Stress Test cardiaca indotta da dobutamina e monitorato da cateterizzazione cardiaca nei topi

Summary

Descriviamo il protocollo di eseguire un test di stress cardiaco indotto da dobutamina e monitorato da cateterizzazione cardiaca in topi normali. Inoltre ci mostra la sua applicazione per smascherare subclinica cardiopatia in alto contenuto di grassi topi obesi indotta dalla dieta.

Abstract

Dobutamina è un β-adrenergico con un'affinità maggiore per il recettore espresso nel cuore (β ₁₎ rispetto ai recettori espressi nelle arterie (β _2). Quando somministrato per via sistemica, aumenta la domanda cardiaca. Così, dobutamina smaschera ritmo anormale o aree ischemiche potenzialmente a rischio di infarto.

Monitoraggio della funzione cardiaca durante una prova da sforzo può essere eseguita sia ecocardiografia o cateterizzazione cardiaca. Quest'ultima è una tecnica invasiva ma più accurate e informative che il primo.

Test di stress cardiaco indotto da dobutamina e monitorato da cateterismo cardiaco realizzato come qui descritto consente, in un singolo esperimento, la misurazione dei seguenti parametri emodinamici: frequenza cardiaca (HR), la pressione sistolica, pressione diastolica, pressione telediastolica, massima pressione positiva sviluppo (dP / dtmax) e la massima stampa negativaure sviluppo (dP / dt _min), in condizioni basali e in dosi crescenti di dobutamina.

Come previsto, in topi normali, abbiamo osservato una dobutamina aumento dose-correlato in HR, dP / dt _max e dP / dt _min. Inoltre, alla massima dose testata (12 ng / g / min), lo scompenso cardiaco di alto contenuto di grassi topi obesi indotta dalla dieta è stato smascherato.

Protocol

Protocollo è stato approvato dal Comitato Etico di Medicina Clinica Alemana Facultad de-Universidad del Desarrollo.

I. Preparazione infusione di dobutamina

1. Sciogliere 10 mg di dobutamina in 20 ml di acqua distillata sterile, per ottenere una soluzione stock di 500 ug / ml dobutamina. Aliquotare e conservare a -20 ° C. Questa soluzione può essere utilizzata per almeno 3 mesi.
2. Scongelare una aliquota di soluzione di dobutamina a temperatura ambiente.
3. Diluire la soluzione stock in dobutamina sterile 0,9% NaCl, per ottenere dobutamina soluzione di lavoro, la cui concentrazione è calcolata utilizzando la formula: dobutamina (pg / ml) = peso corporeo x 0,2.
4. Riempire una siringa da 1 ml 29Gx1 / 2 "con dobutamina soluzione di lavoro.
5. Inserire l'ago della siringa in un cm 20 PE-10 tubo.
6. Regolare la siringa nella pompa per infusione seguendo le istruzioni del produttore.
7. Impostare la rampa di infusione in una fase-Al passaggio formato con un aumento di 10 microlitri / min per ogni passo, per 6 passaggi.

II. Preparazione Sensore di pressione

1. Per minimizzare la deriva del segnale, sensore di pressione immergere in acqua sterile a 37 ° C per almeno 15 min. Non bagnare il catetere più di 0,5 cm di profondità, per evitare che la pressione idrostatica colpisce il sensore di pressione.
2. Elettronicamente calibrare il sensore di pressione 25 e 100 mmHg. Elettrico di ingresso (Volt) viene convertito in segnale di pressione (mmHg).
3. Impostare la frequenza di campionamento di 2 k / s e usare il filtro passa basso con un cut-off a 100 Hz. Segnale di pressione impostato a zero mmHg.
4. Segna da 15 mm dalla punta del catetere. Distante per raggiungere il cuore dal punto di introduzione è stato stimato mediante ecocardiografia, rilevando la presenza del catetere nel ventricolo sinistro.

III. Preparazione del mouse per il cateterismo

1. Peso C57BL / 6 topi maschi, settimane di età 30-32.
2. Iniettare per via intraperitoneale 60 mg / kg di ketamina e 4 mg / kg xilazina ^1. Nota: altri anestetici potrebbero essere utilizzati, ad esempio: 350-450 mg / kg avertin, 50 ug / kg pentobarbital o 1,5 - 2% ^2-3 isoflurano.
3. Shave il collo con un rasoio elettrico.
4. Posizionare il mouse anestetizzato in posizione supina su una piastra riscaldata riscaldamento isotermico. Fissare le sue membra con nastro di carta.
5. Eseguire un pizzico punta per confermare sedazione completa.
6. Inserire delicatamente una sonda rettale per controllare la temperatura del corpo. Utilizzando la sonda vaselinized è raccomandato.
7. Se la temperatura del corpo diversa da 37 ° C ± 0,5 ° C, regolarlo mediante la piastra riscaldante.
8. Mettere muso mouse vicino l'apporto di ossigeno.
9. Posizionare la regione del collo del mouse con lo stereomicroscopio.

IV. Acquisizione dei dati

1. Nel software 7 LabChartPro, selezionare un canale per la registrazione della pressione e un canale per la frequenza cardiaca (HR)registrazione. Per questi ultimi, selezionare l'opzione "Misurazioni cicliche" e misura impostato come frequenza.
2. Per il canale di pressione impostano la scala: da 0 a 150 mmHg.
3. Per HR canale impostato Scala: da 200 a 600 bpm.
4. Premere il tasto di avvio per iniziare la registrazione.
5. Inserire i commenti che indicano le procedure eseguite, ad esempio: la somministrazione dell'anestesia, l'inizio della infusione di dobutamina, dobutamina concentrazione, la respirazione cambia.

V. cateterismo cardiaco ^4,5

1. Eseguire una piccola incisione sul lato destro vicino alla mascella. Con le forbici separare la pelle-muscolare del tessuto connettivo.
2. Eseguire una dissezione longitudinale (1,5 - 2 cm) sul lato destro della trachea. Separare il tessuto connettivo, grasso e muscolare con pinze curve, in modo da esporre la carotide destra vicino alla trachea.
3. Inserire un espansore nel lato destro animale per esporre la carotide. Pulsatilepressione generata dal cuore facilita l'identificazione dell'arteria. La vena giugulare, che è rosso scuro, è sulla destra.
4. Separare l'arteria dai tessuti adiacenti con pinze curve. Il nervo vago, che assomiglia a un filo bianco, si trova lungo l'arteria.
5. Tagliare un pezzo 20 cm 6/0 filo di seta e "doppio" di esso.
6. Passare il filo "doppio" sotto l'arteria da sinistra a destra. Tagliare il filo, in modo da ottenere le estremità separate.
7. Passa un terzo filo (10 cm) sotto l'arteria.
8. Un nodo stretto nel thread posizionato vicino alla testa, e uno sciolto nel filo più distale.
9. Fare un nodo sciolto nel thread mezzo, e fissare l'estremità destra del filo centrale per il pad di riscaldamento con un nastro di carta.
10. Tenere carotide umido facendo cadere sterile 0,9% NaCl. Asciugare l'eccesso di liquido con bastoncini di cotone.
11. Tendere il filo inferiore con una fascetta pinza emostatica.
12. Fissare la posizione della forbice hemostat da pinching la pelle dell'addome, estende il filo superiore, per occludere il flusso sanguigno. Verificare che il tessuto connettivo intorno all'arteria è stato rimosso. L'arteria dovrebbe essere pieno di sangue e privo di pulsazioni. Impedire fili da produrre una forza di coppia sulla arteria.
13. Realizzare una sezione trasversale nick vicino al fondo della arteria con un micro-Vannas forbice. Gocce di sangue sarà versato.
14. Inserire il catetere nell'arteria carotide. Assicurarsi di introdurre l'intero sensore di pressione. Verificare che non vi è perdita di sangue.
15. Regolare delicatamente il nodo centrale filo, per mantenere il catetere in posizione. Non comprimere troppo, il sensore di pressione è molto fragile.
16. Rilasciare le forbici hemostat dall'addome animale.
17. Tenere il catetere con la mano e spingere il filo centrale, al fine di evitare la perdita di sangue. Nota: arteria dovrebbe essere pieno di sangue.
18. Avviare segnali di pressione di registrazione.
19. Quando il catetere è all'interno, lasegnale di pressione arteriosa oscilla 60-70 a 100-120 mmHg. La forma del segnale di pressione è mostrato nella Figura 1.A. Nota: se siete interessati a, a questo punto nel tempo è possibile registrare la pressione arteriosa se ​​il segnale è stabile per almeno 5 min. HR valori sono stati ottenuti dalle forme d'onda di pressione considerando un intervallo di 30 secondi di segnale di registrazione. È possibile utilizzare anche un metodo ECG per la misura diretta di HR, in accordo con gli obiettivi di indagine.
20. Spingere delicatamente il catetere fino ad osservare una variazione della forma del segnale di pressione (Figura 1 B). Una volta che il catetere è all'interno del ventricolo sinistro, il segnale di pressione oscilla da 0 a 100-120 mmHg. Se è difficile far scorrere il catetere, pizzicare petto animale con due dita.
21. Continuo controllo della frequenza respiratoria, temperatura corporea, livello di anestesia e segnale di pressione. Tutti loro dovrebbero rimanere stabili.

VI. L'infusione di Dobutamina

1. Introdurre un PE-10 tubo nella vena. Verificare che il flusso di sangue non è bloccato spostando all'indietro lo stantuffo della siringa.
2. Infusione di dobutamina inizia con 10 microlitri / min e finire con 60 microlitri / min. In ogni passo, la velocità di infusione viene mantenuta per 2 min ^6.
3. Dopo la dose di dobutamina ultimo, l'eutanasia l'animale con una overdose di anestesia.

VII. Analisi dei dati

1. Per l'analisi dei dati, scegliere la sezione dei dati registrati di tuo interesse. Essere sicuri di prendere in considerazione un intervallo di tempo in cui il segnale di pressione è stabile.
2. Selezionare l'icona di installazione nel modulo di pressione sanguigna. Indicare il tipo selezionato di segnale di pressione.
3. Automaticamente le 7 display software LabChartPro dire, massimavalori minimi e per HR, pressione sistolica (P _max), la pressione diastolica (P _min), pressione telediastolica (EDP), massimo sviluppo a pressione positiva (dP / dtmax) e la massima pressione negativa sviluppo (dP / dt _min). Inoltre, i parametri cardiaci può essere raffigurato sulla traccia di pressione.

Representative Results

Il segnale di pressione arteriosa è definita da pressione sistolica e diastolica. Quando il sensore di pressione è all'interno del ventricolo sinistro, la sua pressione (LVP) della forma d'onda è caratterizzata da una caduta a zero della pressione diastolica e l'aspetto della contrazione atriale sinistra prima contrazione ventricolare (Figura 1). In condizioni originarie, topi anestetizzati ketamina-xilazina normali aveva HR di 280 ± 24, P _max di 107 ± 8, P _min di 5 ± 1, EDP di 14 ± 2, dP / dt _max di 6081 ± 365 e dP / dt _min di 5230 ± 526.

Come si vede in figura 2, in topi normali LVP e HR progressivamente aumentato lungo infusione di dobutamina, e normalizzato dopo l'arresto dell'infusione. Come previsto, tutti i parametri emodinamici valutati anche aumentata in dobutamina dose-dipendente (Figura 3). Così, cronotropa dobutamina (aumento HR) e positivo in otropic (LVP e dP / dt _{max aumentano)} gli effetti sono evidenziate.

Rispetto ai topi normali, in alto contenuto di grassi topi obesi indotta dalla dieta abbiamo osservato un aumento inferiore di risorse umane e dP / dt _max quando lo stress cardiaco è indotta, è stata statisticamente significativa alle più alte dosi testate dobutamina (Figura 4). Queste differenze non sono state osservate in condizioni basali (0 ng / g / min).

Figura 1. Arterioso (A) e ventricolare (B) pressione registra ottenuto dopo cateterizzazione di topi normali. Parametri emodinamici sono stati determinati da rappresentative LVP cicli temporali vs cardiaci. Dati rappresentativi di 5 animali. Clicca qui per ingrandire la figura .

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Figura 2. LVP (A) e HR (B) registra durante infusione di dobutamina in topi normali. Dati rappresentativi di 5 animali.

Figura 3. HR (A), LVP (B), dP / dt _max (C) e dP / dt _min (D) cambia durante infusione di dobutamina in topi normali. I dati sono espressi come media ± SEM. n = 5

Figura 4. HR (A) e dP / dt _max (B) cambia durante infusione di dobutamina in normale ed alta grassi topi obesi indotta dalla dieta. I dati sono espressi come media ± SEM. * = P <0.05, n = 5

Discussion

Stress test cardiaco indotto da dobutamina e monitorato da cateterismo cardiaco è laborioso. Tuttavia, secondo il protocollo qui descritto e con un breve tempo di formazione, è possibile valutare sei parametri emodinamici in un singolo esperimento che durano circa un'ora.

Le fasi critiche del protocollo qui presentati sono i cannulazioni di vasi sanguigni. Per quanto riguarda la cannulazione della carotide, l'incisione effettuata deve essere sufficientemente profonda per rompere i tre strati di tessuto dell'arteria, e abbastanza grandi da permettere il passaggio del catetere. Per quanto riguarda la cannulazione della vena giugulare, mentre il rischio di sanguinamento è basso, la possibilità di occlusione venosa è alta. Così, ripetibilità protocollo si blocca ampiamente sulla standardizzazione della strategia nick utilizzato.

Per minimizzare l'impatto dell'effetto depressivo dell'anestesia, ipotermia e ipossia dovrebbe essere impedito e, se necessario, correzioneted. Ritmo respiratorio deve essere mantenuto il più regolare, perché la respirazione profonda o irregolare colpisce registrazione LVP.

Dosi di dobutamina utilizzati deve essere regolata in base alla: i) la via di somministrazione (per via endovenosa: da 0,5 a 40 ng / g / min ^7,8; intraperitoneale: 1-1,5 mg / g / min ^9,10), ii) entità della cardiaca disfunzione e iii) eziologia di alterazione cardiaca.

E, ultimo ma non meno importante, tre consigli pratici: i) in animali con abbondante tessuto adiposo che circonda la vena giugulare, permettono una piccola quantità di sangue di uscire, al fine di individuare i confini di incisione; ii) mantenere l'area di lavoro inumidire perché il procedura di incannulamento è semplice quando il catetere è ben lubrificata; iii) codifica il catetere facilita la sua visualizzazione sotto il microscopio.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Reagents
PE-50/10	Warner Instruments	64-0752
Silk thread 6/0 HR17	Tagum	SN0713K
Xylacin 20 mg/ml	Laboratorio Centrovet
Ketamine 100 mg/ml	Drag Pharma
Sodium chloride 0.9%	Lab Sanderson S.A.
Dobutamine hydrochloride	Sigma-Aldrich	D0676
Syringe U-100 Insulin 29G x ½"	Terumo Medical Co.
Forceps Dissecting Micro 11.5 cm Style 7	Lawton Medizintechnik	09-0959
Graefe Forceps Cvd 0.7mm 7cm	Lawton Medizintechnik	62-0263
Clamps Dieffenbach bulldog Cl Str 38 mm	Lawton Medizintechnik	60-010
Vannas Scissors 8 cm Str Fh	Lawton Medizintechnik	63-1400
Equipment
SPR-671 MiKro-Tip Pressure catheter	Millar instruments	840-6719
PCU-2000 Pressure Control Unit	Millar instruments	880-0129
PowerLab 4/30	ADinstruments Pty Ltd.	ML866
LabChartPro 7	ADinstruments Pty Ltd.	MLU260/7
Legato200 Infusion Pump	KdScientific	KD-KDS210P
TCAT-2LV Temperature controller and isothermal heating plate	PhysiTemp instruments Inc.
Medical Oxygen supply	Indura
Rectal probe	ADinstruments Pty Ltd.	MLT1404
Trinocular microscope, axial illumination	LW Scientific	Z2B-TRI-ETNE, ILP-1502-LTS1, ILP-1502-DGGF