Summary
彗星试验是检测单和双链断裂，包括碱不稳定的的网站和DNA-DNA/DNA-protein交联在所有细胞中的DNA，包括海马神经元的一种有效方式。由于DNA损伤的量的差异，在电场中的方法，利用差DNA迁移。
Abstract
一些药物的目标是DNA修复途径，通过建立DNA损伤诱导细胞死亡。因此，直接测量DNA损伤的进程已经得到了广泛的评估。传统的方法是费时的，昂贵的，资源密集型的时间，需要复制的细胞。与此相反，彗星试验，单细胞凝胶电泳法，是更快的，非侵入性，价格低廉，直接和敏感的DNA损伤和修复措施。所有形式的DNA损伤以及DNA修复可以使用这个强大的技术在单细胞水平的可视化。
彗星试验的原则是高度有序的，完整的DNA，而DNA损伤，破坏了这种组织。受损的DNA的琼脂糖基质渗入和电场进行时，带负电荷的DNA是带正电的向阴极迁移。大的未损坏的DNA链是不能够迁移远离原子核。 DNA损伤创建更小的DNA片段更远较完整的DNA。彗星试验检测，图像分析软件，措施和比较的整体在细胞核中的DNA的荧光强度与已迁移出细胞核的DNA。从迁移的DNA的荧光信号是正比于DNA损伤。更长的明亮的DNA尾着增加DNA损伤。某些测量的参数，该参数是尾矩，它是衡量两者的DNA的量和分布在尾部，尾部长度的DNA和DNA的百分比在尾部。此法可以测量DNA修复以及修复已经发生DNA损伤的决议表示。灵敏度的极限是约50的链断裂每二倍体哺乳动物细胞1,2。与任何DNA损伤剂，如鬼臼乙叉甙处理的细胞，也可以使用作为阳性对照。因此，彗星试验是一种快速，有效的方法来衡量DNA损伤。
Protocol
1。细胞培养
- 的文化神经细胞和治疗自己的需要。
- 收获细胞成15毫升管抽吸介质，清洗用磷酸盐缓冲液（PBS，钙和镁免费的），加入胰蛋白酶，收集在15毫升的试管中胰蛋白酶与适当的含药血清媒体。
- 附带在1,000 xg离心5分钟。
- 吸介质。
- 在PBS中重悬细胞。
- 附带在1,000 xg离心5分钟。
- 吸媒体和新鲜的PBS重悬细胞。
- 使用血球计数器或您首选的细胞计数器计数细胞。
- 细胞样品立即开始检测之前，应准备。
- 所有样品应处理在暗或黄色的光，以防止DNA免受紫外线伤害。
2。彗星试验
1。幻灯片准备
- 熔体1％琼脂糖（1克/ 100毫升的1X Tris碱，硼酸，EDTA，结核E）在微波3分钟，直到所有的颗粒消失。
- 熔化的琼脂糖和DIP滑入边擦拭干净与kimwipe。琼脂糖允许空气干燥的透明膜。可以被存储，这是可以做到，预先和幻灯片。
2。中性彗星实验
- 冰寒裂解缓冲液（2.5M氯化钠，100mM的EDTA pH值为10，10mM的Tris碱，1％月桂基肌氨酸钠，和1％Triton X-100，pH为10）在4℃下，在使用之前的至少1小时。
- 2.2.2。熔体1％的低熔点琼脂糖（1克/ 100毫升在1X Tris碱，硼酸，EDTA）在微波炉中3分钟，直至所有的颗粒消失。琼脂糖的需要在水浴中冷却至37℃，以避免人工诱导彗尾。理想的情况下，需要被冷却为半小时后再使用琼脂糖。
- 2.2.3。稀释细胞悬浮液，使每毫升有100,000个细胞。结合与低熔点琼脂糖（在37℃下）的细胞悬浮液的比例为1:10（体积/体积），涡简要，并立即移液50微升到彗星幻灯片。使用移液管尖的侧的细胞悬浮液均匀地传播，在样品区。每个治疗组中应是至少在一式三份。
- 地点滑动平面在冰箱中30分钟，直到出现一个圆形的外周中的幻灯片。
- 预冷的裂解溶液和淹没幻灯片在该溶液中30分钟，在黑暗中在4℃（或在冰箱中）。
- 倒出或吸液的裂解缓冲液，并添加1X中性电泳缓冲液（Tris碱，硼酸，EDTA 1X TBE缓冲液）。留在这个缓冲区在冰箱中半小时的幻灯片。
- 加入预冷1X中性电泳缓冲液（TBE），电泳室，电泳滑动托盘的地方幻灯片。对齐，使它们从电极等距离的幻灯片。
- 1X中性电泳缓冲液倒入0.2英寸以上幻灯片。过量的缓冲区间FERE电泳。
- 将电源电压，以每平方厘米1 V（测量电极，电极），并在4°C（或冷水机房）在黑暗中运行30分钟。
3。碱性彗星试验
- 冰寒裂解缓冲液（2.5M氯化钠，100mM的EDTA pH值为10，10mM的Tris碱，1％月桂基肌氨酸钠，和1％Triton X-100，pH为10）在4℃下，在使用之前的至少1小时。
- 熔体1％低熔点琼脂糖（1克/ 100毫升在1X Tris碱，硼酸，EDTA）在微波炉中3分钟，直至所有的颗粒消失。然后冷却在37℃水浴中至少30分钟。
- 结合细胞在1×105 /毫升用熔融低熔点琼脂糖（在37℃下）在一个比为1:10（体积/体积），涡旋简单地说，并立即移液50微升到彗星幻灯片。使用移液管尖的侧的细胞悬浮液均匀地传播，在样品区。每个治疗组中应是至少在一式三份。
- 地点下滑上课平在冰箱中30分钟，直到出现一个圆形的外周中的滑动。
- 在预冷的裂解液浸泡幻灯片和离开在4°C，1小时在黑暗中过夜。
- 从裂解液中取出幻灯片，沥干的幻灯片和冲洗一次用冷的中和缓冲液5分钟，以除去残留的清洁剂和它的盐，碱 - 开绕工序之前。
- 将幻灯片中的凝胶电泳室充满了预冷的新鲜电泳缓冲液（300毫米1毫米的NaOH，EDTA，pH值> 13）不超过0.5厘米以上的幻灯片。对齐，使它们从电极等距离的幻灯片。
- 让幻灯片坐的碱性缓冲液中，在黑暗中30分钟，以允许解除碱负责损害的DNA和表达。
- 电源电压，以每平方厘米1 V（测量电极，电极），运行30分钟，在4°C（或冷水机房）。
4。固定和站矿业细胞
- 沥干多余的电泳缓冲液
- 浸入滑动预冷的蒸馏水，在室温5分钟。
- 在RT下的5分钟的预冷冻的70％乙醇中的浸入滑动。
- 干样品过夜。不要让幻灯片明亮的光线。样品可以得分在这个阶段之前，在室温下存放数月。
- 通过浸渍在SYBR GREEN（1X在PBS中稀释）在冰箱中的20分钟染色幻灯片。
- 删除幻灯片，并允许他们在黑暗中完全干燥。琼脂糖完全干燥时也会变得透明。
4。图像采集和分析
- 采集图像，使用荧光显微镜的绿色过滤器“（蔡司AxioVision）和分析利用彗星分析软件（感知工具）。
- 点击“彗头”（核）和软件计算出的平均尾矩和DNA量的参数，包括核。
- 分析至少200个细胞，每个处理。
- 将数据导出到Microsoft Excel。
- 计算平均每个治疗组和绘图数据，适当尾矩。
5。代表性的成果
对神经元细胞的彗星试验分析的一个例子在图2和图3所示。在这种情况下，照射的神经元细胞诱导的DNA损伤。由于细胞受到的电场，该DNA迁移由于它随后被使用彗星试验检测软件分析差异大小以不同的速率。更多的DNA损伤，更远的DNA迁移出的核心。这将减少在细胞核中的荧光强度，它随后被拾起在更高的尾矩由软件和结果表1示出了代表性的表从彗星试验分析和图4示出了代表中对准焦点图比较神经细胞的DNA损伤的，辐射测量彗星试验。
图1。流程图彗星试验。 点击此处查看大图 。
图2代表的神经元细胞的图像（A）的不和（B）与彗尾。
图3。彗星试验分析，使用彗星试验软件。 （A）代表屏幕截图使用卡尔蔡司荧光显微镜获得的图像和彗星试验分析检测软件。 （B）的细胞核或“彗星头”（绿色）点击产生的荧光图和图（黄色）和（C）数据表（红色圆圈）。 点击此处查看大图 。
图4代表通过绘制通过分析在使用中性彗星实验的照射和非照射的神经细胞的DNA损伤的平均尾矩而获得的曲线图。正如预期的那样，在照射神经细胞由更高的平均尾矩3Gy辐射（X-射线），诱导DNA损伤所描绘。图中所示为平均尾矩（+ / - 标准差），** P <0.01。
表1中。 点击这里查看大图 。
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Discussion
彗星试验分析单个细胞具有独特的能力。这是有利的鉴定表明微分响应的细胞毒性剂的细胞亚群。一个必须考虑一些实际的限制。的细胞数，可以单独评估，可能会有所不同，这取决于个人。样本大小需要增加内的人口在DNA损伤，如果有方差。可行的单细胞悬液，此测定是至关重要的，因为优势坏死或凋亡的细胞的存在下，将加至错误。的细胞凋亡，小的DNA片段（小于50KB），线粒体DNA的裂解和电泳步骤摆脱。因此，他们没有检测到的彗星试验1,3-11。
正如上面提到的，彗星试验是一种有效的方法检测单和双链断裂，碱不稳定的的网站和DNA-DNA/DNA-protein交联的DNA。在这里，我们已经概述了两个不同的协议：碱性测定允许的单链断裂以及双链断裂的检测，而中性彗星实验只允许检测双链断裂。酶改性彗星试验可用于检测氧化DNA加合物。例如，治疗用Endo III（内切酶）和hOGG1（糖基化酶）识别氧化嘧啶包括胸腺嘧啶乙二醇和尿嘧啶丙二醇12,13和8 -氧代-7,8 - dihydroguanine（8-oxoGua）14,15分别。 formamidopyrimidine DNA-糖基化酶（FPG），可以同样地使用。对于这个修改过的实验中，用酶处理之前的退绕步骤。病变的特定内切核酸酶的加入，增加了灵敏度的彗星试验以及13。
在这里，我们使用尾矩描述符的DNA损伤。尾矩是使用下面的公式计算的：在尾部DNA百分比乘以用lenGTH的彗星尾1,3-7。彗尾（尾巴长度）的长度是从中心的核的最远点的DNA的迁移的距离。头长度是直径的细胞核。总强度和尾部强度的平均像素强度，分别在头部和尾巴的彗星。总面积是彗星1,3-7的总体表面积。
虽然还有其他的测量，如γ-H2AX的灶染色和脉冲场凝胶电泳的DNA损伤的方法，这些方法也有其缺点，以及4,6,11,16,17。例如，复制压力往往是一个混杂因素中的测量γ-H2AX的水平18。由于γ-H2AX灶的形成是依赖于招聘的DNA修复蛋白，，未能聘请DNA修复蛋白和染色质结构可能会导致虚假的低γ-H2AX灶水平为好。同样，脉冲场凝胶electroph的oresis是非常耗费时间和利于大DNA分子的分离，19,20。因此，彗星试验是一个相对容易的，有效的，且价格低廉，直接和敏感的DNA损伤与修复措施10,11,21。
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Disclosures
没有利益冲突的声明。
Acknowledgments
这项工作是支持的，战斗的儿童癌症基金会，阿拉巴马州伯明翰大学综合癌症中心的放射肿瘤学，Gabrielle的天使基金（ESY。）系的影响力大奖。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1.5 ml tubes | Santa Cruz Biotechnology, Inc | Sc-200271 | |
| 10X TBE (Tris base, boric acid, EDTA) | Fisher Scientific | BP13331 | |
| 15 ml tube | Fisher Scientific | 0553851 | |
| Agarose | Sigma | A5093 | |
| Aluminum foil | Fisher Scientific | 01213101 | |
| Beaker | Fisher Scientific | FB102300 | |
| Centrifuge | Thermo Scientific | 75004261PR | |
| Comet Assay software | Comet Assay IV Image Analysis System | ||
| Cylinder | Fisher Scientific | 08555F | |
| EDTA | GIBCO | 15575 | |
| Electrophoresis chamber | Thermo Scientific | 09528101 | |
| Ethanol | Fisher Scientific | A407P4 | |
| Fluorescent microscope | Zeiss Axio Vision | Any fluorescent microscope with green filter will suffice | |
| Hemacytometer | Fisher Scientific | 0267152 | |
| Low melting point agarose | Promega | V2111 | |
| Microwave | Sears | ||
| Phosphate buffered saline, calcium free, magnesium free | HyClone | SH3025601 | |
| Power supply | BioRad | 1645050 | |
| Refrigerator | Sears | ||
| Ruler | Staples | ||
| Slide | Fisher Scientific | 12550143 | |
| Sodium chloride | Sigma | S7653 | |
| Sodium hydroxide | Sigma | S5881 | |
| Sodium lauryl sarcosinate | Fisher Scientific | S529 | |
| Sybr green | Invitrogen | S7585 | |
| Tray | Fisher Scientific | 15242B | |
| Tris Base | Sigma | T6066 | |
| Triton-X 100 | Sigma | T8787 | |
| Trypsin | HyClone | SH3023601 | |
| Vortex | Fisher Scientific | 02216108 | |
| Water bath | Fisher Scientific | 154622Q |
References
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