בדיקת מאמץ לב הנגרמת על ידי Dobutamine ופיקוח על ידי צנתור בעכברים

Summary

אנו מתארים את הפרוטוקול לביצוע מבחן מאמץ לב הנגרם על ידי dobutamine ופיקוח על ידי צנתור בעכברים נורמלים. כמו כן אנו מציגים יישומה לחשוף מחלת לב תת קלינית בעכברים שמנים גבוהים דיאטה מושרה שמנים.

Abstract

Dobutamine הוא אגוניסט β-adrenergic עם זיקה גבוהה יותר לרצפטור בטא בלב (β ₁₎ מאשר לקולטניים בטא בעורקים (β _2). כאשר באופן מערכתי, זה מגדיל את הביקוש של לב. לפיכך, dobutamine חושף קצב נורמלי או אזורים איסכמיים בסיכון פוטנציאלי לאוטם.

ניטור של תפקוד לב במהלך בדיקת מאמץ לב יכול להתבצע על ידי שתי ecocardiography או צנתור. האחרון הוא טכניקה פולשנית אבל יותר מדויקת ואינפורמטיבי שלשעבר.

בדיקת מאמץ לב הנגרם על ידי dobutamine ופיקוח על ידי הצנתור נעשה כמתואר כאן מאפשרת, בניסוי אחד, המדידה של פרמטרי hemodynamic הבאים: קצב לב (HR), לחץ הסיסטולי, לחץ הדיאסטולי, לחץ סוף דיאסטולי, לחץ חיובי מקסימאלי הפיתוח (DP / dtmax) ולחץ שלילי מקסימאלייור פיתוח (DP / DT _דקות), בתנאים בסיסיים ותחת הגדלת מינון של dobutamine.

כצפוי, בעכברים נורמלים שנצפינו עלייה קשור למינון dobutamine במשאבי אנוש, DP / DT _{ומקסימום} DP / DT _דקות. יתר על כן, במינון הגבוה ביותר נבדק (12 ng / g / דקות) decompensation הלב של עכברים שמנים גבוהים דיאטה מושרה שמנים נחשף.

Protocol

פרוטוקול אושר על ידי ועדת האתיקה של Facultad דה Medicina Clinica Alemana-Universidad del Desarrollo.

I. הכנת עירוי Dobutamine

1. להמס 10 מ"ג של dobutamine ב20 מ"ל של מי distillated סטרילי, על מנת לקבל פתרון מניות של 500 מיקרוגרם / המ"ל dobutamine. Aliquot ולאחסן ב -20 ° C. פתרון זה יכול לשמש לפחות במשך 3 חודשים.
2. הפשר aliquot של פתרון המניות dobutamine בטמפרטורת חדר.
3. לדלל פתרון המנייה dobutamine בסטרילי 0.9% NaCl, על מנת לקבל פתרון dobutamine עבודה, שהריכוז מחושב באמצעות נוסחה: dobutamine (מיקרוגרם / מ"ל) = משקל הגוף x 0.2.
4. מלא מזרק 1 מ"ל 29Gx1 / 2 "עם פתרון עובד dobutamine.
5. הכנס את המחט של המזרק לתוך 20 סנטימטרי צינור PE-10.
6. התאם את המזרק במשאבת העירוי בעקבות הוראות יצרן.
7. הגדר את עירוי הרמפה בצעדלצעד פורמט עם גידול של 10 μl / דקה לכל שלב, ל6 שלבים.

השני. הכנת חיישן לחץ

1. כדי למזער את סחיפת אות, חיישן לחץ להציף במים סטריליים על 37 מעלות צלזיוס במשך לפחות 15 דקות. אל תשרה את הקטטר יותר מ 0.5 סנטימטר העמוק, כדי למנוע שלחץ ההידרוסטטי משפיע חיישן לחץ.
2. אופן אלקטרוני לכייל את חיישן לחץ בגיל 25 ו 100 מ"מ כספי. חשמל קלט (וולט) מומר לאות לחץ (מ"מ כספי).
3. הגדר את קצב הדגימה של 2 k / s ולהשתמש במסנן הנמוך לעבור עם נחתך ב 100 הרץ. הגדרת אות לחץ לאפס מ"מ כספי.
4. סמן 15 מ"מ מקצה הצנתר. רחוק כדי להגיע ללב מנקודת המבוא הוערך על ידי אקו, זיהוי הנוכחות של קטטר לתוך ventricule השמאל.

ג. הכנת עכבר לצנתור

1. המשקל C57BL / 6 עכברי זכרים, 30-32 שבוע ישן.
2. מזריק קטמין intraperitoneally 60 מיקרוגרם / ק"ג ו 4 ק"ג / ¹ ק"ג xylazine. הערה: הרדמה אחרת עשויה לשמש, למשל: 350-450 מיקרוגרם / קילו Avertin, 50 מיקרוגרם / קילו פנטוברביטל או 1.5 - 2% ^2-3 isoflurane.
3. שבי הצוואר עם מכונת גילוח.
4. הנח את העכבר מורדם במצב שכיבה על צלחת חימום איזוטרמי מחוממת. לאבטח את גפיו בנייר דבק.
5. בצע קמצוץ בוהן כדי לאשר הרגעה מוחלטת.
6. הכנס בעדינות בפי טבעת כדי לפקח על טמפרטורת גוף. באמצעות בדיקת vaselinized מומלץ.
7. אם טמפרטורת גוף שונה מ37 ° C ± 0.5 ° C, להתאים אותו באמצעות צלחת החימום.
8. שים את חוטם עכבר ליד אספקת החמצן.
9. הנח את העכבר באזור הצוואר מתחת stereomicroscope.

IV. רכישת נתונים

1. ב7 תוכנת LabChartPro, בחר ערוץ אחד לרישום לחץ וערוץ אחד לקצב לב (HR)רישום. באפשרות השנייה, בחר באפשרות "מדידות מחזוריות" ומדידת הגדרה כשיעור.
2. לערוץ הלחץ להגדיר את הטווח בהיקף: 0-150 מ"מ הכספי.
3. לHR ערוץ מוגדר טווח בהיקף: 200-600 פעימות לדקה.
4. לחץ על מקש כדי להתחיל בהרשמה.
5. הכנס הערות המצביעות על הליכים שבוצעו, לדוגמה: ממשל הרדמה, להתחיל בעירוי dobutamine, ריכוז dobutamine, נושם שינויים.

צנתור לב ^4,5 V.

1. מבצע חתך קטן בצד הימין ליד הלסת. עם מספריים להפריד את רקמת חיבור של עור שהרירי.
2. לבצע נתיחת אורכית (1.5-2 סנטימטר) בצד ימין של קנה הנשימה. הפרד את הרקמה, שומן ושריר חיבור עם מלקחיים מעוקלים, במטרה לחשוף את העורק הראשי ממש ליד קנה הנשימה.
3. הנח הרחבה בצד ימין החיה לחשוף את העורק הראשי. Pulsatileלחץ שנוצר על ידי הלב מאפשר זיהוי של העורק. וריד הצוואר, שהוא אדום כהה, הוא בצד ימין.
4. הפרד את העורק מרקמות סמוכות עם מלקחיים מעוקלים. העצב התועה, אשר דומה בחוט לבן, שוכן לאורך העורק.
5. לחתוך חתיכת 20 סנטימטר של חוט 6/0 משי ו" כפול "אותו.
6. מעביר את החוט "הכפול" מתחת לעורק משמאל לימין. חותך את החוט, כדי להשיג מטרות נפרדות.
7. עובר חוט שלישי (10 סנטימטרים) מתחת לעורק.
8. לקשור קשר הדוק בנושא מיקומו קרוב לראש, ואחד רופף בחוט הדיסטלי יותר.
9. לקשור קשר רופף בחוט באמצע, ולתקן את הקצה הימני של החוט האמצעי לכרית החימום עם נייר דבק.
10. שמור על העורק ראשי לח על ידי הטלת סטרילי 0.9% NaCl. להתנגב עודף של נוזל עם ניצני כותנה.
11. למתוח את החוט התחתון עם מהדק מלקחיים.
12. לתקן את המיקום של מספרי מלקחיים על ידי pהתקדם לעור של הבטן, מתיחת החוט העליון, על מנת לחסום את זרימת דם. ודא שרקמת חיבור סביב העורק הוסרה. העורק צריך להיות מלא בדם ונטול דופק. למנוע אשכולות מלייצר כוח מומנט בעורק.
13. הפוך סעיף ניק צלב קרוב לתחתית של העורק עם מייקרו מספרי Vannas. טיפי דם תישפכנה.
14. הכנס את הצנתר לתוך העורק הראשי. הקפד להכניס את חיישן לחץ כולו. ודא שאין איבוד דם.
15. עדינות להתאים את קשר החוט באמצע, כדי להחזיק את הצנתר במקום. לא לדחוס יותר מדי, חיישן הלחץ הוא מאוד שביר.
16. שחרר את מספרי מלקחיים מבטן בעל החיים.
17. החזק את הקטטר עם היד ולדחוף את החוט באמצע, על מנת להימנע מאיבוד דם. הערה: עורק צריך להיות מלא בדם.
18. התחל אותות לחץ הקלטה.
19. כאשר הצנתר הוא בפנים,אות לחץ דם משתנית 60-70 ל100-120 מ"מ כספי. הצורה של אות הלחץ מוצגת בביאור 1.A. איור: אם אתם מעוניינים ב, בנקודת זמן זו אתה יכול להקליט את לחץ דם אם האות היא יציבה במשך לפחות 5 דקות. ערכי HR התקבלו מגל הלחץ שוקל הפסקה של 30 שניות של אות שיא. ניתן להשתמש בשיטת א.ק.ג. גם למדידה ישירה של קצב לב, בהתאם למטרות החקירה.
20. דחף בעדינות את הצנתר להבחין בשינוי בצורה של אות לחץ (איור 1.B). ברגע שהצנתר נמצא בחדר השמאלי, אות הלחץ נעה בין 0 ל 100-120 מ"מ כספי. אם קשה לחלק את הצנתר, לצבוט חזה חיה בשתי אצבעות.
21. רציפות לשלוט בקצב נשימה, טמפרטורת גוף, רמת הרדמה ואות לחץ. כל אחד מהם צריך להישאר יציב.

VI. עירוי של Dobutamine

1. להציג PE-10 צינור לווריד. אשר שזרימת הדם אינו חסום נע בוכנת המזרק אחורה.
2. עירוי Dobutamine מתחיל עם 10 μl / דקות וסיים עם 60 μl / דקה. בכל צעד, קצב העירוי נשמר במשך 2 דקות ^6.
3. לאחר המנה האחרונה dobutamine, להרדימו עם מנת יתר של חומרי הרדמה.

VII. ניתוח נתונים

1. לניתוח נתונים, בחר את הקטע של המידע המוקלט של העניין שלך. הקפד לשקול מרווח זמן שבו אות לחץ היא יציבה.
2. בחר בסמל ההגדרה במודול לחץ הדם. לציין את הסוג הנבחר של אות לחץ.
3. באופן אוטומטי את תוכנת 7 מציג LabChartPro כלומר, לכל היותרוערכי מינימום למשאבי אנוש, לחץ הסיסטולי (P _{מקסימום),} יתר לחץ דם הדיאסטולי (p _דקות), לחץ סוף דיאסטולי (אמ"ר), פיתוח לחץ חיובי מקסימאלי (DP / dtmax) והתפתחות לחץ שלילית מקסימלי (DP / DT _דקות). בנוסף, פרמטרים לבביים יכולים להיות מתוארים על עקבות לחץ.

Representative Results

אות לחץ הדם מוגדרת על ידי הסיסטולי ולחץ הדיאסטולי. כאשר חיישן הלחץ נמצא בחדר השמאלי, הלחץ שלה (LVP) גל מאופיין בירידה לאפס של לחץ הדיאסטולי ואת המראה של התכווצות הפרוזדורים השמאלית לפני התכווצות חדר לב (איור 1). במצב בסיסי, עכברים נורמלים מורדמים קטמין-xylazine היה HR של 280 ± 24, P _{מקסימום} של 107 ± 8, P _דקות של 5 ± 1, בושם של 14 ± 2, DP / DT _{המקסימאלי} של 6081 ± 365 ו DP / DT _דקות של 5230 ± 526.

כפי שניתן לראות בתרשים 2, בעכברים נורמלים LVP ומשאבי אנוש בהדרגה גדלו יחד עירוי dobutamine, ומנורמל לאחר הפסקת העירוי. כצפוי, כל פרמטרי hemodynamic העריכו גם גדלו באופן dobutamine תלוי מינון (איור 3). לפיכך, chronotropic dobutamine (עליית HR) וחיובי ב השפעות otropic (LVP ועליית DP / DT _{מקסימום)} הם מעידים.

בהשוואה לעכברים רגילים, בעכברים שמנים גבוהים דיאטה מושרה שמנים שצפינו עלייה נמוכה יותר של משאבי אנוש וDP / DT _{מקסימום} כאשר לחץ לבבי מושרה, היה משמעותי מבחינה סטטיסטית במינון הגבוה ביותר שנבדק dobutamine (איור 4). הבדלים אלו לא נצפו בתנאים בסיסיים (0 ng / g / דקה).

איור 1. עורק () וחדרית (ב) לחץ רושם מתקבל לאחר צנתור של עכברים רגילים. פרמטרי hemodynamic נקבעו ממחזורים יציגים LVP לעומת הזמן לבביים. נתונים מייצגים של 5 חיות. לחצו כאן לצפייה בדמות גדולה.

אף אוזן גרון ">
איור 2. LVP () ומשאבי אנוש (ב ') נרשם במהלך עירוי dobutamine בעכברים נורמלים. נתונים מייצגים של 5 בעלי חיים.

איור 3. HR (), LVP (ב '), DP / DT _מקס (C) וDP / DT _דקות (ד) שינויים במהלך עירוי dobutamine בעכברים נורמלים. נתונים מבוטאים כממוצע ± SEM. n = 5

איור 4. HR () ו (ב) שינויי DP / DT _{מקסימום} במהלך עירוי dobutamine בעכברי שומן רגילים וגבוהים דיאטה מושרה שמנים. נתונים מבוטאים כממוצע ± SEM. * = P <0.05, n = 5

Discussion

בדיקת מאמץ לב הנגרמת על ידי dobutamine ופיקוח על ידי צנתור היא מייגעת. עם זאת, בעקבות הפרוטוקול כאן לתאר ועם זמן קצר של אימונים, אפשר להעריך שישה פרמטרי hemodynamic בניסוי אחד שעבר כשעה.

השלבים הקריטיים של הפרוטוקול כאן מוצג הם cannulations של כלי דם. לגבי cannulation של עורק תרדמה, החתך מבוצע צריך להיות עמוק מספיק כדי לשבור את השלוש שכבות רקמה של העורק, וגדולות מספיק כדי לאפשר המעבר של קטטר. לגבי cannulation של וריד צוואר, בעוד שהסיכון לדימום נמוך, האפשרות של חסימת וריד היא גבוהה. לפיכך, דירות פרוטוקול שפע נתקעה על סטנדרטיזציה של האסטרטגיה לסחוב בשימוש.

כדי למזער את ההשפעה של אפקט הדיכאון של הרדמה, היפותרמיה והיפוקסיה יש למנוע ובמידת צורך, correcטד. קצב נשימה צריך לשמור סדיר בגלל נשימות עמוקות או לא סדירות משפיעות על הקלטת LVP.

מינוני Dobutamine משמשים צריכים להיות מותאמים על פי: i) תוואי הממשל (וריד: 0.5-40 ng / g / דקות ^7,8; intraperitoneally: 1-1.5 מיקרוגרם / g / דקות ^9,10), ii) בסדר הגודל של לב תפקוד וiii) ethiology של שינוי לב.

ואחרון אחרון חביב, שלוש עצות מעשיות: א) בחיות עם רקמת שומן בשפע סביב וריד הצוואר, לאפשר כמות קטנה של דם לצאת, על מנת לזהות את גבולות החתך; ii) לשמור על אזור העבודה להרטיב בגלל הליך cannulation הוא פשוט כאשר הצנתר משומן היטב; iii) תיוג הצנתר מאפשר ההדמיה שלה מתחת למיקרוסקופ.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Reagents
PE-50/10	Warner Instruments	64-0752
Silk thread 6/0 HR17	Tagum	SN0713K
Xylacin 20 mg/ml	Laboratorio Centrovet
Ketamine 100 mg/ml	Drag Pharma
Sodium chloride 0.9%	Lab Sanderson S.A.
Dobutamine hydrochloride	Sigma-Aldrich	D0676
Syringe U-100 Insulin 29G x ½"	Terumo Medical Co.
Forceps Dissecting Micro 11.5 cm Style 7	Lawton Medizintechnik	09-0959
Graefe Forceps Cvd 0.7mm 7cm	Lawton Medizintechnik	62-0263
Clamps Dieffenbach bulldog Cl Str 38 mm	Lawton Medizintechnik	60-010
Vannas Scissors 8 cm Str Fh	Lawton Medizintechnik	63-1400
Equipment
SPR-671 MiKro-Tip Pressure catheter	Millar instruments	840-6719
PCU-2000 Pressure Control Unit	Millar instruments	880-0129
PowerLab 4/30	ADinstruments Pty Ltd.	ML866
LabChartPro 7	ADinstruments Pty Ltd.	MLU260/7
Legato200 Infusion Pump	KdScientific	KD-KDS210P
TCAT-2LV Temperature controller and isothermal heating plate	PhysiTemp instruments Inc.
Medical Oxygen supply	Indura
Rectal probe	ADinstruments Pty Ltd.	MLT1404
Trinocular microscope, axial illumination	LW Scientific	Z2B-TRI-ETNE, ILP-1502-LTS1, ILP-1502-DGGF