Summary
オートファジーは、細胞がタンパク質や細胞小器官が低下し、リサイクルを可能にするユビキタスプロセスです。我々はautolysosomesに小さいが、オートファゴソームとリソソームの形成と流通を含むオートファジーの誘導に関連付けられている本質的な、物理的な変化、およびそれらの融合を可視化し、定量化するための高度な蛍光顕微鏡を適用します。
Abstract
手術はインポテンスや失禁の重大なリスクを運ぶ一方、前立腺がんは米国の男性の間で悪性腫瘍の主要な形式であり、従来の化学療法のアプローチは主に成功していない。ホルモン療法は、早期に有効であるが、多くの場合、ホルモン不応性腫瘍の最終的な開発に失敗する。我々は、腫瘍細胞の特異的な代謝不足を標的治療薬の開発に興味を持ってきた。我々は、最近、前立腺腫瘍細胞を特異的アミノ酸アルギニン1の合成に関与する酵素（アルギニノコハク酸シンターゼ、またはASS）を欠いていることを示した。この条件は、外因性アルギニンに依存するようになるために腫瘍細胞を生じ、遊離アルギニンはアルギニンデイミナーゼ（ADI）1,10でなくなった時点で、彼らは、代謝ストレスを受ける。実際、我々は、ヒト前立腺癌細胞を効果的にCWR22 Rv1のカスパーゼ非依存性アポトーシスおよび積極的なautophaでADIによって殺されていることが示されているGY（またはマクロオートファジー ）1,2,3。オートファジーは、細胞が4,5栄養飢餓時のリソソーム分解により不要なタンパク質を代謝することができます進化的に保存されたプロセスである。この経路の必須成分は、6,7,8,9十分に特徴付けられているが、分子機構の多くの側面は、まだ不明である-特に、ADI処理後の前立腺癌細胞の死応答におけるファジーの役割は何か？この問題に対処するために、我々は細胞内のオートファジー応答のレベルと範囲を測定するための実験方法を必要とし - そして、正確に、このプロセスを追跡することができます知られて分子マーカーが存在しないので、我々が使用して、イメージングベースのアプローチを開発することを選んだん定量的な3D蛍光顕微鏡11,12。
オートファゴソームとリソソームのための蛍光プローブと特異的に標識CWR22Rv1細胞を使用して、我々は3次元画像スタックがWiどちらで取得することを示すdefieldデコンボリューション顕微鏡（以降では、超解像と、構造化照明顕微鏡）が明らかにオートファジー誘導の初期段階をキャプチャすることができます。市販のデジタル画像解析アプリケーションにより、我々は容易にオートファゴソームとリソソーム数、大きさ、分布、および任意の画像化された細胞からの共局在化の程度に関する統計情報を取得することができます。この情報は、私たちは正確に生細胞におけるオートファジーの進行状況を追跡することを可能にし、癌化学療法におけるオートファジーの役割への当社の継続的な調査を可能にします。
Protocol
1。パート1：細胞培養および免疫蛍光標識
- 10％ウシ胎児血清（FBS）および1％ペニシリン/ストレプトマイシン/グルタミンを含有するRPMI（メディアテック、VA）を6ウェルプレートに配置されたガラスカバースリップ（＃1.5、または170ミクロンの厚さ）にCWR22 Rv1ないヒト前立腺腫瘍細胞を成長させる。
- リン酸緩衝食塩水（PBS）中のアルギニンデイミナーゼ（ADI、0.3μgの/ ml）で選択されたサンプルを処理することによってオートファジー誘導する。
- カバースリップあたり100μlを、室温で10分間、PBSで希釈し、4％パラホルムアルデヒド（PFA、フィッシャーサイエンティフィック、NH）で細胞を固定します。
- 1ミリリットルHBS / BSAで3回細胞を洗浄。
- 室温で15分間HEPES（HBS）/ BSA、カバースリップあたり100μL、0.05％サポニン（シグマ、MO）で細胞を透過性。
- 以前は免疫標識、HBS / BSA、カバースリップあたり100μlの、で2.5％カゼイン（シグマ、MO）と室温で1時間ブロックサンプルに。
- 2.5％カゼイン/ HBS / BSA、coversl当たり100μlの希釈した一次抗体を用いて固定した細胞をインキュベート4でIP、O / N°C.
- 1ミリリットルHBS / BSAで3回細胞を洗浄。
- 室温で1時間、2.5％カゼイン/ HBS / BSA、カバースリップあたり100μlの希釈二次抗体と固定された細胞をインキュベートする。
- 1ミリリットルHBS / BSAで3回細胞を洗浄。
- 4を含むSlowFadeゴールドまたは延長Gold退色防止試薬（Invitrogen社、CA） '、6 - ジアミジノ-2 - フェニルインドール（DAPI）との定期的なガラス顕微鏡スライド上に準備されたカバースリップをマウントします。
- マニキュアでカバースリップの端をシールします。最高のイメージングの結果を得るためには、徹底的に細胞に浸透し、アンチフェードメディアのための時間を（理想的には、O / N）を許可。
- メタノールおよび/またはクロロホルムでカバースリップの表面を清掃してください。
- 60X 1.42 NAの対物レンズ（オリンパス、日本）に浸油（屈折率1.520で37イメージング°C、または1.516室温でイメージング）を追加します。
- 位置は、顕微鏡ステージ上のスライドと目的の細胞に焦点を確立します。
2。パート2：ライブイメージングのための準備の細胞
- CWRを育てる10％を35ミリメートルにFBSと1％抗生物質ポリ-D-リジンコーティングガラスボトム文化皿（マテック、マサチューセッツ州）を含むRPMI培地中で緑色蛍光タンパク質共役型軽鎖3（LC3-GFP）を発現する22 Rv1ない細胞。細胞は、急速な普及を促進するために十分な密度でプレーティングではなく、そんなに細胞が生い茂ったと撮影時で凝集していること。すべきである
- PBS中ADI（0.3μgの/ ml）で選択された細胞サンプルを扱う。
- イメージングの前に約1時間は、20ミリリットルRPMIでLysoTrackerレッドDND-99の1.5液（Invitrogen社、CA）を希釈してください。 10％FBSおよび1％抗生物質を含む。選択された試料についてのADIを含む溶液を使用してください。 °Cの前培養皿に追加する37にすべてのメディアを温める。
- RPMI、37℃で15-45分間LysoTrackerレッドDND-99を含有する細胞をインキュベート
- イメージングの前に約30分で、ウェザーステーション環境エンクロージャをオンにして37に平衡化させ℃、5％CO 2（humidifとIED空気）。
- PBSで細胞を洗浄し、標準RPMIだけ10％FBS、1％の抗生物質を含有する培地を交換してください。示されるように、サンプルにADIを追加します。
- マウント35ミリメートルは、カバーガラス底培養カスタマイズアダプター（プレシジョン社、WAを応用）で料理し、顕微鏡ステージ上の位置。 60X 1.42 NA対物レンズにイマージョンオイル（屈折率1.520）を使用して、ステージ上にマウントされた培養皿を置く。
3。パート3：デコンボリューション顕微鏡と分析
このセクションのプロトコルがDeltaVision個人DVデコンボリューション顕微鏡と関連SoftWorXアプリケーションスイート（アプライドプレシジョン社、WA）の使用を前提としています。
- 取得ワークステーションと機器コントローラを含む、顕微鏡システムの電源をオンにします。顕微鏡のステージを初期化し、キセノン光源をオンにするResolve3Dアプリケーションを開きます。光源のための10分のウォームアップと安定した状態に到達することができます。
- 加える液浸油滴60X 1.42 NAの対物レンズと、対物レンズを介して中央のスライド標本（下カバーガラス面）上の（37でのライブサンプルに対する屈折率1.520°Cまたは室温で固定したサンプルに対して1.516）。
- 液浸オイルのビードが反転カバーガラスに接触するまでのどちらか明視野または外部照明と粗ピント調整ノブを使って、ゆっくりと対物レンズを上げる。 （この時点から、細胞層はファインフォーカスノブを調整してから数ターン内で焦点に来る必要があります）。スライド上に固定された試料を用いて作業を行う場合、それは泡で、任意の領域内またはその付近の細胞を避けることをお勧めします。ガラスボトムディッシュライブサンプルを表示しているときに、ガラスカバースリップの境界の外側に対物レンズを移動させることは避けてください。
- オートファゴソームがeGFPの信号（緑）によって識別することができます。リソソームはLysoTracker赤（ライブサンプル）または抗ランプ1蛍光抗体（固定サンプル）によって識別されます。細胞核をDAPI第によって識別されるaining（固定サンプル）。
- 所望の視野を選択します。理想的には、細胞は、すべての適切なチャネルで良い蛍光シグナルを示すべきであり、十分に取り付けられており、細胞内の内容が可視化しやすいように、カバーガラス表面上に広がる。横方向のx、y、およびz焦点の微調整をAcquire3Dインタフェースを用いてコンピュータによって制御することができる。表示の目的のフィールド（複数のセルがビニング2x2のに設定されている分野で見ることができます）に応じて、1x1のまたは2x2のにビニングを設定します。
- セルの中央部を介して与えられた画像については、最大ピクセル強度は3,000カウントを超えないように露光パラメータ（ 例えばパーセント送信電力と露光時間）を設定する。一般に、％透過率が1秒にわたって対応する露光時間を上昇させることなく、可能な限り低く設定する必要がある。最高品質の画像を得るために撮像される毎に蛍光色のために、ビューの各個別分野について、この手順を繰り返します。
- Uを設定するそれぞれ、細胞試料の頂部および底部上でわずかにフォーカスを調整することにより、ZスタックのPPERと下限。所与のZスタック内の画像の総数は、このように、これらの制限によって、層（：0.2μmのデフォルト値）の間隔によって決定される。
- 画像取得時のモーションアーチファクトを最小限に抑えるために、我々は、固定された試料についての "その後波長zスタック"、および "次にzスタック波長"ライブサンプルのために画像取得モードを設定することをお勧めします。
- 蛍光画像をSoftWorX（アプライドプレシジョン、WA）を使用して、デコンボリューションおよびそれ以降（パーキンエルマー、MA今、Improvision）VoloCITYを用いて分析している。
4。パート4：超解像、構造化照明（OMX）顕微鏡
このセクションのプロトコルは、OMX構造化照明顕微鏡の使用（アプライドプレシジョン、WA）に適用されます。
- 主電源と希望レーザー（410 nmで、488 nmであり、および/または532 nm）をスイッチオン。 20マイルを待つnは熱的に安定するレーザー用。
- 60X 1.42 NA対物レンズにイマージョンオイル（室温で固定したサンプルのための屈折率1.516）を追加します。気泡が油滴で見ている場合は、目的をきれいにし、再びオイルを追加。
- ステージ上で、必要に応じてサンプルスライドを置き、細胞のための10分でカバースリップに落ち着くことができます。
- 取得プログラムを初期化します。セルのシャープな輪郭を見ることができるまでフォーカスを調整する蛍光照明を使用してください。 （注意が実際の画像取得まで、蛍光励起への細胞の曝露を最小限にするため、すべての回で取られるべきである）。
- 螺旋モザイクスキャンは、目的の細胞または領域を選択するために試料のより大きな領域をプレビューする得ることができる。これは、試料をスキャンや目標を見つけながら、短い露光時間（1-10ミリ秒）と低励起パワー（0.1から1パーセント透過）を使用することをお勧めします。
- GFP-LC3の蛍光によってオートファゴソームを識別します。アレクサフルーア555抗LAMPによるリソソームを識別（リソソーム関連膜タンパク質）およびDAPI（固定サンプル）を用いて細胞核。
- 励起波長、画像領域（ 例えば 512×512）、スタックの厚さは、露光時間、およびレーザー透過率を含む実験条件を選択してください。スーパー解決画像では、構造化照明オプションが有効になっていることを確認。 OMX上のデコンボリューション顕微鏡は、従来の照明オプションを選択します。
- 最高の復興の結果を得るには、最大強度のカウントが取得中10,000と15,000の間にあるような実験条件を選択します。光退色が問題になる場合、低い露光（5,000〜10,000カウント）での画像化を用いることができる。理想的には、カウントが全体取得中に2倍以上に減少させるべきではなく、4倍以上低下は避けるべきである。必要であれば、持続的な強度カウントを確保するために、スタックの厚さを減少させる。カメラがでそう最大、64,000カウントで飽和tensityは、これを超えてはなりません。良いサンプルについては、我々は、1％のレーザー伝送と10なるように実験条件〜50ミリ秒の露光時間を見つけました。繰り返し撮像することができる明るく、光安定試料が好ましい。安定した汚れは、時間経過、スーパー解決画像のために必要です。
- 2ミリ秒以上のノイズ、95MHzの読み出し速度（中速·オプション）、取得時間を短縮することをお勧めします。サンプルが取得中に移動したときに増加したアーティファクトは、再構築された画像形成さで得られる。この影響により、短期のエクスポージャーは非接着や動きの速い細胞をお勧めします。
- マルチチャネル画像化は、同時にまたは連続して行うことができる。シーケンシャルモード利回り少ないクロストークとは、このようにお勧めします。
- 退色軽減するために、それは一般的に最初の長い励起波長（532 nmで、488 nmであり、その後410 nm）を用いて画像をお勧めします。しかし、 図3に示す実験結果を得るために、この順序は逆であったこの特定のサンプルの光安定のためにD（ すなわち 48 nmで、532 nmおよび410 nm）を。
- 細胞のトップ/ボトムが出てピントが少しになるまで、顕微鏡のステージを移動することにより、Z-スタックの上限/下限を設定します。復興ソフトウェアはデフォルトとして、この値を取るように各画像間の所望の距離は、超解像イメージングのための0.125程度で一定に保持されるべきである。
- SoftWorX（アプライドプレシジョン、WA）を用いた画像スタックを再構築VoloCITY 6.0（パーキンエルマー、MA）を使用して分析する。
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Representative Results
図1に示す画像シーケンスは、ファジー誘導の最初の80分間にCWR22細胞内で発生する物理的変化を示している。これと他の研究（図示せず）で、我々は一貫して観察された：核の（1）の変位距離、セル中心から、接着斑点の（2）の削減、およびの中心に向かってオートファゴソームとリソソームの（3）一般的な転セル。さらに、我々はまた、後の時点において、オートファゴ（緑）、リソソーム（赤）との間の共局在のわずかな増加（黄色で表示）を観察した。
画像ベースのサイトメトリーのデモンストレーションとして、我々は、特定数えて、CWR22細胞の画像でラベルオートファゴソームとリソソームの統計データを収集するためにVoloCITYデジタルイメージングアプリケーションスイート（バージョン6.0、Improvision /パーキンエルマー）を用いたに示す図1。図2のグラフで示すように、tの数と大きさ彼はオートファゴソーム（彼らの初期形成と出現後）時間とともに変化ない：オートファジー誘導の80分後に、オートファゴソームの平均サイズの増加に対応したオートファゴソームの数（ 図2A）（徐々にですが純減があった図2B）。また、ピアソンの相関係数の分析（ 図2C）に基づいてオートファゴソームとリソソームの局在における測定可能な増加がありました。一緒に、これらの知見は、オートファジーの刺激により、多数の小さなオートファゴソームの時間（ 図2D）を介して大規模なオートファゴソームを形成するために融合していることが示唆された。 図1および図2は 、単一の撮像試験の結果を反映し、より厳密な定量的な分析を確固たる結論を引き出すために必要とされるが、それは定量的な蛍光顕微鏡の特徴および利点を例示しました。我々は積極的にOUにこのテクニックを使用しているrは、細胞オートファジーの分子機構とプロセスの調査を継続する。
図3Aは、DVモード（シミュレートされた広視野デコンボリューション、左）とOMX顕微鏡（右）を用いて構造化照明モードで取得され、再構成画像を並べて比較を示す。横方向の分解能は120 nmであり、従来の回折限界顕微鏡14,15の二倍の解像度にまで改善された。彼らは、従来の蛍光イメージングではほとんど明らかであったのに対し、オートファゴソームとリソソームの小規模共局在は（ 図3B、矢印で示される）、超解像顕微鏡ではっきりと明らかであった。
デコンボリューション顕微鏡を使用する利点の1つは、異なる分子間のより正確な空間情報を明らかにする3次元モデルにすべての画像を再構成することである。 ムービー1は、CWR22 Rv1ないセルundergoiの全体像を示している後でポイント、オートファゴソームとリソソーム間共局在のかなりの量が発生し始めるでNGのオートファジー。 E-カドヘリン染色は、（白色で示されている）標的細胞の輪郭を明らかにする。 作品2では、3D再構成モデルは、オートファゴソームとリソソームの融合（黄色で示されているように）より多くの空間的な詳細を提供します。我々は明らかに緑色LC3信号と赤のリソソーム信号間の相互作用を見ることができ、2つの信号のマージは黄色の信号を生成する。
図1。 ADIで処理CWR22 Rv1ない細胞のタイムラプス画像80分間ADIで処理CWR22 Rv1ない細胞を示す画像シーケンス。 （最大Z投影して、元の画像スタックから得られた2D画像）。 WH映像情報メディア学会点線は、細胞の輪郭を示し、光遮光領域は、核の位置を表す。
図2。統計分析。統計的な傾向は、画像データが定量可能であることを実証として、図1に示す画像シーケンスを解析することにより抽出した。 より大きい数字を表示するにはここをクリック 。
図3。セル。A.におけるオートファゴソームとリソソーム分布トップ）サイドバイサイド取得しOMX顕微鏡（右）を使用して、DVモード（シミュレートされた広視野デコンボリューション、左）と構造化照明モードで再構成画像の比較。スケールバーは5μm程度を表しています。B.はボトム）オートファゴソームとリソソームの小規模共局在（矢印で示される）。
ムービー1とムービー2。オートファジーを受けCWR22 Rv1ないセルの3次元再構築。この映画は、ADI処理後の通常のオートファジーの誘導を示しています。 Z-スタック画像は、3次元モデルに再構成した。この映画は、セル°水平360°垂直360を回転させることによって生成されました。グリーンシグナルがLC3、赤信号がリソソーム表し、白信号は、E-カドヘリンを表し、青の信号が核を表しています。 ムービー1を見るにはここをクリックしたり、= "_blank">ムービー2を表示するには、ここをクリックしてください。
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Discussion
LC3に対する蛍光プローブで標識された細胞の直接観察が広くオートファジー応答6を確認するための標準的な方法として認められているが、定量的な3D同じシステムのイメージング（私たちが行ったように）、細胞オートファジーの複雑なプロセスについて前例のない情報と詳細を提供。特に、我々は、生細胞におけるオートファゴソームの数百（そうでなければ数千）オートファジー誘導の80分内に形成されることを確認します。同様に、私たちは、オートファジーの誘導中にリソソームコンパートメントの分布に非常に興味深い形態学的変化を観察します。与えられたセル、オートファゴソーム数の減少と時間をかけて彼らの平均サイズの増加に対応の中では、autolysosomesを形成するために、リソソームと組み合わせる前に、オートファゴソームが互いに融合によって大きくなることを示唆している。生きた細胞の高解像度の3D蛍光イメージングは、オートファゴソームが臨界サイズの血友病に達しなければならないかどうかを調査することを可能にeはリソソームと融合、またはオートファジーが小さく物理的なサイズで簡単に進めることができるかどうか。確かに、単にデコンボリューション顕微鏡の解像限界で早期に活性化の際に表示される非常に小さなオートファゴソームの数を与えられた、とはるかに明確OMX構造化照明顕微鏡13で解決され、それは実際にオートファジーの活性バルク、事実であるかもしれませんこのレベルで行われます。
所与のセルにおけるオートファゴの数とサイズの変更が細胞から細胞へのこれらのパラメータの変化に対して、小さくすることができるようにファジーの過程で生細胞を監視する能力は、非常に重要である。時間をかけて、単一の、生きている細胞を研究することによって、 - 我々は我々が観察することを形態学的変化は、実験条件ではなく、統計的な差異によるものであることを、より確信することができます。
最後に、特定の分子マーカーで、我々は勉強するために、これらのイメージング技術を適用することができますオートファゴソームの早期形成、オートファゴソーム膜の起源をトレースするには、具体的には、オートファジーの誘導中にオートファゴソームに包まれている可能性小器官および/または細胞内のコンポーネントを識別する。また、このアプローチは、私たちは、細胞生存と細胞死にオートファジーの役割を調査し、より良い潜在薬やオートファジーに対する阻害剤の影響を特徴づけることができるようになりますことを願っています。
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Disclosures
利害の衝突は宣言されていない。
Acknowledgments
グラントサポート：NIH CA165263、NIH CA150197、NIH CA150197S1（HJクン）、NIH CA150197S1（CA Changou）、NSF PHY-0120999 バイオフォトニクス科学技術 （DLウォルフソン、FYS荘）、DOD PC073420（RJ太字）、研究センターノルウェーの評議会、Leivエリクソントラベルグラント209286/F11（BSアルワリア）。 HJクンもオーバーンコミュニティがん基金基金の支援を認めるものです。 RJ太字またJ.マクドナルド寄付の支援を認めるものです。
私たちは、ADIの寛大な供給のためDesigneRx博士ジェニー魏ジェンクン博士とボル·ウェンウーに感謝します。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Arginine Deiminase (ADI) | DesigneRx | ||
| HEPES | Sigma | H4034 | |
| Casein | Sigma | C5890 | |
| Paraformaldehyde | Fisher | 4042 | |
| Saponin | Sigma | S4521 | |
| Alexa anti-mouse 555 | Invitrogen | A21422 | |
| Alexa anti-rabbit 647 | Invitrogen | A21244 | |
| LysoTracker Red DND-99 | Invitrogen | L7528 | |
| anti-Lamp1 | DSHB | H4A3 | |
| anti-Cadherin | Cell Signaling | #3195 | |
| SlowFade Gold | Invitrogen | S36936 | |
| 35 mm poly-d-lysine coated glass bottom plate | MatTek | P35GC-1.5-1.4-C | |
| No.1, 22 mm coverslip | Corning | #2865-22 | |
| Microscope slides | Globe Scientific | 1324G |
References
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