Summary
Der Comet Assay ist ein effizientes Mittel zur Feststellung von Einzel-und Doppelstrang-Brüche, einschließlich Alkali-labile Websites und DNA-DNA/DNA-protein Cross-Links auf der DNA in allen Zellen, einschließlich Neuronen im Hippocampus. Die Methode nimmt den Vorteil dieser differentielle Migration von DNA in einem elektrischen Feld aufgrund von Unterschieden in Menge an DNA-Schäden.
Abstract
Eine Reihe von Medikamenten gezielt die DNA Reparaturmechanismen und induzieren Zelle, indem sie DNA-Schäden zu töten. So wurden Prozesse direkt zu messen DNA-Schäden wurde ausgiebig evaluiert. Herkömmliche Methoden sind zeitaufwendig, teuer und erfordern ressourcenintensiv replizierende Zellen. Im Gegensatz dazu ist die Comet-Assay, eine einzelne Zelle Gelelektrophorese-Assay, ein schneller, nicht-invasiven, kostengünstigen, direkt und empfindliches Maß von DNA-Schäden und Reparatur. Alle Formen von DNA-Schäden sowie DNA-Reparatur kann an der einzelnen Zelle mit diesem leistungsstarken Technik visualisiert werden.
Das Prinzip des Comet Assay ist, dass intakte DNA ist hoch geordnete wohingegen DNA Schädigung unterbricht diese Organisation. Die beschädigten DNA sickert in der Agarose-Matrix und, wenn sie einem elektrischen Feld ausgesetzt wird, wandert der negativ geladenen DNA zur Kathode, das positiv geladen ist. Die großen unbeschädigten DNA-Stränge sind nicht in der Lage zu weit vom Kern migrieren. DNA-Schädenentstehen kleinere DNA-Fragmente, die weiter als die intakte DNA reisen. Kometentest eine Bildanalyse-Software, misst und vergleicht die gesamte Fluoreszenzintensität der DNA im Zellkern mit DNA, die aus dem Nukleus migriert ist. Fluoreszenzsignal aus der migrierten DNA ist proportional zur DNA-Schäden. Längere heller DNA tail bedeutet erhöhte DNA-Schäden. Einige der Parameter, die gemessen werden Leitwerksmoment die ein Maß für sowohl der Menge an DNA und Verteilung der DNA im Schwanz, Schwanzlänge und Prozentsatz der DNA in dem Endstück ist. Dieser Test ermöglicht es, DNA-Reparatur als auch messen, da Auflösung von DNA-Schäden bezeichnet Reparatur stattgefunden hat. Die Grenze der Empfindlichkeit liegt bei etwa 50 Strangbrüche pro diploid Säugetierzellen 1,2. Zellen mit irgendwelchen DNA-schädigende Mittel, wie zum Beispiel Etoposid behandelt wird, kann als eine positive Kontrolle verwendet werden. So ist die Comet-Assay ist eine schnelle und wirksame Verfahren, um DNA-Schäden zu messen.
Protocol
Ein. Cell Culture
- Kultur neuronalen Zellen und behandeln Sie sie nach Bedarf.
- Ernte Zellen in 15 ml Röhrchen: Aspirat Medien, mit Phosphat spülen Kochsalzlösung (PBS, Calcium und Magnesium befreit), fügen Trypsin, sammeln sich in 15 ml Röhrchen und neutralisieren Trypsin mit geeigneten serumhaltigen Medien.
- Spin bei 1.000 xg für 5 min.
- Absaugen Medien.
- Die Zellen in PBS.
- Spin bei 1.000 xg für 5 min.
- Absaugen Medien und resuspendieren Zellen in frischem PBS.
- Zählen von Zellen unter Verwendung eines Hämacytometers oder Ihre bevorzugte Zelle Zähler.
- Zellproben sollte unmittelbar vor Beginn des Tests vorbereitet werden.
- Alle Proben sollten im Dunkeln oder gelbem Licht gehandhabt werden, um DNA-Schäden durch UV-Licht zu verhindern.
2. Comet Assay
Ein. Slide Vorbereitung
- Schmelze 1% Agarose (1 g / 100 ml 1X Tris Base, Borsäure, EDTA, TBE) in einer Mikrowelle für 3 min bis alle Granulate verschwinden.
- Objektträger in das geschmolzene Agarose und Wischen einer Seite mit einer Kimwipe reinigen. Lassen Sie die Agarose an der Luft trocknen, um eine transparente Folie. Dies kann im Voraus und Folien erfolgen kann gespeichert werden.
2. Neutral Comet Assay
- Chill Lyse-Lösung (2,5 M NaCl, 100 mM EDTA, pH 10, 10 mM Tris-Base, 1% Natriumlaurylsarcosinat und 1% Triton X-100, pH 10) bei 4 ° C für mindestens 1 Stunde vor der Verwendung.
- 2.2.2. Melt 1% Agarose mit niedrigem Schmelzpunkt (1 g / 100ml in 1X Tris Base, Borsäure, EDTA) in einer Mikrowelle für 3 min, bis alle Körner verschwinden. Die Agarose muss auf 37 ° C in einem Wasserbad abgekühlt werden, um künstliche Induktion Kometenschweif vermeiden. Idealerweise muß die Agarose eine halbe Stunde vor der Verwendung gekühlt werden.
- 2.2.3. Verdünnen der Zellsuspension, so daß es 100.000 Zellen pro ml sind. Kombinieren der Zellsuspension mit der Agarose mit niedrigem Schmelzpunkt (bei 37 ° C) beiein Verhältnis von 1:10 (v / v), kurz vortexen und sofort pipettieren 50 ul auf die Comet Slide. Verwenden Sie die Seite der Pipettenspitze die Zellsuspension gleichmäßig über den Probenraum. Jede Behandlungsgruppe sollte mindestens in dreifacher Ausfertigung.
- Objektträger flach im Kühlschrank für 30 Minuten, bis ein Kreis erscheint in der Peripherie der Folie.
- Prechill die Lyse-Lösung und tauchen Folien in dieser Lösung für 30 min im Dunkeln bei 4 ° C (oder im Kühlschrank).
- Abgießen oder absaugen die Lyse-Lösung und fügen 1X neutral Elektrophorese-Puffer (Tris-Base, Borsäure, EDTA, 1X TBE). Lassen Sie Folien in diesem Puffer für eine halbe Stunde in den Kühlschrank stellen.
- Fügen vorgekühlte 1X Neutral Electrophoresis Buffer (FSME) in Elektrophoresekammer, die Objektträger in der Elektrophorese Diamagazin. Richten gleitet, so daß sie äquidistant von Elektroden sind.
- Gießen 1X neutral Elektrophoresepuffer bis zu 0,2 Zentimeter über Rutschen. Überschüssiger Puffer wird unterFere mit Elektrophorese.
- Set Stromversorgungsspannung bis 1 V pro cm (gemessen Elektrode zu Elektrode) und führen für 30 min bei 4 ° C (oder der Kühlraum) im Dunkeln.
3. Alkaline Comet Assay
- Chill Lyse-Lösung (2,5 M NaCl, 100 mM EDTA, pH 10, 10 mM Tris-Base, 1% Natriumlaurylsarcosinat und 1% Triton X-100, pH 10) bei 4 ° C für mindestens 1 Stunde vor der Verwendung.
- Melt 1% Agarose mit niedrigem Schmelzpunkt (1 g / 100 ml in 1X Tris Base, Borsäure, EDTA) in einer Mikrowelle für 3 min, bis alle Körner verschwinden. Dann in einem 37 ° C Wasserbad für mindestens 30 min.
- Kombinieren Zellen mit 1 x 105 / ml mit geschmolzenen Agarose mit niedrigem Schmelzpunkt (37 ° C) in einem Verhältnis von 1:10 (v / v), Vortex kurz und unmittelbar pipettieren 50 ul auf das Slide Comet. Verwenden Sie die Seite der Pipettenspitze die Zellsuspension gleichmäßig über den Probenraum. Jede Behandlungsgruppe sollte mindestens in dreifacher Ausfertigung.
- Aufschiebenes flach im Kühlschrank für 30 Minuten, bis ein Kreis erscheint in der Peripherie der Folie.
- Objektträger in vorgekühlte Lyselösung und lassen bei 4 ° C für 1 h bis über Nacht im Dunkeln.
- Die Objektträger aus der Lyselösung, abtropfen die Folien und spülen einmal mit kaltem Neutralisationspuffer für 5 min, um restliches Detergens und Salzen vor der Alkali-Abwickeln Schritt zu entfernen.
- Die Objektträger in eine Gelelektrophorese Kammer mit vorgekühltem frisch zubereiteten Elektrophorese-Puffer (300 mM NaOH, 1 mM EDTA, pH> 13) nicht bis 0,5 cm über Rutschen überschreiten gefüllt. Richten gleitet, so daß sie äquidistant von Elektroden sind.
- Lassen Folien im alkalischen Puffer sitzen für 30 min im Dunkeln zum Abwickeln der DNA und der Expression von Alkali-ersatzpflichtigen ermöglichen.
- Set Stromversorgungsspannung bis 1 V pro cm (gemessen Elektrode zu Elektrode) und führen für 30 min bei 4 ° C (oder der Kühlraum).
4. Befestigungs-und Staining Cells
- Überschüssiges Electrophoresis Buffer
- Objektträger in vorgekühlte destilliertem Wasser für 5 min bei RT.
- Objektträger in vorgekühlte 70% Ethanol 5 min bei RT.
- Dry Proben über Nacht. Setzen Sie Folien helles Licht. Die Proben können für Monate bei Raumtemperatur vor Scoring zu diesem Zeitpunkt gespeichert werden.
- Stain Objektträger durch Eintauchen in Sybr grün (1X in PBS verdünnt) für 20 min in den Kühlschrank stellen.
- Objektträger und ihnen erlauben, vollständig trocknen im Dunkeln. Die Agarose wird transparent, wenn sie vollständig trocken.
4. Bild-Akquisition und Analyse
- Erwerben Sie Bilder mit Fluoreszenzmikroskop auf den grünen Filter (Zeiss AxioVision) und analysieren mit Comet Assay Software (Perceptive Instruments).
- Klicken Sie auf den "Kometen Kopf" (der Kern) und die Software berechnet die Parameter einschließlich der mittleren Schwanz Moment und DNA-Menge in derKern.
- Analysieren mindestens 200 Zellen pro Behandlung.
- Exportieren von Daten in Microsoft Excel.
- Berechnung der mittleren tail moment für jede Behandlungsgruppe und Plot-Daten als angemessen.
5. Repräsentative Ergebnisse
Ein Beispiel für Comet Assay Analyse neuronaler Zellen ist in Abbildung 2 und Abbildung 3 dargestellt. In diesem Fall induziert Bestrahlung der neuronalen Zellen DNA-Schäden. Da die Zellen mit dem elektrischen Feld ausgesetzt werden, wandert die DNA mit unterschiedlichen Geschwindigkeiten aufgrund der Unterschiede in der Größe, die anschließend analysiert wird unter Verwendung des Kometentest Software. Je mehr die DNA-Schäden, je weiter die DNA wandert aus dem Zellkern. Dies verringert die Fluoreszenzintensität in den Zellkern, die anschließend durch den Software und führt zu höheren Leitwerksmoment abgeholt. Tabelle 1 stellt eine Tabelle von repräsentativen Kometenassay Analyse und Abbildung 4 zeigt einen repräsentativentative Graph DNA-Schäden in neuronalen Zellen nach der Bestrahlung durch den Comet Assay gemessen.
Abbildung 1. Ablaufdiagramm des Comet Assay. Klicken Sie hier für eine größere Abbildung zu sehen .
Abbildung 2. Repräsentative Bilder von neuronalen Zellen (A) ohne und (B) mit Kometenschweif.
Abbildung 3. Comet Assay-Analyse mit Comet Assay Software. (A) Repräsentative Schirmschüsse Bild aufgenommen mit Carl Zeiss Fluoreszenzmikroskop und mittels CometAssay Software. (B) Klick auf den Kern oder die "Kometen Kopf" (eingekreist in grün) erzeugt eine fluoreszierende Karte und Grafik (eingekreist in gelb) und eine (C) Datentabelle (rot eingekreist). Klicken Sie hier für eine größere Abbildung zu sehen .
Abbildung 4. Repräsentative Graph durch Auftragen der mittleren Leitwerksmoment durch Analysieren DNA-Schädigung in bestrahlten und unbestrahlten neuronalen Zellen mit neutralen Kometenassay erhalten wird. Wie erwartet, induziert 3Gy Strahlung (Röntgenstrahlen) DNA-Schädigung, wie durch die höhere mittlere Leitwerksmoment in den bestrahlten neuronalen Zellen dargestellt. Dargestellt ist die mittlere tail moment (+ / - Standardfehler), ** P <0,01.
Tabelle 1. Klicken Sie hier für eine größere Abbildung zu sehen .
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Discussion
Der Comet Assay hat die einzigartige Fähigkeit zur Analyse von einzelnen Zellen. Dies ist vorteilhaft bei der Identifizierung von Subpopulationen von Zellen, die differenzielle Reaktion auf zytotoxischen Mitteln demonstrieren. Einige praktische Einschränkungen zu berücksichtigen. Die Anzahl der Zellen, die einzeln ausgewertet werden kann je nach dem Individuum. Der Stichprobenumfang erhöht werden muss, wenn es Varianz in DNA-Schädigung innerhalb einer Population. Lebensfähigen Einzelzell-Suspension ist für diesen Assay seit vorherrschende Gegenwart nekrotischen oder apoptotischen Zellen Irrtum hinzufügt. Die Lyse und Elektrophorese Schritte entledigt apoptotischen Zellen, kleine DNA-Fragmente (kleiner als 50kb), und die mitochondriale DNA. So werden sie nicht durch die Comet Assay 1,3-11 erkannt.
Wie bereits erwähnt, ist der Comet Assay eine effiziente Möglichkeit zur Erfassung Einzel-und Doppel-Strangbrüchen, einschließlich Alkali-labile Websites und DNA-DNA/DNA-protein Querverbindungen auf derDNA. Hier haben wir zwei unterschiedliche Protokolle skizziert: die alkalische Assay erlaubt die Detektion von Einzelstrang Pausen sowie Doppelstrangbrüche, während die neutralen Comet Assay erlaubt nur die Erkennung von Doppelstrangbrüchen. Enzyme modifizierten Comet Assay kann angewendet worden, um oxidative DNA-Addukte zu erkennen. Beispielsweise erkennen Behandlung mit Endo III (Endonuclease) sowie hOGG1 (Glycosylase) pyrimidinen sowie Thymin und Uracil Glycol Glycol 12,13 und 8-Oxo-7 ,8-dihydroguanine (8-oxoGua) 14,15 bzw. oxidiert. Formamidopyrimidin DNA-Glykosylase (FPG) kann in ähnlicher Weise verwendet werden. Aus diesem modifizierten Assay vorangeht die Behandlung mit den Enzymen des Abwickelns Schritt. Die Zugabe von läsionsspezifischen Endonukleasen erhöht die Empfindlichkeit des Kometenassay sowie 13.
Hier verwenden wir tail Moment als den Deskriptor von DNA-Schäden. Tail Moment errechnet sich nach folgender Formel: Prozentsatz der DNA im Schweif durch die len multipliziertgth der Kometenschweif 1,3-7. Die Länge der Kometenschweif (Schwanz) beträgt der Abstand von der Mitte des Kerns, um den entferntesten Punkt der Wanderung der DNA. Kopflänge ist der Durchmesser des Kerns. Leiter Intensität und tail Intensität sind die mittleren Pixelintensitäten im Kopf und Schweif des Kometen sind. Gesamtfläche ist die gesamte Oberfläche des Kometen 1,3-7.
Obwohl es andere Methoden zur Messung von DNA-Schäden, wie γ-H2AX Foci Färbung und Puls-Feld-Gel-Elektrophorese sind, haben diese Tests ihre Nachteile sowie 4,6,11,16,17. Zum Beispiel ist die Replikation Stress oft ein confounder bei der Messung von γ-H2AX Ebenen 18. Da die Bildung von γ-H2AX Foci ist abhängig Rekrutierung von DNA-Reparatur-Proteine, kann zu einem Ausfall der DNA-Reparatur-Proteine und ein kondensiertes Chromatin-Struktur zu rekrutieren falsch niedrige γ-H2AX Foci Ebenen als auch führen. Ebenso Puls-Feld-Gel-electrophoresis ist sehr zeit intensive und ist nur vorteilhaft für Trennung von großen DNA-Molekülen 19,20. Somit ist die Kometenassay eine relativ einfache, effiziente und kostengünstige, direkte und empfindliches Maß von DNA-Schäden und Reparatur 10,11,21.
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Disclosures
Keine Interessenskonflikte erklärt.
Acknowledgments
Diese Arbeit wurde von der IMPACT Award vom Department of Radiation Oncology, University of Alabama-Birmingham Comprehensive Cancer Center, The Fighting Kinderkrebsstiftung und der Gabrielle 's Angel Foundation (zum ESY.) Unterstützt.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1.5 ml tubes | Santa Cruz Biotechnology, Inc | Sc-200271 | |
| 10X TBE (Tris base, boric acid, EDTA) | Fisher Scientific | BP13331 | |
| 15 ml tube | Fisher Scientific | 0553851 | |
| Agarose | Sigma | A5093 | |
| Aluminum foil | Fisher Scientific | 01213101 | |
| Beaker | Fisher Scientific | FB102300 | |
| Centrifuge | Thermo Scientific | 75004261PR | |
| Comet Assay software | Comet Assay IV Image Analysis System | ||
| Cylinder | Fisher Scientific | 08555F | |
| EDTA | GIBCO | 15575 | |
| Electrophoresis chamber | Thermo Scientific | 09528101 | |
| Ethanol | Fisher Scientific | A407P4 | |
| Fluorescent microscope | Zeiss Axio Vision | Any fluorescent microscope with green filter will suffice | |
| Hemacytometer | Fisher Scientific | 0267152 | |
| Low melting point agarose | Promega | V2111 | |
| Microwave | Sears | ||
| Phosphate buffered saline, calcium free, magnesium free | HyClone | SH3025601 | |
| Power supply | BioRad | 1645050 | |
| Refrigerator | Sears | ||
| Ruler | Staples | ||
| Slide | Fisher Scientific | 12550143 | |
| Sodium chloride | Sigma | S7653 | |
| Sodium hydroxide | Sigma | S5881 | |
| Sodium lauryl sarcosinate | Fisher Scientific | S529 | |
| Sybr green | Invitrogen | S7585 | |
| Tray | Fisher Scientific | 15242B | |
| Tris Base | Sigma | T6066 | |
| Triton-X 100 | Sigma | T8787 | |
| Trypsin | HyClone | SH3023601 | |
| Vortex | Fisher Scientific | 02216108 | |
| Water bath | Fisher Scientific | 154622Q |
References
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