Cardiac Stress Test indusert av Dobutamine og overvåkes av Hjertekateterisering i Mus

Summary

Vi beskriver protokollen til å utføre en hjertestans stresstest indusert av dobutamin og overvåkes av hjertekateterisering i normale mus. Også vi vise sin søknad for å avsløre subklinisk hjertesykdom i fettrik diett-indusert overvektige mus.

Abstract

Dobutamin er en β-adrenerg agonist med en affinitet høyere for reseptor uttrykt i hjertet (β ₁₎ enn for reseptorer uttrykt i arteriene (β _2). Når systemisk administrert, det øker kardial etterspørsel. Dermed avslører dobutamin unormal rytme eller iskemiske områder som potensielt i fare for hjerteinfarkt.

Overvåking av hjertefunksjonen under en hjertestans stresstest kan utføres av enten ecocardiography eller hjertekateterisering. Sistnevnte er en invasiv men mer nøyaktig og informativt teknikk som den førstnevnte.

Cardiac stresstest indusert av dobutamin og overvåkes av hjertekateterisering utført som beskrevet her gjør, i ett enkelt eksperiment, måling av følgende hemodynamiske parametre: hjertefrekvens (HR), systolisk trykk, diastolisk trykk, ende-diastolisk trykk, maksimal overtrykk utvikling (dP / dtmax) og maksimal negativ presseure utvikling (dP / dt _min), ved baseline forhold og under økende doser av dobutamin.

Som forventet, i normale mus observerte vi en dobutamin doserelatert økning i HR, dP / dt _max og dP / dt _min. Videre, på høyeste dose testet (12 ng / g / min) hjerte dekompensasjon av fettrik diett-indusert overvektige mus ble avslørt.

Protocol

Protokoll ble godkjent av Etisk komité Facultad de Medicina Clinica Alemana-Universidad del Desarrollo.

I. Forbereder Dobutamine Infusion

1. Oppløs 10 mg av dobutamin i 20 ml sterilt distillated vann, for å oppnå en stamløsning av 500 ug / ml dobutamin. Delmengde og oppbevar ved -20 ° C. Denne løsningen kan brukes på minst 3 måneder.
2. Tine en delmengde av dobutamin stamløsningen ved romtemperatur.
3. Fortynn dobutamin stamløsning i sterilt 0,9% NaCl, for å oppnå dobutamin arbeidsløsning som konsentrasjon beregnes med formelen: dobutamin (ug / ml) = kroppsvekt x 0,2.
4. Fyll en 1 ml sprøyte 29Gx1 / 2 "med dobutamin arbeider løsning.
5. Settes nålen sprøyten inn i en 20 cm PE-10 rør.
6. Juster sprøyten i infusjonspumpe etter produsentens instruksjoner.
7. Sett opp rampen infusjon i et trinn-Til-trinn format med en økning på 10 ul / min for hvert trinn, for 6 trinn.

II. Forbereder Trykksensor

1. For å minimere signal avdrift, dukke trykksensor i sterilt vann ved 37 ° C i minst 15 min. Ikke suge kateteret mer enn 0,5 cm dyp, for å forhindre at hydrostatiske trykket påvirker trykksensor.
2. Elektronisk kalibrere trykksensoren ved 25 og 100 mmHg. Elektrisk inngang (Volt) omdannes til trykksignalet (mmHg).
3. Still samplingsfrekvensen 2 k / s og bruk filteret low pass med en avskåret ved 100 Hz. Still press signal til null mmHg.
4. Marker kateteret 15 mm fra spissen. Fjernt til nå hjertet fra innledningen punktet ble estimert ved ekkokardiografi, påvisning av nærvær av kateteret inn i venstre ventricule.

III. Forbereder Mouse for Kateterisering

1. Vekt C57BL / 6 hannmus, 30-32 uker gamle.
2. Injiser intraperitonealt 60 ug / kg ketamin og 4 ug / kg xylazin ^1. Merknad: Andre bedøvelsesmidler kan bli brukt, for eksempel: 350 til 450 ug / kg Avertin, 50 ug / kg pentobarbital eller 1,5 - 2% isofluran ^2-3.
3. Barbere nakken med en elektrisk barbermaskin.
4. Plasser bedøvet mus i ryggleie på en warmed isotermisk varmeplaten. Sikre sine lemmer med papir tape.
5. Utfør en tå knipe for å bekrefte fullstendig sedasjon.
6. Forsiktig inn en rektal sonde å overvåke kroppstemperaturen. Bruke vaselinized probe anbefales.
7. Hvis kroppstemperatur avviker fra 37 ° C ± 0,5 ° C, justere den til varmeplaten.
8. Sett musen snute nær oksygentilførselen.
9. Plasser musen nakkeregionen under stereomikroskop.

IV. Data Acquisition

1. I LabChartPro 7-programvaren, velger en kanal for press registrering og én kanal for hjertefrekvens (HR)registrering. For sistnevnte, velger du alternativet "Sykliske målinger" og oppsett måling som rate.
2. For trykket kanalen satt skalaen: 0 til 150 mmHg.
3. For HR kanalen satt skala område: 200-600 bpm.
4. Trykk Start-tasten for å starte registreringen.
5. Sette inn kommentarer indikerer prosedyrer utført, for eksempel: anestesi administrasjon, start av dobutamin infusjon, dobutamin konsentrasjon, puste endringer.

V. Hjertekateterisering ^4,5

1. Utføre en liten snitt på høyre side nær kjeven. Med saks skille hud-muskel bindevev.
2. Utfør en langsgående disseksjon (1,5 - 2 cm) på høyre side av luftrøret. Separer bindevev, fett og muskel med buede pinsett for å eksponere den høyre karotidarterie nærheten luftrøret.
3. Plasser en ekspander i dyret høyre side for å eksponere halspulsåren. Pulsatiletrykket generert av hjertet forenkler identifiseringen av arterien. Halsvenen, som er mørk rød, er på høyre side.
4. Separer arterie fra tilstøtende vev med buede tang. Nervus vagus, som ligner en hvit tråd, ligger langs arterien.
5. Skjær en 20 cm stykke 6/0 silketråd og "dobbel" den.
6. Passere "dobbel" tråden under arterie fra venstre til høyre. Klipp tråden, for å oppnå separate ender.
7. Passere tredjedel tråd (10 cm) under arterien.
8. Tie en stram knute i tråden plassert i nærheten til hodet, og en løs en i mer distale tråden.
9. Knyt en løs knute i midten tråden, og fikse den høyre enden av midten tråden til varmeputen med et papir tape.
10. Hold carotisar fuktig ved å slippe steril 0,9% NaCl. Tørk av overflødig væske med bomullspinner.
11. Strekk undertråden med en hemostat klemme.
12. Bestem posisjonen av pinsetten scissor av pinching huden på magen, strekker overtråden for å occlude blodstrømmen. Kontroller at bindevev rundt arterien har blitt fjernet. Arterien skal være full av blod og fratatt puls. Beskytte gjenger fra å produsere et dreiemoment kraft på arterien.
13. Gjør en tverrsnitt nick nær bunnen av arterien med en Vännäs mikro-tannsett. Blood dråper vil bli smittet.
14. Inn katetret i halspulsåren. Pass på å innføre hele trykksensor. Kontroller at det ikke er blod tap.
15. Forsiktig justere den midterste tråden knute, for å holde kateteret på plass. Ikke komprimere for mye, er trykksensor svært skjøre.
16. Slipp pinsetten saks fra dyret magen.
17. Hold kateteret med hånden og skyv midterste tråden, for å unngå blodtap. Merk: arterien skal være full av blod.
18. Starte opptak trykksignaler.
19. Når kateteret er inne,arterietrykk signal svinger 60-70 til 100-120 mmHg. Formen på trykksignal er vist i figur 1.a. Merk: Hvis du er interessert i, på dette tidspunkt kan du spille arterietrykk hvis signalet er stabilt i minst 5 min. HR verdier ble innhentet fra trykket bølgeformer vurderer et intervall på 30 sek av posten signal. Det er mulig å bruke også et EKG fremgangsmåte for direkte måling av HR ifølge med etterforskningen mål.
20. Skyv kateteret opp å observere en endring i form av trykksignalet (figur 1.B). Når kateteret er på innsiden av venstre ventrikkel, svinger trykksignalet fra 0 til 100-120 mm Hg. Hvis det er vanskelig å skyve kateteret, klemme dyr brystet med to fingre.
21. Kontinuerlig kontrollere pustefrekvens, kroppstemperatur, anestesi nivå og trykksignal. Alle av dem skal være stabil.

VI. Infusjon av Dobutamin

1. Innføre en PE-10 rør inn i venen. Bekreft at blodstrømmen ikke er blokkert gå bakover sprøytestempelet.
2. Dobutamin infusjon starter med 10 pl / min og avslutt med 60 pl / min. I hvert trinn, er infusjonshastigheten opprettholdt i 2 min ^6.
3. Etter den siste dobutamin dose, avlive dyret med en overdose av anestesi.

VII. Dataanalyse

1. For dataanalyse, velger den delen av de registrerte data av interesse. Sørg for å vurdere et tidsintervall hvor trykksignal er stabil.
2. Velg Setup-ikonet i Blood Pressure modulen. Angi den valgte type press signal.
3. Automatisk LabChartPro 7 programvaren viser betyr, maksimumog minimumsverdier for HR, systolisk trykk (P _maks), diastolisk trykk (P _min), ende-diastolisk trykk (EDP), maksimal overtrykk utvikling (dP / dtmax) og maksimal negativ trykkutvikling (dP / dt _min). I tillegg kan kardiale parametere være avbildet på trykksiden sporingen.

Representative Results

Arterial trykksignal er definert av systolisk og diastolisk blodtrykk. Når trykksensoren er på innsiden av venstre ventrikkel, dets trykk (LVP) bølgeform er preget av en dråpe til null av det diastoliske trykket og utseendet av den venstre atriekontraksjonen før ventrikkel kontraksjon (figur 1). Ved studiestart tilstand, hadde ketamin-xylazin anesteserte normale mus HR på 280 ± 24, P _maks 107 ± 8, P _min av 5 ± 1, EDP av 14 ± 2, dP / dt _maks 6081 ± 365 og dP / dt _min av 5230 ± 526.

Som sett i figur 2, i normale mus LVP og HR gradvis økt langs dobutamin infusjon, og normalisert etter stans av infusjonen. Som forventet, vurderes alle de hemodynamiske parametrene økte også i en dobutamin doseavhengig måte (figur 3). Dermed dobutamin kronotrop (HR økning) og positiv i otropic (LVP og dP / dt _maks økning) effekter er dokumentert.

Sammenlignet med normale mus, i høy fett diett-indusert overvektige mus observerte vi en lavere økning av HR og dP / dt _maks når hjertestans stress indusert, vært statistisk signifikante på de høyeste dobutamin doser testet (figur 4). Disse forskjellene ble ikke observert ved baseline forhold (0 ng / g / min).

Figur 1. Arteriell (A) og ventrikulær (B) trykket registrerer oppnådd etter kateterisering av normale mus. Hemodynamiske parametre ble bestemt fra representative LVP mot tid hjertestans sykluser. Representative data av 5 dyr. Klikk her for å se større figur .

ent ">
Figur 2. LVP (A) og HR (B) registrerer under dobutamin infusjon i normale mus. Representative data av 5 dyr.

Figur 3. HR (A), LVP (B), dP / dt _maks (C) og dP / dt _min (D) forandringer under dobutamin infusjon i normale mus. Data er uttrykt som gjennomsnitt ± SEM. n = 5

Figur 4. HR (A) og dP / dt _maks (B) endringer i dobutamin infusjon i normal og høy fett diett-indusert overvektige mus. Data er uttrykt som gjennomsnitt ± SEM. * = P <0,05, n = 5

Discussion

Cardiac stresstest indusert av dobutamin og overvåkes av hjertekateterisering er arbeidskrevende. Likevel etter protokollen her beskrive og med en kort tid for trening, er det mulig å vurdere seks hemodynamiske parametere i en enkelt eksperiment som varer omtrent en time.

De kritiske trinnene i protokollen her presentert er cannulations av blodkar. Angående kanylering av karotis bør snittet utføres være dypt nok til å bryte de tre vevslag av arterien, og store nok til å tillate passasje av kateteret. Angående kanylering av halsvene, mens risikoen for blødning er lav, er muligheten for veneokklusjon høy. Dermed henger protokoll repeterbarhet rikelig med standardisering av sammenpressing strategien brukes.

For å minimere virkningen av den depressive effekt av anestesi, hypotermi og hypoksi bør forhindres, og hvis nødvendig, korrekted. Respiratory rytme bør holde jevnlig fordi dyp eller uregelmessig pust påvirker LVP opptak.

Dobutamine doser brukt bør justeres i henhold til den: i) tilførselsvei (intravenøst: 0,5 til 40 ng / g / min ^7,8; intraperitonealt: 1 til 1,5 ug / g / min ^9,10), ii) Størrelsen på kardial dysfunksjon og iii) ethiology av hjerte endring.

Og sist men ikke minst, tre praktiske råd: i) i dyr med rikelig fettvev rundt halsvenen, tillate en liten mengde blod å komme ut, for å detektere snittet grenser, ii) holde arbeidsområdet fukte fordi kanylering prosedyren er enklere når kateteret er godt smurt, iii) merking kateteret forenkler dens visualisering under mikroskopet.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Reagents
PE-50/10	Warner Instruments	64-0752
Silk thread 6/0 HR17	Tagum	SN0713K
Xylacin 20 mg/ml	Laboratorio Centrovet
Ketamine 100 mg/ml	Drag Pharma
Sodium chloride 0.9%	Lab Sanderson S.A.
Dobutamine hydrochloride	Sigma-Aldrich	D0676
Syringe U-100 Insulin 29G x ½"	Terumo Medical Co.
Forceps Dissecting Micro 11.5 cm Style 7	Lawton Medizintechnik	09-0959
Graefe Forceps Cvd 0.7mm 7cm	Lawton Medizintechnik	62-0263
Clamps Dieffenbach bulldog Cl Str 38 mm	Lawton Medizintechnik	60-010
Vannas Scissors 8 cm Str Fh	Lawton Medizintechnik	63-1400
Equipment
SPR-671 MiKro-Tip Pressure catheter	Millar instruments	840-6719
PCU-2000 Pressure Control Unit	Millar instruments	880-0129
PowerLab 4/30	ADinstruments Pty Ltd.	ML866
LabChartPro 7	ADinstruments Pty Ltd.	MLU260/7
Legato200 Infusion Pump	KdScientific	KD-KDS210P
TCAT-2LV Temperature controller and isothermal heating plate	PhysiTemp instruments Inc.
Medical Oxygen supply	Indura
Rectal probe	ADinstruments Pty Ltd.	MLT1404
Trinocular microscope, axial illumination	LW Scientific	Z2B-TRI-ETNE, ILP-1502-LTS1, ILP-1502-DGGF