluor 555 anti-LAMP(Lysosom-associeret membranprotein) og cellekerner hjælp DAPI (faste prøver).
  7. Vælg eksperimentelle betingelser, herunder excitationsbølgelængde, billede område (f.eks 512x512), stak tykkelse, eksponeringstid, og laser transmission procentdel. For super løst billederne, skal du sikre, at den strukturerede belysning mulighed er aktiveret. For deconvolution mikroskopi på OMX, skal du vælge den konventionelle belysning mulighed.
  8. For de bedste genopbygning resultater, vælges eksperimentelle sådanne betingelser, at den maksimale intensitet count er mellem 10.000 og 15.000 under købet. Hvis fotoblegning er en bekymring, kan billeddannelse ved en lavere eksponering (tæller mellem 5.000 og 10.000) anvendes. Ideelt set bør tæller ikke falde mere end en faktor på to under hele erhvervelse, og falder med mere end en faktor fire, bør undgås. Hvis det er nødvendigt, reducere stakken tykkelse for at sikre en vedvarende intensitet tæller. Kameraet mætter ved 64.000 tællinger, så maksimum itensity bør aldrig overstige dette. Af gode prøver, fandt vi de eksperimentelle betingelser for at være 10 ~ 50 msek eksponeringstid med 1% laser transmission. Lyse og fotostabilt stikprøver, som kan afbildes gentagne gange foretrækkes. En stabil pletten er påkrævet for time-lapse, super løst billeder.
  9. For at reducere støjen, en 95MHz udlæsning hastighed (Medium speed option) og erhvervelse tid på 2 msek eller mere anbefales. Øgede artefakter er opnået i den rekonstruerede filmede, når prøven bevæger under overtagelsen. På grund af denne effekt er korte eksponeringer anbefales til ikke-klæbende eller hurtig bevægelse celler.
  10. Multikanal billeddannelse kan udføres samtidigt eller sekventielt. Sekventiel funktion giver mindre cross-talk og anbefales derfor.
  11. At reducere fotoblegning, anbefales det generelt at billedet med længere excitationsbølgelængder først (532 nm, 488 nm, og derefter 410 nm). Men for de eksperimentelle resultater vist i figur 3, var denne ordre omvendtd (dvs. 48 nm, 532 nm og 410 nm) på grund af fotostabilitet af denne særlige prøve.
  12. Indstil den øvre / nedre grænse for Z-stack ved at flytte mikroskopbordet indtil toppen / bunden af ​​cellerne er lidt ude af fokus. Den ønskede afstand mellem hvert billede skal holdes konstant på 0,125 um for super opløsning billeddannelse, som genopbygningen software får denne værdi som standard.
  13. Rekonstruere billedstakke hjælp SoftWorX (Applied Precision, WA) og analysere ved hjælp Volocity 6.0 (Perkin Elmer, MA).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Billedet sekvensen vist i Figur 1 viser de fysiske forandringer, der sker i CWR22-celler i løbet af de første 80 min af autophagy induktion. I denne og andre undersøgelser (ikke vist) vi konsekvent overholdes: (1) forskydning af kernen bort fra midten af ​​cellen, (2) reduktion af Focal berøringspunkter, og (3) generelle translokation af autophagosomes og lysosomer mod midten af celle. Desuden observerede vi en lille stigning i colokalisering (med gult) mellem autophagosomes (grøn) og lysosomer (rød), på senere tidspunkter.

Som en demonstration af image-baserede cytometri, brugte vi Volocity digital billedbehandling ansøgning suite (version 6.0, Improvision / Perkin-Elmer) for at identificere, tælle, og indsamle statistiske data om mærkede autophagosomes og lysosomer i billederne af CWR22 celler vist i Figur 1. Som det fremgår af diagrammerne i figur 2, antallet og størrelsen af tHan autophagosome (efter deres første dannelse og udseende) ikke variere med tiden: efter 80 min af autophagy induktion, var der en gradvis, men netto fald i antallet af autophagosomes (figur 2A) med en tilsvarende stigning i den gennemsnitlige størrelse autophagosomes ( Figur 2B). Derudover var der en målelig stigning i colokalisering af autophagosomes og lysosomer, baseret på Pearsons Korrelationskoefficient analyse (figur 2C). Sammen disse resultater foreslog, at ved stimulering af autophagy, talrige små autophagosomes smelte og danne større autophagosomes over tid (figur 2D). Mens figur 1 og 2 afspejler resultatet af kun en enkelt imaging undersøgelse, og mere stringent kvantitativ analyse vil blive behov for at trække en fast konklusion, gjorde det illustrere de funktioner og fordele ved kvantitativ fluorescens mikroskopi. Vi er aktivt at bruge denne teknik i our fortsatte efterforskning af den molekylære mekanisme og proces cellulær autophagy.

Figur 3A viser en side-by-side sammenligning af billeder, der er erhvervet, og rekonstrueret i DV-tilstand (simuleret Widefield deconvolution, til venstre) vs strukturerede belysning tilstand ved hjælp af OMX mikroskop (til højre). Lateral opløsning blev forbedret til op til 120 nm, dobbelt så høj opløsning som konventionelle diffraktionsbegrænset mikroskopi 14,15. Små colokalisering af autophagosomes og lysosomer (figur 3B, angivet med pile), var tydeligt med super-opløsning mikroskopi, mens de var næppe tydeligt med konventionel fluorescens billeddannelse.

En af fordelene ved at bruge Dekonvolution Microscopy er at genopbygge alle billeder i en 3D-model, der vil afsløre mere præcise geografisk information mellem forskellige molekyler. Movie 1 viser et samlet billede af en CWR22 RV1 celle undergoing autophagy på senere tidspunkt, hvor betydelig mængde colokalisering mellem autophagosome og Lysosom begynder at forekomme. E-cadherin farvning (som anført i hvid farve) viser omridset af målcellen. I Movie 2, giver den 3D-rekonstruerede model mere rumlige detaljer om fusion mellem autophagosomes og lysosomer (som angivet i gul farve). Vi kan tydeligt se samspillet mellem grønne LC3 signaler og røde Lysosom signaler samt sammenfletningen af ​​de to signaler til at producere gule signaler.

Figur 1
Figur 1. Time-lapse billeder af CWR22 RV1 celler behandlet med ADI. Billedsekvens viser CWR22 RV1 celler behandlet med ADI for 80 min. (2D-billeder opnået fra originale billedstakke ved maksimal Z projektion). WHITE punkterede linie repræsenterer omridset af cellen, og lyset-skraverede område repræsenterer positionen af ​​kernen.

Figur 2
Figur 2. Statistisk analyse. Statistiske tendenser blev udvundet ved at analysere billedet sekvensen vist i figur 1 som en demonstration af, at det billede, data kan kvantificeres. Klik her for at se større figur .

Figur 3
Figur 3. Autophagosome og Lysosom distribution i cellen. A. Top) Side-by-side sammenligning af billeder, der er erhvervet, og rekonstrueret i DV-tilstand (simuleret Widefield deconvolution, til venstre) og struktureret-belysning tilstand ved hjælp af OMX mikroskop (til højre). Scale bar repræsenterer 5 um. B. Bottom) Mindre colokalisering af autophagosomes og lysosomer (angivet med pile).

Movie 1 og Movie 2. 3D Rekonstruktion af CWR22 RV1 Cell Gennemgår Autophagy. Denne film illustrerer en normal autophagy induktion efter ADI behandling. Z-Stack billeder blev omdannet til et 3-dimensionel model. Denne film blev genereret ved at dreje cellen 360 ° vandret og 360 ° lodret. Grønt signal repræsenterer LC3, rødt signal repræsenterer lysosom, hvid signal repræsenterer E-Cadherin og blå signal repræsenterer kernen. Klik her for at se Movie 1 eller= "_blank"> Klik her for at se Movie 2.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Mens de direkte observation af celler mærket med fluorescerende prober mod LC3 almindeligt accepteret som en standard metode til at bekræfte autophagic respons 6, kvantitativ 3D billeddannelse af det samme system (som vi har gjort) giver hidtil uset information og detaljer om den komplekse proces cellulær autophagy . I særdeleshed, observere vi, at hundredvis (hvis ikke tusindvis) af autophagosomes i levende celler er dannet inden for 80 min af autophagy induktion. Ligeledes ser vi meget interessante morfologiske ændringer i fordelingen af ​​lysosomale rum under autophagy induktion. Inden for en given celle, tyder nedgangen i autophagosome nummer og den tilsvarende stigning i deres gennemsnitlige størrelse over tid, at autophagosomes vokse sig større ved at fusionere med hinanden, før kombineres med lysosomer til dannelse autolysosomes. Høj opløsning 3D fluorescens billeddannelse af levende celler gør det muligt at undersøge, om autophagosomes skal nå en kritisk størrelse before fusing med lysosomer, eller om autophagy kan fortsætte blot på en mindre fysisk størrelse. I betragtning af antallet af meget små autophagosomes der vises på tidlig aktivering lige ved opløsning grænse deconvolution mikroskop, og meget mere klart løses på OMX strukturerede belysning mikroskop 13, kan det være tilfældet, at hovedparten af autophagic aktivitet faktisk På dette niveau.

Muligheden for at overvåge levende celler i løbet af autofagi er kritisk vigtigt, da ændringerne i antallet og størrelsen af ​​autophagosomes i en given celle kan være lille i forhold til variationer af disse parametre fra celle til celle. Ved at studere en enkelt, levende celle over tid - vi kan være mere sikker på, at de morfologiske ændringer, som vi observerer skyldes eksperimentelle betingelser, snarere end statistisk varians.

Endelig med specifikke molekylære markører, kan vi anvende disse billeddannende teknikker til at studeretidlig dannelse af autophagosomes, at spore oprindelsen af ​​de autophagosomal membraner, og for at identificere mulige organeller og / eller intracellulære komponenter, der er specielt omspændt autophagosomes løbet autophagy induktion. Vi håber også, at denne tilgang vil gøre det muligt for os at undersøge rolle autophagy i celle-overlevelse og celledød, og bedre karakterisere effekten af ​​potentielle lægemidler og inhibitorer på autofagi.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Ingen interessekonflikter erklæret.

Acknowledgments

Grant support: NIH CA165263, NIH CA150197, NIH CA150197S1 (HJ Kung), NIH CA150197S1 (CA Changou), NSF PHY-0.120.999 Center for Biophotonics Science & Technology (DL Wolfson, FYS Chuang), DOD PC073420 (RJ Fed), The Research Norges, Leiv Eiriksson rejselegat 209286/F11 (BS Ahluwalia). HJ Kung anerkender også støtte fra Auburn Community Cancer Endowment Fund. RJ Fed anerkender også støtte fra J. McDonald begavelse.

Vi takker Dr. Jenny Wei-Jen Kung og Dr. Bor-wen Wu på DesigneRx for generøs levering af ADI.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Arginine Deiminase (ADI) DesigneRx
HEPES Sigma H4034
Casein Sigma C5890
Paraformaldehyde Fisher 4042
Saponin Sigma S4521
Alexa anti-mouse 555 Invitrogen A21422
Alexa anti-rabbit 647 Invitrogen A21244
LysoTracker Red DND-99 Invitrogen L7528
anti-Lamp1 DSHB H4A3
anti-Cadherin Cell Signaling #3195
SlowFade Gold Invitrogen S36936
35 mm poly-d-lysine coated glass bottom plate MatTek P35GC-1.5-1.4-C
No.1, 22 mm coverslip Corning #2865-22
Microscope slides Globe Scientific 1324G

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Kim, R. H., Coates, J. M., Bowles, T. L., McNerney, G. P., Sutcliffe, J., Jung, J. U., Gandour-Edwards, R., Chuang, F. Y., Bold, R. J., Kung, H. J. Arginine deiminase as a novel therapy for prostate cancer induces autophagy and caspase-independent apoptosis. Cancer Res. 69, (2), 700-708 (2009).
  2. Miyazaki, K., Takaku, H., Umeda, M., et al. Potent growth inhibition of human tumor cells in culture by arginine deiminase purified from a culture medium of a Mycoplasma-infected cell line. Cancer Res. 50, 4522-4527 (1990).
  3. Takaku, H., Matsumoto, M., Misawa, S., Miyazaki, K. Anti-tumor activity of arginine deiminase from Mycoplasma argini and its growth-inhibitory mechanism. Jpn. J. Cancer Res. 86, 840-846 (1995).
  4. Levine, B., Klionsky, D. J. Development by self-digestion: molecular mechanisms and biological functions of autophagy. Dev. Cell. 6, 463-477 (2004).
  5. Mizushima, N., Levine, B., Cuervo, A. M., Klionsky, D. J. Autophagy fights disease through cellular self-digestion. Nature. 451, 1069-1075 (2008).
  6. Kabeya, Y., Mizushima, N., Ueno, T. LC3, a mammalian homologue of yeast Apg8p, is localized in autophagosome membranes after processing. EMBO J. 19, 5720-5728 (2000).
  7. Pattingre, S., Espert, L., Biard-Piechaczyk, M., Codogno, P. Regulation of macroautophagy by mTOR and Beclin 1 complexes. Biochimie. 90, 313-323 (2008).
  8. Maiuri, M. C., Criollo, A., Tasdemir, E., et al. BH3-only proteins and BH3mimetics induce autophagy by competitively disrupting the interaction between Beclin 1 and Bcl-2/Bcl-X(L). Autophagy. 3, 374-376 (2007).
  9. Crighton, D., Wilkinson, S., O'Prey, J., et al. DRAM, a p53-induced modulator of autophagy, is critical for apoptosis. Cell. 126, 121-134 (2008).
  10. Dillon, B. J., Prieto, V. G., Curley, S. A., et al. Incidence and distribution of argininosuccinate synthetase deficiency in human cancers: a method for identifying cancers sensitive to arginine deprivation. Cancer. 100, 826-833 (2004).
  11. Dale, B. M., McNerney, G. P., Thompson, D. L., et al. Cell-to-cell transfer of HIV-1 via virological synapses leads to endosomal virion maturation that activates viral membrane fusion. Cell Host & Microbe. 10, (6), 551-562 (2011).
  12. Cogger, V. C., McNerney, G. P., Nyunt, T., et al. Three-dimensional structured illumination microscopy of liver sinusoidal endothelial cell fenestrations. J. Struct. Biol. 171, (3), 382-388 (2010).
  13. York, A. G., Parekh, S. H., Nogare, D. D., et al. Resolution doubling in live, multicellular organisms via multifocal structured illumination microscopy. Nat. Methods. 9, (7), 749-754 (2012).
  14. Gustafsson, M. G. L. Surpassing the lateral resolution limit by factor of two using structured illumination microscopy. Journal of Microscopy. 198, 82-87 (2000).
  15. Shao, L., Kner, P., Rego, E. H., Gustaffson, M. G. Super-resolution 3D microscopy of live whole cells using structured illumination. Nat. Method. 8, (12), 1044-1046 (2011).
Kvantitativ analyse af Autophagy hjælp Advanced 3D fluorescensmikroskopi
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Changou, C. A., Wolfson, D. L., Ahluwalia, B. S., Bold, R. J., Kung, H. J., Chuang, F. Y. S. Quantitative Analysis of Autophagy using Advanced 3D Fluorescence Microscopy. J. Vis. Exp. (75), e50047, doi:10.3791/50047 (2013).More

Changou, C. A., Wolfson, D. L., Ahluwalia, B. S., Bold, R. J., Kung, H. J., Chuang, F. Y. S. Quantitative Analysis of Autophagy using Advanced 3D Fluorescence Microscopy. J. Vis. Exp. (75), e50047, doi:10.3791/50047 (2013).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter