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Biology

Quantitative Analyse von Autophagie mit Advanced 3D Fluoreszenzmikroskopie

doi: 10.3791/50047 Published: May 3, 2013

Summary

Autophagie ist ein allgegenwärtiges Prozess, Zellen zu zersetzen und zu recyceln Proteine ​​und Organellen ermöglicht. Wir bieten fortschrittliche Fluoreszenzmikroskopie zu visualisieren und zu quantifizieren, die klein, aber wichtig, körperliche Veränderungen mit der Induktion von Autophagie verbunden sind, einschließlich der Bildung und Verteilung von Autophagosomen und Lysosomen, und deren Verschmelzung zu autolysosomes.

Abstract

Prostatakrebs ist die führende Form von malignen Erkrankungen bei Männern in den USA Während der Operation trägt ein erhebliches Risiko von Impotenz und Inkontinenz, haben traditionelle chemotherapeutische Ansätze weitgehend erfolglos. Hormontherapie ist in einem frühen Stadium wirksam, aber oft nicht mit dem späteren Entwicklung von Hormon-resistentem Tumoren. Wir haben in die Entwicklung von Therapeutika für bestimmte metabolische Mangel von Tumorzellen interessiert. Wir haben kürzlich gezeigt, dass die Prostata-Tumorzellen spezifisch fehlt ein Enzym (Argininosuccinatsynthase oder ASS) für die Synthese der Aminosäure Arginin 1 beteiligt. Dieser Zustand bewirkt, dass die Tumorzellen abhängig zu werden exogenen Arginin, und sie unterziehen metabolischen Stress, wenn der freie Arginin durch Arginindeiminase (ADI) 1,10 aufgebraucht ist. In der Tat haben wir gezeigt, dass die menschliche Prostata-Krebszellen CWR22 Rv1 effektiv durch ADI mit Caspase-unabhängige Apoptose und aggressive autopha getötetgy (oder Makroautophagie) 1,2,3. Autophagie ist ein evolutionär konservierten Prozess, Zellen zu verstoffwechseln unerwünschte Proteine ​​durch lysosomalen Abbau während Ernährungs Hunger 4,5 ermöglicht. Obwohl die wesentlichen Komponenten dieses Weges gut charakterisierten 6,7,8,9 sind, sind viele Aspekte der molekularen Mechanismus noch unklar - insbesondere, was ist die Rolle der Autophagie in den Tod-Reaktion von Prostata-Krebszellen nach Behandlung ADI ? Um diese Frage zu beantworten, benötigten wir ein experimentelles Verfahren, um das Niveau und den Umfang der autophagic Reaktion in Zellen zu messen - und da es keine bekannten molekularen Markern, die genau verfolgen können diesen Prozess sind, entschieden wir uns für ein bildgebendes Ansatz zu entwickeln, mit quantitative 3D Fluoreszenzmikroskopie 11,12.

Mit CWR22Rv1 Zellen mit fluoreszierenden Sonden für Autophagosomen und Lysosomen speziell markierten, zeigen wir, dass 3D-Bild Stapel entweder mit wi erworbendefield Entfaltung Mikroskopie (und später, mit Super-Auflösung, strukturierte Illumination Microscopy) eindeutig erfassen die frühen Phasen der Autophagie Induktion. Mit kommerziell verfügbaren digitalen Bildanalyse, können wir leicht zu bekommen statistische Informationen über Autophagosom und Lysosomen Anzahl, Größe, Verteilung und Grad der Kolokalisation von jedem abgebildeten Zelle. Diese Informationen ermöglichen es uns, genau zu verfolgen den Fortschritt der Autophagie in lebenden Zellen und ermöglicht unseren fortgesetzten Untersuchung in die Rolle der Autophagie in Krebs-Chemotherapie.

Protocol

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1. Teil 1: Zellkultur und Immuno-Fluoreszenz-Labeling

  1. Wachsen CWR22 Rv1 menschlichen Prostata-Tumorzellen auf Deckgläschen (# 1.5 bzw. 170 um Dicke) in 6-well Platten mit RPMI (Mediatech, VA) mit 10% fötalem Rinderserum (FBS) und 1% Penicillin / Streptomycin / Glutamin.
  2. Induce Autophagie durch Behandlung mit ausgewählten Proben Arginindeiminase (ADI, 0,3 ug / ml) in Phosphat-gepufferter Salzlösung (PBS).
  3. Fix-Zellen mit 4% Paraformaldehyd (PFA, Fisher Scientific, NH) in PBS verdünnt; 100 ul pro Deckglas für 10 min bei RT.
  4. Waschen der Zellen 3x mit 1 ml HBS / BSA.
  5. Durchdringbar Zellen mit 0,05% Saponin (Sigma, MO) in HEPES (HBS) / BSA, 100 ul pro Deckglas 15 min bei RT.
  6. Vor der Immuno-Kennzeichnung, Block Proben mit 2,5% Casein (Sigma, MO) in HBS / BSA, 100 ul pro Deckglas für 1 h bei RT.
  7. Inkubieren fixierten Zellen mit primären Antikörpern in 2,5% Casein / HBS / BSA, 100 ul pro coversl verdünntip, O / N bei 4 ° C.
  8. Waschen der Zellen 3x mit 1 ml HBS / BSA.
  9. Inkubieren fixierten Zellen mit sekundären Antikörpern in 2,5% Kasein / HBS / BSA, 100 ul pro Deckglas verdünnt, 1 h bei RT.
  10. Waschen der Zellen 3x mit 1 ml HBS / BSA.
  11. Montieren vorbereiteten Deckgläser auf reguläre Glas Objektträger mit SlowFade Gold-oder Gold-Verlängern antifade Reagenz (Invitrogen, CA) mit 4 ',6-Diamino-2-phenylindol (DAPI).
  12. Seal Deckglas Kanten mit Nagellack. Für beste Bildergebnisse, damit sie rechtzeitig (idealerweise O / N) für anti-fade Medien gründlich durchdringen Zellen.
  13. Saubere Deckglas mit Methanol und / oder Chloroform.
  14. In Immersionsöl (Brechungsindex 1,520 bei der Bildgebung bei 37 ° C oder 1,516 bei der Bildgebung bei RT) an die 60X 1,42 NA Objektiv (Olympus, Japan).
  15. Position gleiten auf der Bühne und schaffen Mikroskop Fokus mit den Zellen von Interesse.

2. Teil 2: Herstellung von Zellen, für Live-Imaging

  1. Wachsen CWR22 Rv1 Zellen, die grün fluoreszierendes Protein-gekoppelten Light Chain 3 (LC3-GFP) in RPMI Kulturmedium, enthaltend 10% FBS und 1% Antibiotika auf 35 mm Poly-D-Lysin beschichteten Glasboden Kulturschalen (MatTek, MA). Die Zellen sollten in ausreichender Dichte beschichtet werden, um eine schnelle Verbreitung zu erleichtern, aber nicht so viel, dass die Zellen überwachsen und verklumpt durch die Zeit der Bildgebung sind.
  2. Gönnen ausgewählt Zellproben mit ADI (0,3 ug / ml) in PBS.
  3. Etwa 1 Stunde vor der Bildgebung, verdünnte 1,5 ul LysoTracker Red DND-99 (Invitrogen, CA) mit 20 ml RPMI. enthaltend 10% FBS und 1% Antibiotika. Mit Lösungen, die ADI für ausgewählte Proben. Halte alle Medien auf 37 ° C vor der Zugabe in der Kulturschale.
  4. Inkubieren Zellen mit RPMI mit LysoTracker Red DND-99 für 15-45 min bei 37 ° C
  5. Etwa 30 min vor der Bildgebung auf der WeatherStation Schutzgehäuse drehen und ermöglichen bis 37 ° C ins Gleichgewicht und 5% CO 2 (mit Humidified Luft).
  6. Waschen der Zellen mit PBS gewaschen und ersetzen Medien mit Standard-RPMI mit nur 10% FBS und 1% Antibiotika. In ADI um Proben wie angegeben.
  7. Berg 35 mm Deckglas-bottom Kulturschalen in kundenspezifische Adapter (Applied Precision, Inc., WA), und die Position auf dem Mikroskop Bühne. Verwenden Immersionsöl (Brechungsindex 1,520) auf dem 60X 1,42 NA Objektiv, und positionieren Sie den montierten Kulturschale auf der Bühne.

3. Teil 3: Dekonvolution Microscopy and Analysis

Das Protokoll in diesem Abschnitt wird vorausgesetzt, die Verwendung des DV DeltaVision Persönliche Entfaltung Mikroskop und zugehörigen SoftWorX Application Suite (Applied Precision, Inc., WA).

  1. Schalten Sie Mikroskop-System, einschließlich der Akquisitions-Workstation und Instrument-Controller. Öffnen Resolve3D Anwendung das Mikroskop Bühne und wiederum auf der Xenon-Lichtquelle zu initialisieren. Warten Sie 10 min für Lichtquelle, um sich aufzuwärmen und erreichen einen stabilen Bedingungen.
  2. HinzufügenTropfen Immersionsöl (Brechungsindex 1,520 für lebende Proben, die bei 37 ° C oder 1,516 für feste Proben bei RT) auf der 60X 1,42 NA Objektiv und Zentrum Gewebeprobe (Deckglas nach unten) über die Objektivlinse.
  3. Entweder mit Hellfeld-oder Außenbeleuchtung und Grobfokus Einstellknopf langsam erhöhen Objektivlinse bis der Wulst Immersionsöl Kontakt mit dem invertierten Deckglas. (Von diesem Punkt die Zellschicht sollten in den Fokus innerhalb von ein paar Windungen der feinen Schärfe einzustellen Knopf kommen). Bei der Arbeit mit festen Proben auf den Objektträgern, ist es empfehlenswert, Zellen innerhalb oder in der Nähe von Gebieten mit Blasen zu vermeiden. Bei der Anzeige mit Live-Proben auf dem Glasboden-Gericht, zu vermeiden Bewegen der Objektivlinse außerhalb der Grenze des Deckglas.
  4. Autophagosomen kann durch eGFP-Signal (grün) identifiziert werden. Lysosomen sind von LysoTracker Red (live Probe) oder anti-Lamp1 Fluoreszenz-Antikörper (feste Probe) identifiziert. Zellkerne sind durch DAPI st identifiziertaining (feste Probe).
  5. Wählen Sie die gewünschte Sichtfeld. Im Idealfall sollten die Zellen gut Fluoreszenzsignal in allen geeigneten Kanäle aufweisen und ausreichend befestigt und auf dem Deckglas Oberfläche, so dass die intrazelluläre Inhalte einfach zu visualisieren sind verteilt. Kleine Änderungen in seitlicher x-, y-und z-Ausrichtung kann durch den Computer unter Verwendung des Acquire3D Schnittstelle gesteuert werden. Setzen Binning 1x1 bis 2x2 oder, je nach gewünschter Sichtfeld (mehr Zellen können in das Feld, wenn Binning auf 2x2 gesetzt ist zu sehen).
  6. Für ein gegebenes Bild durch den Mittelteil einer Zelle, die Belichtung Parameter (zB% Sendeleistung und Belichtungszeit), so dass die maximale Pixelintensität nicht überschreitet 3000 zählt. Im Allgemeinen sollte% Transmission so niedrig wie möglich eingestellt werden, ohne Erhöhung der entsprechenden Belichtungszeit länger als 1 Sekunde. Wiederholen Sie diesen Vorgang für jeden Fluoreszenz Farbe abgebildet werden und für jeden einzelnen Bereich der Blick auf die Bilder von höchster Qualität zu erhalten.
  7. Stellen Sie die upper und unteren Grenzen des Z-Stapel durch Einstellen des Fokus nur geringfügig über die oberen und unteren Ende der Zellprobe sind. Die Gesamtzahl der Bilder in einer bestimmten Z-Stapel wird somit durch diese Grenzwerte und durch den Abstand zwischen den Schichten (: 0,2 um Voreinstellung) bestimmt werden.
  8. Um Bewegungsartefakte während der Bildaufnahme zu minimieren, empfehlen wir, die Bildaufnahme-Modus auf "Wellenlänge dann z-Stapel" für feste Proben, und "z-Stapel dann Wellenlänge" für Live-Proben.
  9. Fluoreszenz-Bilder werden mit entfalteten SoftWorX (Applied Precision, WA) und später unter Verwendung Volocity (Improvision, jetzt Perkin Elmer, MA).

4. Teil 4: Super-Auflösung, Structured-Beleuchtung (OMX) Mikroskopie

Das Protokoll in diesem Abschnitt gilt für die Nutzung der OMX Structured Illumination Microscope (Applied Precision, WA).

  1. Schalten Sie den Netzschalter aus und gewünschte Laser (410 nm, 488 nm und / oder 532 nm). Warten Sie, bis 20 kmn für die Laser thermisch stabilisiert werden.
  2. In Immersionsöl (Brechungsindex 1,516 für feste Proben bei RT) auf dem 60X 1,42 NA Objektiv. Wenn Blasen in der Öltropfen zu sehen sind, reinigen Sie das Ziel und Öl wieder.
  3. Zeigen Probenobjektträger auf der Bühne und bei Bedarf lassen Sie 10 min für Zellen auf Deckglas begleichen.
  4. Initialisieren die Akquisition Programm. Verwenden Fluoreszenzbeleuchtung um den Fokus einzustellen, bis eine scharfe Kontur der Zelle zu sehen. (Es sollte zu allen Zeiten, um die Exposition von Zellen gegenüber Fluoreszenzanregung zu minimieren, bis die tatsächliche Bildaufnahme).
  5. Eine Spirale Mosaik Scan kann erworben, um größere Bereiche der Probe Vorschau auf Zellen oder Bereiche von Interesse auszuwählen. Es wird empfohlen, kurze Belichtungszeiten (1-10 ms) und niedrigen Anregungsenergie (0,1-1% Transmission) verwenden, während Abtasten der Probe oder der Suche nach Zielen.
  6. Identifizieren Autophagosomen von GFP-LC3 Fluoreszenz. Identifizieren Lysosomen von Alexa Fluor 555 anti-LAMP(Lysosom-assoziiertes Membranprotein) und Zellkerne mit DAPI (feste Proben).
  7. Wählen experimentellen Bedingungen einschließlich Anregungswellenlänge Bildbereich (zB 512x512), Stapeldicke, Belichtungszeit und Laserübertragung Prozentsatz. Für Super aufgelöste Bilder, sicherzustellen, dass die strukturierte Beleuchtung Option aktiviert ist. Für Entfaltung Mikroskopie an der OMX, wählen Sie die Option konventioneller Beleuchtung.
  8. Für die besten Ergebnisse Rekonstruktion Wählen experimentellen Bedingungen, so dass die maximale Intensität Zahl zwischen 10.000 und 15.000 ist während der Aufnahme. Wenn Bleichen ist ein Anliegen, kann Bildgebung bei einer niedrigeren Exposition (zählt zwischen 5.000 und 10.000) verwendet werden. Idealerweise sollte die Zählungen nicht um mehr als den Faktor zwei über die gesamte Erfassung und verringert sich um mehr als einen Faktor von vier zu vermeiden. Falls erforderlich, reduzieren Sie die Stapeldicke eine nachhaltige Intensität Zählung zu gewährleisten. Die Kamera sättigt mit 64.000 zählt, also maximal inIntensität sollte nie mehr als diese. Für eine gute Proben, fanden wir die experimentellen Bedingungen zu 10 sein ~ 50 ms Belichtungszeit mit 1% Laserübertragung. Helle und photostabil Proben, die immer wieder abgebildet werden können, werden bevorzugt. Eine stabile Fleck für Zeitraffer, super aufgelöste Bilder erforderlich.
  9. Um das Rauschen, ein 95MHz Auslesegeschwindigkeit (Medium Speed ​​Option) und den Erwerb von 2 ms oder mehr reduzieren wird empfohlen. Erhöhte Artefakte werden in der rekonstruierten abgebildeten, wenn die Probe während der Aufnahme bewegt erhalten. Aufgrund dieser Wirkung werden kurze Belichtungszeiten für nicht haftende oder sich schnell bewegende Zellen empfohlen.
  10. Mehrkanal-Bildgebung kann gleichzeitig oder nacheinander durchgeführt werden. Modus Sequential Renditen weniger Übersprechen und wird daher empfohlen.
  11. Zur Reduzierung Bleichen, ist es im Allgemeinen dem Bild mit mehr Anregungswellenlängen ersten (532 nm, 488 nm, und 410 nm) empfohlen. Für den experimentellen Ergebnissen in Fig. 3 gezeigt, war das Rückwärtsd (dh 48 nm, 532 nm und 410 nm) auf die Photostabilität von diesem bestimmten Probe.
  12. Stellen Sie den oberen / unteren Grenze des Z-Stapel durch das Mikroskop zu bewegen, bis die Bühne oben / unten der Zellen ist etwas unscharf. Der gewünschte Abstand zwischen jedem Bild sollte konstant gehalten werden, um bei 0,125 für Super-Resolution Imaging, als Rekonstruktion Software nehmen diesen Wert als Standard.
  13. Rekonstruieren Bildstapeln mit SoftWorX (Applied Precision, WA) und analysieren mit Volocity 6.0 (Perkin Elmer, MA).

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Representative Results

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Die Bildsequenz in 1 gezeigt sind die körperlichen Veränderungen, die in CWR22-Zellen auftreten, während der ersten 80 min der autophagy Induktion. In dieser und anderen Studien (nicht gezeigt) wir konsequent beobachtet: (1) Verschiebung des Kerns vom Zentrum der Zelle, (2) Reduktion der fokalen Adhäsion Punkte, und (3) allgemeine Translokation Autophagosomen und Lysosomen in Richtung der Mitte des Zelle. Darüber hinaus haben wir auch beobachtet einen leichten Anstieg in Kolokalisation (gelb) zwischen Autophagosomen (grün) und Lysosomen (rot), zu späteren Zeitpunkten.

Als Demonstration der bildbasierten Durchflusszytometrie, nutzten wir die Volocity Digital Imaging Application Suite (Version 6.0, Improvision / Perkin-Elmer) zu identifizieren, zu zählen, und statistische Daten auf markierten Autophagosomen und Lysosomen in den Bildern der CWR22 Zellen gezeigt in Abbildung 1. Wie durch die Diagramme in Fig. 2 gezeigt, die Anzahl und Größe von ter Autophagosom (nach ihrer ersten Bildung und Aussehen) haben mit der Zeit variieren: nach 80 min Induktion der Autophagie, gab es einen allmählichen, aber Netto-Rückgang in der Anzahl der Autophagosomen (2A) mit einem entsprechenden Anstieg in der durchschnittlichen Größe der Autophagosomen ( Abbildung 2B). Darüber hinaus gab es eine messbare Erhöhung der Kolokalisation von Autophagosomen und Lysosomen, auf Pearsons Korrelationskoeffizient Analyse (Abbildung 2C) basiert. Gemeinsam schlugen diese Ergebnisse, dass nach Stimulation der Autophagie, zahlreiche kleine Autophagosomen größere Autophagosomen im Laufe der Zeit (Abbildung 2D) bilden verschmelzen. Während 1 und 2 reflektiert die Ergebnisse von nur einem einzigen bildgebenden Studie und strengere quantitative Analyse wird benötigt, um eine sichere Schlussfolgerung zu ziehen, hat es veranschaulichen die Merkmale und Vorteile der quantitativen Fluoreszenzmikroskopie. Wir sind aktiv mit dieser Technik in our weiter Untersuchung der molekularen Mechanismen und Verfahren der zellulären autophagy.

3A zeigt einen Side-by-Side-Vergleich der Bilder erworben und rekonstruiert im DV-Modus (simulierte Weitfeld Entfaltung, links) vs strukturierten Beleuchtung Modus mit der OMX Mikroskop (rechts). Laterale Auflösung wurde auf bis zu 120 nm, zweimal die Auflösung des herkömmlichen beugungsbegrenzter Mikroskopie 14,15 verbessert. Kleines Kolokalisation von Autophagosomen und Lysosomen (3B, durch Pfeile angedeutet) waren deutlich sichtbar mit Super-Resolution Mikroskopie, während sie kaum erkennbar mit herkömmlichen Fluoreszenz-Bildgebung waren.

Einer der Vorteile der Verwendung von Dekonvolution Mikroskopie ist es, alle Bilder in einem 3D-Modell, das eine genauere räumliche Informationen zwischen verschiedenen Molekülen offenbaren wird rekonstruieren. Film 1 zeigt ein Gesamtbild einer CWR22 Rv1 Zelle undergoing Autophagie zu einem späteren Zeitpunkt, wo erhebliche Menge an Kolokalisation zwischen Autophagosom und Lysosomen beginnen auftreten. Die E-Cadherin-Färbung (wie in weißer Farbe angezeigt) zeigt den Umriss der Zielzelle. In Movie 2 stellt die rekonstruierten 3D-Modell mehr räumliche Details der Fusion zwischen Autophagosomen und Lysosomen (wie in gelber Farbe angezeigt). Wir können deutlich sehen, die Interaktion zwischen grünen und roten Signalen LC3 Lysosome Signale und der Zusammenführung der beiden Signale auf Gelb zu erzeugen.

Abbildung 1
Abbildung 1. Zeitraffer-Bilder von CWR22 Rv1 Zellen mit ADI behandelt. Bildsequenz zeigt CWR22 Rv1 Zellen mit ADI-Wert für 80 min behandelt. (2D-Bilder von Original Bildstapeln durch maximale Z Projektion erhalten). Die whITE gestrichelte Linie stellt die Kontur der Zelle, und das Licht-schattierten Region stellt die Position des Kerns.

Abbildung 2
Abbildung 2. Statistische Analyse. Statistische Trends wurden durch die Analyse der Bildfolge in Abbildung 1 als eine Demonstration, dass die Bilddaten quantifizierbar ist gezeigt extrahiert. Klicken Sie hier, um eine größere Abbildung anzuzeigen .

Abbildung 3
Abbildung 3. Autophagosom und Lysosom Verteilung in der Zelle. A. Top) Side-by-Side Vergleich der Bilder erworben und rekonstruiert im DV-Modus (simulierte Weitfeld Entfaltung, links) und strukturierter Beleuchtung Modus mit der OMX Mikroskop (rechts). Maßstab Balken repräsentiert 5 um. B. Bottom) Kleines Kolokalisation von Autophagosomen und Lysosomen (durch Pfeile angedeutet).

Film 1 und Film 2. 3D-Rekonstruktion von CWR22 Rv1 Handy Undergoing Autophagy. Dieser Film zeigt einen normalen Autophagie Induktion nach ADI Behandlung. Z-Stapel Bilder wurden in einem 3-dimensionalen Modell rekonstruiert. Dieser Film wurde durch Drehen der Zelle 360 ​​° horizontal und 360 ° vertikal generiert. Grünes Signal für LC3, rotes Signal Lysosom darstellt, weiß E-Cadherin-Signal und Blau repräsentiert den Kern. Klicken Sie hier, um Film 1 ansehen oder= "_blank"> Klicken Sie hier, um die Movie 2 anzuzeigen.

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Discussion

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Während die direkte Beobachtung von Zellen mit fluoreszierenden Sonden gegen LC3 beschriftet wird weithin als Standard-Methode, um autophagic Antwort 6, quantitative 3D-Bildgebung des gleichen Systems (wie wir getan haben) bietet beispiellose Informationen und Details über den komplexen Prozess der zellulären Autophagie bestätigen akzeptiert . Insbesondere beobachten wir, dass Hunderte (wenn nicht Tausende) von Autophagosomen in lebenden Zellen innerhalb von 80 min Induktion der Autophagie gebildet werden. Ebenso beobachten wir sehr interessante morphologische Veränderungen in der Verteilung der lysosomalen Kompartimenten während Autophagie Induktion. Innerhalb einer Zelle, schlagen die Abnahme Autophagosom Nummer und die entsprechende Erhöhung in ihre durchschnittliche Größe im Laufe der Zeit, dass Autophagosomen größer werden durch Verschmelzen miteinander, vor dem Kombinieren mit Lysosomen zu bilden autolysosomes. Hochauflösende 3D-Fluoreszenz-Imaging lebender Zellen ermöglicht es uns zu untersuchen, ob Autophagosomen muss eine kritische Größe zu erreichen vore Verschmelzung mit Lysosomen, oder ob Autophagie kann einfach gehen bei einem kleineren physikalischen Größe. In der Tat, die Zahl der sehr kleinen Autophagosomen, die auf eine frühe Aktivierung nur an der Auflösungsgrenze des Mikroskops erscheinen Entfaltung gegeben und sehr viel deutlicher an der OMX-strukturierte Beleuchtung Mikroskop 13 gelöst, kann es der Fall sein, dass der Großteil der autophagic Tätigkeit tatsächlich tritt auf dieser Ebene.

Die Möglichkeit, lebende Zellen im Verlauf der autophagy überwachen ist von entscheidender Bedeutung, da die Veränderungen in der Anzahl und Größe der autophagosomes in einer gegebenen Zelle klein sein kann, relativ zu den Variationen dieser Parameter von Zelle zu Zelle. Durch das Studium eine einzige lebende Zelle im Laufe der Zeit - wir können mehr sicher sein, dass die morphologischen Veränderungen, die wir beobachten aufgrund experimentellen Bedingungen, anstatt statistische Varianz sind.

Schließlich mit spezifischen molekularen Markern können wir wenden diese bildgebenden Verfahren, um das Studiumfrühen Bildung Autophagosomen, um den Ursprung für die autophagosomalen Membranen zu verfolgen und mögliche Organellen und / oder intrazellulären Komponenten, die speziell in Autophagosomen während Autophagie Induktion verschlungen zu identifizieren. Wir hoffen auch, dass dieser Ansatz wird es uns ermöglichen, Rolle der Autophagie in Zell-Überleben und Zelltod zu untersuchen und besser zu charakterisieren, die Auswirkungen von potenziellen Wirkstoffen und Inhibitoren auf Autophagie.

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Disclosures

Keine Interessenskonflikte erklärt.

Acknowledgments

Zuschüsse: NIH CA165263, CA150197 NIH, NIH CA150197S1 (HJ Kung), NIH CA150197S1 (CA Changou), NSF PHY-0120999 Zentrum für Biophotonik Science & Technology (DL Wolfson, FYS Chuang), DOD PC073420 (RJ Bold), das Forschungszentrum Council of Norway, Leiv Eiriksson Reisestipendium 209286/F11 (BS Ahluwalia). HJ Kung erkennt auch die Unterstützung der Gemeinschaft Auburn Cancer Endowment Fund. RJ Bold erkennt auch die Unterstützung der J. McDonald Stiftung.

Wir danken Dr. Jenny Wei-Jen Kung und Dr. Bor-wen Wu bei DesigneRx für die großzügige Bereitstellung von ADI.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Arginine Deiminase (ADI) DesigneRx
HEPES Sigma H4034
Casein Sigma C5890
Paraformaldehyde Fisher 4042
Saponin Sigma S4521
Alexa anti-mouse 555 Invitrogen A21422
Alexa anti-rabbit 647 Invitrogen A21244
LysoTracker Red DND-99 Invitrogen L7528
anti-Lamp1 DSHB H4A3
anti-Cadherin Cell Signaling #3195
SlowFade Gold Invitrogen S36936
35 mm poly-d-lysine coated glass bottom plate MatTek P35GC-1.5-1.4-C
No.1, 22 mm coverslip Corning #2865-22
Microscope slides Globe Scientific 1324G

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References

  1. Kim, R. H., Coates, J. M., Bowles, T. L., McNerney, G. P., Sutcliffe, J., Jung, J. U., Gandour-Edwards, R., Chuang, F. Y., Bold, R. J., Kung, H. J. Arginine deiminase as a novel therapy for prostate cancer induces autophagy and caspase-independent apoptosis. Cancer Res. 69, (2), 700-708 (2009).
  2. Miyazaki, K., Takaku, H., Umeda, M., et al. Potent growth inhibition of human tumor cells in culture by arginine deiminase purified from a culture medium of a Mycoplasma-infected cell line. Cancer Res. 50, 4522-4527 (1990).
  3. Takaku, H., Matsumoto, M., Misawa, S., Miyazaki, K. Anti-tumor activity of arginine deiminase from Mycoplasma argini and its growth-inhibitory mechanism. Jpn. J. Cancer Res. 86, 840-846 (1995).
  4. Levine, B., Klionsky, D. J. Development by self-digestion: molecular mechanisms and biological functions of autophagy. Dev. Cell. 6, 463-477 (2004).
  5. Mizushima, N., Levine, B., Cuervo, A. M., Klionsky, D. J. Autophagy fights disease through cellular self-digestion. Nature. 451, 1069-1075 (2008).
  6. Kabeya, Y., Mizushima, N., Ueno, T. LC3, a mammalian homologue of yeast Apg8p, is localized in autophagosome membranes after processing. EMBO J. 19, 5720-5728 (2000).
  7. Pattingre, S., Espert, L., Biard-Piechaczyk, M., Codogno, P. Regulation of macroautophagy by mTOR and Beclin 1 complexes. Biochimie. 90, 313-323 (2008).
  8. Maiuri, M. C., Criollo, A., Tasdemir, E., et al. BH3-only proteins and BH3mimetics induce autophagy by competitively disrupting the interaction between Beclin 1 and Bcl-2/Bcl-X(L). Autophagy. 3, 374-376 (2007).
  9. Crighton, D., Wilkinson, S., O'Prey, J., et al. DRAM, a p53-induced modulator of autophagy, is critical for apoptosis. Cell. 126, 121-134 (2008).
  10. Dillon, B. J., Prieto, V. G., Curley, S. A., et al. Incidence and distribution of argininosuccinate synthetase deficiency in human cancers: a method for identifying cancers sensitive to arginine deprivation. Cancer. 100, 826-833 (2004).
  11. Dale, B. M., McNerney, G. P., Thompson, D. L., et al. Cell-to-cell transfer of HIV-1 via virological synapses leads to endosomal virion maturation that activates viral membrane fusion. Cell Host & Microbe. 10, (6), 551-562 (2011).
  12. Cogger, V. C., McNerney, G. P., Nyunt, T., et al. Three-dimensional structured illumination microscopy of liver sinusoidal endothelial cell fenestrations. J. Struct. Biol. 171, (3), 382-388 (2010).
  13. York, A. G., Parekh, S. H., Nogare, D. D., et al. Resolution doubling in live, multicellular organisms via multifocal structured illumination microscopy. Nat. Methods. 9, (7), 749-754 (2012).
  14. Gustafsson, M. G. L. Surpassing the lateral resolution limit by factor of two using structured illumination microscopy. Journal of Microscopy. 198, 82-87 (2000).
  15. Shao, L., Kner, P., Rego, E. H., Gustaffson, M. G. Super-resolution 3D microscopy of live whole cells using structured illumination. Nat. Method. 8, (12), 1044-1046 (2011).
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Changou, C. A., Wolfson, D. L., Ahluwalia, B. S., Bold, R. J., Kung, H. J., Chuang, F. Y. S. Quantitative Analysis of Autophagy using Advanced 3D Fluorescence Microscopy. J. Vis. Exp. (75), e50047, doi:10.3791/50047 (2013).More

Changou, C. A., Wolfson, D. L., Ahluwalia, B. S., Bold, R. J., Kung, H. J., Chuang, F. Y. S. Quantitative Analysis of Autophagy using Advanced 3D Fluorescence Microscopy. J. Vis. Exp. (75), e50047, doi:10.3791/50047 (2013).

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