Summary
نحن تصف بروتوكول لإجراء اختبار إجهاد القلب الناجمة عن الدوبوتامين ومراقبتها من قبل قسطرة القلب في الفئران العادية. كما نعرض تطبيقه على كشف أمراض القلب تحت الإكلينيكي في الفئران حمية عالية الدهون الناجمة عن السمنة.
Abstract
الدوبوتامين هو ناهض الأدرينالية β مع تقارب أعلى لمستقبلات أعرب في قلب (β 1) من لمستقبلات أعرب في الشرايين (β 2). عندما تدار بشكل منتظم، لأنه يزيد الطلب القلب. وهكذا، تكشف القناع عن إيقاع غير طبيعي الدوبوتامين أو المناطق الدماغية المحتملة لخطر احتشاء.
لا يمكن أن يؤديها رصد وظيفة القلب أثناء اختبار التحمل القلب أو من قبل أي من ecocardiography قسطرة القلب. هذا الأخير هو أسلوب أكثر دقة الغازية ولكن وغنية بالمعلومات التي السابق.
القلب اختبار الإجهاد الناجم عن الدوبوتامين ومراقبتها من قبل قسطرة القلب إنجاز كما هو موضح هنا يسمح، في تجربة واحدة، وقياس المعلمات الدورة الدموية التالية: معدل ضربات القلب (HR)، والضغط الانقباضي والضغط الانبساطي، والضغط الانبساطي النهائي، الضغط الإيجابي القصوى التنمية (DP / dtmax) واضغط السلبية القصوىلدى عودتهم التنمية (DP / DT دقيقة)، في ظروف خط الأساس وتحت جرعات متزايدة من الدوبوتامين.
كما هو متوقع، في الفئران العادية احظنا الدوبوتامين بالجرعة زيادة في الحد الأقصى HR DP / DT، ويوجد DP / DT. وعلاوة على ذلك، على أعلى جرعة اختبار (12 نانوغرام / غرام / دقيقة) في انهيار المعاوضة القلبية الفئران حمية عالية الدهون الناجمة عن السمنة وغير المقنعة.
Protocol
وتمت الموافقة من قبل لجنة بروتوكول أخلاقيات لطب السريري Facultad دي Desarrollo ديل Alemana-جامعة.
I. إعداد تسريب الدوبوتامين
- حل 10 ملغ من الدوبوتامين في 20 مل من الماء المقطرة العقيمة، من أجل الحصول على محلول من 500 ميكروغرام / مل الدوبوتامين. قسامة وتخزينها في -20 درجة مئوية. ويمكن استخدام هذا الحل على الأقل لمدة 3 أشهر.
- ذوبان الجليد في قسامة من محلول المخزون الدوبوتامين في درجة حرارة الغرفة.
- تمييع الحل الدوبوتامين الأسهم في معقمة كلوريد الصوديوم 0.9٪، من أجل الحصول على حل الدوبوتامين العمل التي تركز يحسب باستخدام الصيغة: الدوبوتامين (ميكروغرام / مل) = وزن الجسم X 0.2.
- ملء حقنة 1 مل 29Gx1 / 2 "مع الدوبوتامين حل العمل.
- أدخل الإبرة من الحقنة في أنبوب PE 20-10 سم.
- ضبط حقنة في مضخة التسريب بعد تعليمات الشركة المصنعة.
- إعداد ضخ منحدر في خطوةإلى الخطوة تنسيق مع بزيادة قدرها 10 ميكرولتر / دقيقة لكل خطوة، لمدة 6 خطوات.
II. إعداد استشعار الضغط
- للحد من الانجراف إشارة، يغرق استشعار الضغط في الماء المعقم في C ° 37 على الأقل 15 دقيقة. لا نقع القسطرة أكثر من 0.5 سم العميق، من أجل منع ذلك الضغط الهيدروليكي يؤثر على استشعار الضغط.
- معايرة إلكترونيا استشعار الضغط في 25 و زئبق 100. يتم تحويل المدخلات الكهربائية (فولت) إلى إشارة الضغط (مم زئبق).
- تعيين معدل أخذ العينات من 2 ك / ث واستخدام مرشح تمرير منخفض مع قطع في 100 هرتز. تعيين إشارة الضغط إلى الصفر مم زئبق.
- بمناسبة القسطرة 15 مم من الحافة. وقدر بعيدة للوصول إلى قلب من وجهة مقدمة من تخطيط صدى القلب، الكشف عن وجود قسطرة في ventricule اليسار.
III. إعداد فأرة للقسطرة
- C57BL الوزن / 6 الفئران الذكور، 30-32 أسبوع من العمر.
- حقن الغشاء البريتونى 60 ميكروغرام / كغ الكيتامين و 4 ميكروغرام / كغ زيلازين 1. ملاحظة: يمكن استخدام التخدير أخرى، على سبيل المثال: 350 حتي 450 ميكروغرام / كغ AVERTIN، 50 ميكروغرام / كغ أو 1.5 بنتوباربيتال - 2-3 isoflurane 2٪.
- حلاقة الرقبة مع الحلاقة الكهربائية.
- ضع الماوس تخدير في موقف ضعيف على لوحة التسخين متساوي الحرارة حرارة. تأمين أطرافه مع شريط ورقي.
- أداء قليل اصبع القدم لتأكيد التخدير الكامل.
- إدراج بلطف مجس المستقيم لمراقبة درجة حرارة الجسم. باستخدام مسبار vaselinized يوصى.
- إذا درجة حرارة الجسم يختلف من 37 ° C ± 0.5 ° C، وضبط ذلك عن طريق لوحة التدفئة.
- وضع خطم الماوس بالقرب من امدادات الاوكسجين.
- ضع الماوس منطقة الرقبة تحت stereomicroscope.
IV. الحصول على البيانات
- في 7 البرمجيات LabChartPro، حدد قناة واحدة للتسجيل الضغط وقناة واحدة للمعدل ضربات القلب (HR)التسجيل. لهذا الأخير، حدد الخيار "القياسات الدورية" وقياس معدل الإعداد و.
- للقناة الضغط تعيين نطاق النطاق: 0 حتي 150 مم زئبق.
- لتعيين HR قناة نطاق جدول: 200 حتي 600 نبضة في الدقيقة.
- اضغط على مفتاح بدء لبدء التسجيل.
- إدراج تعليقات تشير إلى العمليات الجراحية، على سبيل المثال: إدارة التخدير، والبدء من التسريب الدوبوتامين، وتركيز الدوبوتامين، والتنفس التغييرات.
V. قسطرة القلب 4،5
- إجراء شق صغير على الجانب الأيمن بالقرب من الفك. مع مقص فصل الأنسجة الضامة العضلات الجلد.
- إجراء تشريح طولية (1.5 - 2 سم) على الجانب الأيمن من القصبة الهوائية. فصل النسيج الضام، والدهون والعضلات مع ملقط المنحني، من أجل فضح الشريان السباتي الأيمن بالقرب من القصبة الهوائية.
- تضع المتوسع في الجانب الحيواني الحق في فضح الشريان السباتي. نابضالضغط المتولدة عن القلب يسهل تحديد الشريان. حبل الوريد، وهو الأحمر الداكن، هو على حق.
- فصل الشريان من الأنسجة المجاورة مع ملقط المنحني. العصب المبهم، الذي يشبه الخيط الأبيض، وتقع على طول الشريان.
- قطع قطعة من الخيط 20 سم 6/0 الحرير و "مزدوج" عليه.
- تمرير "المزدوج" الموضوع تحت الشريان من اليسار إلى اليمين. قطع الخيط، من أجل الحصول على الغايات منفصلة.
- تمرير الموضوع الثالث (10 سم) تحت الشريان.
- ربط عقدة ضيقة في الموضوع وضعه بالقرب من الرأس، وفضفاضة واحدة في الموضوع أكثر البعيدة.
- ربط عقدة فضفاضة في الموضوع الأوسط، وإصلاح الطرف الأيمن من الخيط الأوسط إلى سادة التدفئة مع شريط ورقي.
- إبقاء الشريان السباتي عن طريق إسقاط رطبة العقيمة كلوريد الصوديوم 0.9٪. تجفيف قبالة الزائدة من السوائل مع براعم القطن.
- تمتد أسفل الموضوع مع المشبك مرقئ.
- إصلاح موقف مقص مرقئ بواسطة Pببطء على الجلد من البطن، وتمتد على الموضوع العليا، وذلك لتسد تدفق الدم. تحقق من أنه تمت إزالة النسيج الضام حول الشريان. يجب أن تكون كاملة من الشريان الدم والمحرومين من النبض. منع المواضيع من إنتاج قوة عزم الدوران على الشريان.
- جعل المقطع العرضي نيك بالقرب من أسفل الشريان مع مقص الدقيقة Vannas. ان تراق قطرة دم.
- إدراج قسطرة في الشريان السباتي. تأكد من إدخال استشعار الضغط بأكمله. تحقق من عدم وجود فقدان الدم.
- ضبط بلطف عقدة الموضوع الأوسط، من أجل الاستمرار على القسطرة في مكانها. لا ضغط أكثر من اللازم، واستشعار الضغط هش للغاية.
- الافراج عن مقص مرقئ من البطن الحيوان.
- عقد القسطرة مع اليد ودفع الموضوع الأوسط، وذلك لتجنب فقدان الدم. ملاحظة: يجب أن تكون الشريان الكامل من الدم.
- بدء تسجيل إشارات الضغط.
- عندما القسطرة هو في الداخل، فيإشارة الضغط الشرياني يتقلب 60-70 ل100-120 مم زئبق. ويظهر على شكل إشارة الضغط في ملاحظة الشكل 1.A.: إذا كنت مهتما في، في هذه المرحلة الزمنية يمكنك تسجيل الضغط الشرياني إذا إشارة ثابت لمدة لا تقل عن 5 دقائق. تم الحصول على قيم HR من الطول الموجي الضغط النظر فاصل زمني من 30 ثانية من إشارة قياسية. من الممكن أيضا استخدام وسيلة لقياس تخطيط القلب مباشرة لHR، وفقا لأهداف التحقيق.
- دفع برفق حتى القسطرة لمراقبة تغير في شكل إشارة الضغط (الشكل 1.B). مرة القسطرة داخل البطين الأيسر، إشارة الضغط يتقلب من 0 إلى 100-120 مم زئبق. إذا كان من الصعب الانزلاق القسطرة، قرصة الصدر مع اثنين من أصابع الحيوان.
- السيطرة على معدل التنفس بشكل مستمر، درجة حرارة الجسم، ومستوى التخدير وإشارة الضغط. ينبغي لجميع من لهم تبقى مستقرة.
VI. ضخ الدوبوتامين
- إدخال أنبوب PE-10 في الوريد. تأكد من أن تدفق الدم لا يتم حظر نقل الغواص الى الوراء حقنة.
- ضخ الدوبوتامين يبدأ مع 10 ميكرولتر / دقيقة والانتهاء مع 60 ميكرولتر / دقيقة. في كل خطوة، في الحفاظ على المعدل التسريب لمدة 2 دقيقة 6.
- بعد الجرعة الدوبوتامين الماضي، الموت ببطء مع الحيوان جرعة زائدة من التخدير.
VII. تحليل البيانات
- لتحليل البيانات، واختيار مقطع من البيانات المسجلة من اهتمامك. تأكد من النظر في الفترة الزمنية حيث ضغط إشارة مستقرة.
- حدد رمز الإعداد في الدم حدة الضغط. إشارة إلى نوع محدد من إشارة الضغط.
- تلقائيا يعرض LabChartPro 7 البرمجيات يعني الحد الأقصىوالقيم الدنيا للHR، الضغط الانقباضي (P كحد أقصى)، والضغط الانبساطي (P دقيقة)، نهاية الانبساطي ضغط (EDP)، القصوى التنمية الضغط الإيجابي (DP / dtmax) والقصوى التنمية الضغط السلبي (DP / DT دقيقة). وبالإضافة إلى ذلك، يمكن تصور المعلمات القلب على أثر الضغط.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
يتم تعريف إشارة الضغط الشرياني عن طريق الضغط الانقباضي والانبساطي. عندما استشعار الضغط داخل البطين الأيسر والضغط على (LVP) يتميز الموجي بواسطة قطرة إلى الصفر من الضغط الانبساطي وظهور الانكماش الأذين الأيسر البطين قبل الانكماش (الشكل 1). في حالة خط الأساس، كان الكيتامين-زيلازين تخدير الفئران العادية HR من 280 ± 24، P ماكس من 107 ± 8، P دقيقة من 5 ± 1، EDP من 14 ± 2، DP / دينارا كحد أقصى من 6081 ± 365 و دقيقة DP / DT من 5230 ± 526.
كما رأينا في الشكل 2، في الفئران العادية LVP وزيادة تدريجيا على طول HR ضخ الدوبوتامين، وتطبيع بعد وقف التسريب. كما هو متوقع، تقييم جميع المعلمات الدورة الدموية زادت أيضا بطريقة تعتمد على الجرعة الدوبوتامين (الشكل 3). وهكذا، مؤثر على الميقاتية الدوبوتامين (HR الزيادة) وإيجابي في ويتضح otropic (LVP وDP / DT زيادة الحد الأقصى) الآثار.
مقارنة مع الفئران العادية، في الفئران حمية عالية الدهون الناجمة عن السمنة لاحظنا زيادة أقل من الحد الأقصى وموانئ دبي HR / دينارا عند يسببها الإجهاد القلبي، كانت ذات دلالة إحصائية عند جرعات أعلى الدوبوتامين اختبار (الشكل 4). لم تراع هذه الاختلافات في ظروف خط الأساس (0 نانوغرام / غرام / دقيقة).
الشكل 1. الشرياني (A) والبطين (B) تم الحصول عليها بعد الضغط يسجل قسطرة من الفئران العادية. تم تحديد المعلمات من الدورة الدموية LVP دورات ممثل الوقت مقابل القلب. بيانات تمثيلية من 5 الحيوانات. اضغط هنا لمشاهدتها بشكل اكبر شخصية .
الشكل 2. LVP (A) والموارد البشرية (B) خلال ضخ يسجل الدوبوتامين في الفئران العادية. بيانات تمثيلية من 5 الحيوانات.
الشكل 3. HR (A)، LVP (B)، DP / دينارا كحد أقصى (C) وموانئ دبي / دينارا للدقيقة (D) خلال ضخ التغييرات الدوبوتامين في الفئران العادية. يتم التعبير عن البيانات كما يعني ± SEM. ن = 5
الشكل 4. HR (A) وموانئ دبي / دينارا كحد أقصى (B) خلال ضخ التغييرات الدوبوتامين في الحالات العادية وعالية الفئران حمية الدهون التي يسببها السمنة. يتم التعبير عن البيانات كما يعني ± SEM. * = P <0.05، ن = 5
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
القلب اختبار الإجهاد الناجم عن الدوبوتامين ومراقبتها من قبل قسطرة القلب هو شاقة. ومع ذلك، بعد بروتوكول هنا وصف ومع وقت قصير من التدريب، فمن الممكن لتقييم الدورة الدموية ستة المعلمات في تجربة واحدة أن ما يقرب من ساعة واحدة الماضي.
الخطوات الحاسمة لبروتوكول قدمت هنا هي cannulations الأوعية الدموية. فيما يتعلق كيفية تركيب الكانيولا من الشريان السباتي، يجب إجراء شق تكون عميقة بما يكفي لكسر طبقات الأنسجة ثلاثة من الشريان، وكبيرة بما يكفي للسماح بمرور القسطرة. فيما يتعلق كيفية تركيب الكانيولا من حبل الوريد، في حين أن خطر النزيف هو المنخفض، وإمكانية انسداد الوريد عالية. وهكذا، بروتوكول التكرار توقف بإسهاب على توحيد استراتيجية الخدش المستخدمة.
لتقليل ينبغي منع تأثير تأثير الاكتئاب من انخفاض حرارة الجسم، ونقص الأكسجة والتخدير، إذا لزم الأمر، تصويباتتيد. يجب أن تبقي إيقاع التنفس العادية بسبب عدم انتظام التنفس العميق أو يؤثر LVP التسجيل.
ينبغي تعديل الجرعات المستخدمة الدوبوتامين وفقا ل: الطريق) ط الإدارة (عن طريق الوريد: 0،5 حتي 40 نانوغرام / غرام / دقيقة 7،8؛ الغشاء البريتونى: من 1 إلى 1.5 ميكروغرام / غرام / دقيقة 9،10)، الثاني) حجم القلب اختلال وظيفي والثالث) ethiology من تغيير القلب.
وأخيرا وليس آخرا، وثلاثة النصائح العملية: ط) في الحيوانات مع الأنسجة الدهنية المحيطة وفيرة حبل الوريد، السماح لكمية صغيرة من الدم على الخروج، من أجل الكشف عن شق الحدود؛ الثاني) إبقاء منطقة العمل لأن بلل كيفية تركيب الكانيولا الإجراء هو أبسط عندما يتم مشحم جيدا القسطرة؛ الثالث) علامات القسطرة يسهل التصور لها تحت المجهر.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
الإعلان عن أي تضارب في المصالح.
Acknowledgments
نشكر الدكتور هيليو سالغادو، Lataro ريناتا وماورو دي اوليفييرا، كلية الطب ريبراو بريتو، جامعة ساو باولو، والدكتور بن يانسن، معهد بحوث القلب والأوعية الدموية ماستريخت، جامعة ماستريخت، للحصول على المساعدة السخية خلال عملية الإعداد.
وأيد هذا العمل من قبل N ° FONDECYT منحة 11090114 لSDC
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagents | |||
| PE-50/10 | Warner Instruments | 64-0752 | |
| Silk thread 6/0 HR17 | Tagum | SN0713K | |
| Xylacin 20 mg/ml | Laboratorio Centrovet | ||
| Ketamine 100 mg/ml | Drag Pharma | ||
| Sodium chloride 0.9% | Lab Sanderson S.A. | ||
| Dobutamine hydrochloride | Sigma-Aldrich | D0676 | |
| Syringe U-100 Insulin 29G x ½" | Terumo Medical Co. | ||
| Forceps Dissecting Micro 11.5 cm Style 7 | Lawton Medizintechnik | 09-0959 | |
| Graefe Forceps Cvd 0.7mm 7cm | Lawton Medizintechnik | 62-0263 | |
| Clamps Dieffenbach bulldog Cl Str 38 mm | Lawton Medizintechnik | 60-010 | |
| Vannas Scissors 8 cm Str Fh | Lawton Medizintechnik | 63-1400 | |
| Equipment | |||
| SPR-671 MiKro-Tip Pressure catheter | Millar instruments | 840-6719 | |
| PCU-2000 Pressure Control Unit | Millar instruments | 880-0129 | |
| PowerLab 4/30 | ADinstruments Pty Ltd. | ML866 | |
| LabChartPro 7 | ADinstruments Pty Ltd. | MLU260/7 | |
| Legato200 Infusion Pump | KdScientific | KD-KDS210P | |
| TCAT-2LV Temperature controller and isothermal heating plate | PhysiTemp instruments Inc. | ||
| Medical Oxygen supply | Indura | ||
| Rectal probe | ADinstruments Pty Ltd. | MLT1404 | |
| Trinocular microscope, axial illumination | LW Scientific | Z2B-TRI-ETNE, ILP-1502-LTS1, ILP-1502-DGGF | |
References
- Hart, C. Y., Burnett, J. C., Redfield, M. M. Effects of avertin versus xylazine-ketamine anesthesia on cardiac function in normal mice. Am. J. Physiol. Heart Circ. Physiol. 281, H1938-H1945 (2001).
- Janssen, B. J., et al. Effects of anesthetics on systemic hemodynamics in mice. Am. J. Physiol. Heart Circ. Physiol. 287, H1618-H1624 (2004).
- Lorenz, J. N. A practical guide to evaluating cardiovascular, renal, and pulmonary function in mice. Am. J. Physiol. Regul. Integr. Comp. Physiol. 282, R1565-R1582 (2002).
- Lorenz, J. N., Robbins, J. Measurement of intraventricular pressure and cardiac performance in the intact closed-chest anesthetized mouse. Am. J. Physiol. 272, H1137-H1146 (1997).
- Nemoto, S., DeFreitas, G., Carabello, B. A. Cardiac catheterization technique in a closed-chest murine model. Contemp. Top. Lab Anim. Sci. 42, 34-38 (2003).
- Daniels, A., et al. Impaired cardiac functional reserve in type 2 diabetic db/db mice is associated with metabolic, but not structural, remodelling. Acta Physiol. (Oxf). 200, 11-22 (2010).
- De Celle, T., et al. Long-term structural and functional consequences of cardiac ischaemia-reperfusion injury in vivo in mice. Exp. Physiol. 89, 605-615 (2004).
- Huntgeburth, M., et al. Transforming growth factor beta oppositely regulates the hypertrophic and contractile response to beta-adrenergic stimulation in the heart. PLoS One. 6, e26628 (2011).
- Reddy, A. K., et al. Cardiac function in young and old Little mice. J. Gerontol. A. Biol. Sci. Med. Sci. 62, 1319-1325 (2007).
- Christoffersen, C., et al. Cardiac lipid accumulation associated with diastolic dysfunction in obese mice. Endocrinology. 144, 3483-3490 (2003).
