Teste de estresse cardíaco induzido por dobutamina e Monitorado por cateterismo cardíaco em ratos

Summary

Nós descrever o protocolo para realizar um teste de estresse cardíaco induzido por dobutamina e monitorado por cateterismo cardíaco em ratos normais. Também vamos mostrar a sua aplicação para desmascarar doença cardíaca subclínica em alto teor de gordura da dieta induzida ratos obesos.

Abstract

A dobutamina é um agonista β-adrenérgico com uma afinidade mais elevada para o receptor expresso no coração (β ₁₎ do que para os receptores expressos nas artérias (β _2). Quando administrada sistemicamente, aumenta a procura cardíaca. Assim, dobutamina desmascara ritmo anormal ou áreas isquêmicas potencialmente em risco de infarto.

A monitorização da função cardíaca durante um teste de esforço cardíaco pode ser realizada por qualquer ecocardiografia ou a cateterização cardíaca. A última é uma técnica invasiva, mas mais preciso e informativo que a primeira.

Teste de esforço cardíaco induzido pela dobutamina e monitorizada por cateterismo realizado como descrito aqui permite, numa única experiência, a medição dos seguintes parâmetros hemodinâmicos: ritmo cardíaco (HR), pressão sistólica, pressão diastólica, a pressão diastólica final, a pressão positiva máxima desenvolvimento (dP / dtmax) e negativa da imprensa máximaure desenvolvimento (dP / dt _min), em condições basais e sob doses crescentes de dobutamina.

Como esperado, em camundongos normais foi observado um aumento relacionado com a dose de dobutamina em RH, dP / dt _max e dP / dt _min. Além disso, na maior dose testada (12 ng / g / min), a descompensação cardíaca de alto teor de gordura da dieta, os ratos obesos induzidos foi desmascarado.

Protocol

Protocolo foi aprovado pelo Comitê de Ética da Faculdade de Medicina Clínica Alemã-Universidade del Desarrollo.

I. Preparação infusão de dobutamina

1. Dissolvem-se 10 mg de dobutamina, em 20 ml de água destilada estéril, com o fim de se obter uma solução stock de 500 ug / ml de dobutamina. Alíquota e armazenar a -20 ° C. Esta solução pode ser utilizada, pelo menos, durante 3 meses.
2. Descongelar uma alíquota da solução de reserva de dobutamina, à temperatura ambiente.
3. Diluir solução-mãe de dobutamina em NaCl estéril 0,9%, a fim de obter a solução de trabalho de dobutamina, cuja concentração é calculada utilizando a fórmula: dobutamina (ug / ml) = peso corporal x 0,2.
4. Encha uma seringa 1 ml 29Gx1 / 2 "com solução de trabalho dobutamina.
5. Inserir a agulha da seringa para um tubo de 20 centímetros PE-10.
6. Ajuste a seringa na bomba de infusão, seguindo as instruções do fabricante.
7. Defina-se a infusão de rampa em uma etapa-A-passo com o formato de um aumento de 10 ul / min para cada etapa, de 6 passos.

II. Preparando sensor de pressão

1. Para minimizar a variação do sinal, o sensor de pressão submergir em água estéril a 37 ° C durante pelo menos 15 min. Não molhe o cateter mais de 0,5 cm de profundidade, de modo a evitar que a pressão hidrostática atinge o sensor de pressão.
2. Electronicamente calibrar o sensor de pressão a 25 e 100 mmHg. Eléctrico de entrada (Volt) é convertido em sinal de pressão (mmHg).
3. Definir a taxa de amostragem de 2 k / s e utilizar o filtro passa baixo com um corte de 100 Hz. Definir o sinal de pressão para zero mmHg.
4. Marcar o cateter 15 mm da ponta. Distante para alcançar o coração a partir do ponto de introdução foi estimada por ecocardiograma, detectando a presença do cateter no interior do ventrículo esquerdo.

III. Preparando Rato para cateterismo

1. Peso C57BL / 6, machos, 30-32 semanas de idade.
2. Injectar por via intraperitoneal de cetamina 60 mg / kg e 4 mg / kg de xilazina ^1. Nota: Outros anestésicos podem ser utilizados, por exemplo: 350-450 ug / kg avertina, 50 ug / kg de pentobarbital, ou 1,5-2% ^2-3 isoflurano.
3. Raspar o pescoço com um barbeador elétrico.
4. Posicione o mouse anestesiado em decúbito dorsal em uma placa de aquecimento aquecido isotérmica. Fixe seus membros com fita de papel.
5. Realizar uma pitada de igual para confirmar sedação completa.
6. Insira com cuidado a sonda retal para monitorar a temperatura do corpo. Usando sonda vaselinized é recomendada.
7. Se a temperatura do corpo difere de 37 ° C ± 0,5 ° C, ajusta-lo através da placa de aquecimento.
8. Coloque focinho de rato perto do suprimento de oxigênio.
9. Coloque a região do pescoço do rato, ao microscópio estereoscópico.

IV. Aquisição de Dados

1. Na 7 LabChartPro software, selecione um canal para registro de pressão e um canal para a freqüência cardíaca (FC)registro. Para este último, selecione a opção "Medidas cíclicos" e medição de configuração como taxa.
2. Para o canal de pressão definir a faixa de escala: 0 a 150 mmHg.
3. Para HR canal definir a faixa de escala: 200-600 bpm.
4. Pressione a tecla START para iniciar o registro.
5. Inserir comentários indicando procedimentos realizados, por exemplo: administração de anestesia, o início da infusão de dobutamina, a concentração de dobutamina, respirando alterações.

V. Cateterismo Cardíaco ^4,5

1. Realizar uma pequena incisão no lado direito, perto da mandíbula. Com uma tesoura separar o tecido conjuntivo da pele-muscular.
2. Realizar uma dissecção longitudinal (1,5-2 cm), no lado direito da traqueia. Separou-se a gordura do tecido conjuntivo, músculo e com fórceps curvo, de modo a expor a artéria carótida direita perto da traqueia.
3. Coloque um expansor no lado animal direito para expor a artéria carótida. Pulsátilpressão gerada pelo coração facilita a identificação da artéria. A veia jugular, que é vermelho escuro, está à direita.
4. Separou-se a artéria a partir de tecidos adjacentes com fórceps curvo. O nervo vago, que se assemelha a uma linha branca, fica ao longo da artéria.
5. Corte um pedaço de 20 cm de fio 6/0 e seda "double-lo".
6. Passe a linha "casal" sob a artéria da esquerda para a direita. Cortar o fio, a fim de obter extremidades separadas.
7. Passar por um terceiro segmento (10 cm) abaixo da artéria.
8. Dê um nó apertado no fio posicionado perto da cabeça, e um solto no segmento mais distal.
9. Dê um nó frouxo na linha do meio, e fixar a extremidade direita da linha média para a almofada de aquecimento com uma fita de papel.
10. Mantenha artéria carótida úmido, largando estéril NaCl 0,9%. Secar o excesso de líquido com cotonetes.
11. Estique a linha inferior com uma pinça hemostática.
12. Fixar a posição da tesoura pinça hemostática por pavançando a pele do abdómen, que se estende a linha de cima, a fim de ocluir o fluxo de sangue. Verificar que o tecido conjuntivo em torno da artéria foi removido. A artéria deve estar cheio de sangue e privados de pulso. Prevenir tópicos de produzir uma força de binário sobre a artéria.
13. Fazer uma secção transversal nick perto da parte inferior da artéria com um Vannas micro-tesoura. Gotas de sangue será derramado.
14. Inserir o cateter na artéria carótida. Certifique-se de introduzir o sensor de pressão inteiro. Verificar que não há perda de sangue.
15. Suavemente ajustar o nó rosca do meio, a fim de segurar o cateter no lugar. Não comprimir em demasia, o sensor de pressão é muito frágil.
16. Solte a tesoura hemostat do abdômen animal.
17. Segurar o cateter com uma mão e empurra o fio do meio, a fim de evitar a perda de sangue. Nota: artéria deve estar cheio de sangue.
18. Iniciar sinais de pressão de gravação.
19. Quando o cateter está dentro, osinal de pressão arterial oscila 60-70 a 100-120 mmHg. A forma do sinal de pressão é mostrada na Figura 1.A. Nota: se estiver interessado em diante, neste ponto do tempo é possível registar a pressão arterial se sinal é estável durante pelo menos 5 min. Valores de FC foram obtidos a partir das formas de onda de pressão, considerando um intervalo de 30 segundos de sinal de gravação. É possível utilizar também um método de ECG para a medição directa da AR, de acordo com os objectivos de investigação.
20. Suavemente empurrar o cateter se observar uma alteração na forma do sinal de pressão (Figura 1 B). Uma vez que o cateter está no interior do ventrículo esquerdo, o sinal de pressão varia de 0 a 100-120 mmHg. Se for difícil para deslizar o cateter, belisque peito animal com dois dedos.
21. Continuamente controlar a taxa de respiração, a temperatura corporal, o nível de anestesia e sinal de pressão. Todos eles devem permanecer estáveis.

VI. A infusão de dobutamina

1. Introduzir um tubo de PE-10 para dentro da veia. Confirmar que o fluxo de sangue não é bloqueado se movendo para trás o êmbolo da seringa.
2. A infusão de dobutamina começa com 10 ul / min e terminar com 60 ul / min. Em cada passo, a velocidade de perfusão é mantida durante 2 min ^6.
3. Após a última dose de dobutamina, sacrificar o animal com uma overdose de anestesia.

VII. Análise de Dados

1. Para análise dos dados, escolha a seção dos dados gravados de seu interesse. Certifique-se de considerar um intervalo de tempo em que o sinal de pressão é estável.
2. Selecione o ícone de configuração no módulo de Pressão Arterial. Indique o tipo selecionado de sinal de pressão.
3. Automaticamente os LabChartPro 7 software exibe média máxima,e os valores mínimos de RH, pressão arterial sistólica (P _max), pressão diastólica (P _min), pressão diastólica final (PDE), o desenvolvimento positivo pressão máxima (dP / dtmax) e desenvolvimento de pressão negativa máxima (dP / dt _min). Além disso, os parâmetros cardíacos podem ser representadas no traçado da pressão.

Representative Results

O sinal de pressão arterial é definida pela pressão sistólica e diastólica. Quando o sensor de pressão está no interior do ventrículo esquerdo, a sua pressão (LVP) da forma de onda é caracterizada por uma queda para zero da pressão diastólica, e o aparecimento da contracção do átrio esquerdo, antes de contracção do ventrículo esquerdo (Figura 1). No estado inicial, cetamina-xilazina anestesiados ratos normais tiveram de RH de 280 ± 24, P _máximo de 107 ± 8, P _min de 5 ± 1, a EDP, de 14 ± 2, dP / dt _max de 6081 ± 365 e dP / dt _min de 5230 ± 526.

Como pode ser visto na Figura 2, em ratos normais e LVP HR aumentou progressivamente ao longo de infusão de dobutamina e normalizado após a interrupção da infusão. Como esperado, todos os parâmetros hemodinâmicos avaliados também aumentou de uma forma dependente da dose de dobutamina (Figura 3). Assim cronotrópica, dobutamina (aumento da FC) e positivo em otropic (LVP e dP / dt aumento _max) efeitos são evidenciadas.

Em comparação com ratinhos normais, na dieta de alta gordura induzidas ratos obesos observou-se um aumento menor de HR e dP / dt _max de esforço cardíaco quando é induzida, foi estatisticamente significativa para as doses mais elevadas de dobutamina testados (Figura 4). Estas diferenças não foram observadas em condições basais (0 ng / g / min).

Figura 1. Arterial (A) e ventricular (B) de pressão regista obtida após cateterização de ratos normais. Os parâmetros hemodinâmicos foram determinados a partir de representação LVP ciclos vs tempo cardíacos. Dados representativos de 5 animais. Clique aqui para ver maior figura .

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Figura 2. LVP (A) e FC (B) registra durante a infusão de dobutamina em ratos normais. Os dados representativos de 5 animais.

Figura 3. HR (A), LVP (B), dP / dt _max (C) e dP / dt _min (D) alterações, durante a infusão de dobutamina em ratos normais. Os dados são expressos como média ± SEM. n = 5

Figura 4. HR (A) e dP / dt _max (B) alterações, durante a infusão de dobutamina em normal e alta de gordura da dieta induzida ratos obesos. Os dados são expressos como média ± SEM. * = P <0,05, n = 5

Discussion

Teste de estresse cardíaco induzido por dobutamina e monitorado por cateterismo cardíaco é trabalhoso. No entanto, seguindo o protocolo aqui descrever e com um curto tempo de formação, é possível avaliar a seis parâmetros hemodinâmicos numa única experiência que duram aproximadamente uma hora.

Os passos essenciais do protocolo aqui apresentado são as cânulas dos vasos sanguíneos. Em relação à canulação da artéria carótida, a incisão realizada deve ser profundo o suficiente para quebrar as três camadas de tecido da artéria, e grandes o suficiente para permitir a passagem do cateter. No que diz respeito a canulação da veia jugular, enquanto que o risco de hemorragia é baixa, a oclusão da veia é alta. Assim, repetibilidade protocolo amplamente paira sobre a padronização da estratégia nicking usado.

Para minimizar o impacto do efeito depressor da hipotermia anestesia e hipóxia devem ser evitadas e, se necessário, correcçãoTed. Ritmo respiratório deve ser manter regular, porque a respiração profunda ou irregular afeta gravação LVP.

Doses de dobutamina utilizados devem ser ajustados de acordo com a: i rota) de administração (intravenosa: de 0,5 a 40 ng / g / min ^7,8; intraperitoneal: 1 a 1,5 ug / g / min ^9,10), ii) a magnitude de cardíaco disfunção e iii) etiologia da alteração cardíaca.

E por último mas não menos importante, três conselhos práticos: i) em animais com o tecido adiposo abundante em torno da veia jugular, permitir que uma pequena quantidade de sangue a sair, de modo a detectar as bordas da incisão; ii) manter a zona de trabalho, porque a humedecer procedimento de canulação é mais simples quando o cateter está bem lubrificada; iii) a marcação de cateter facilita a sua visualização ao microscópio.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Reagents
PE-50/10	Warner Instruments	64-0752
Silk thread 6/0 HR17	Tagum	SN0713K
Xylacin 20 mg/ml	Laboratorio Centrovet
Ketamine 100 mg/ml	Drag Pharma
Sodium chloride 0.9%	Lab Sanderson S.A.
Dobutamine hydrochloride	Sigma-Aldrich	D0676
Syringe U-100 Insulin 29G x ½"	Terumo Medical Co.
Forceps Dissecting Micro 11.5 cm Style 7	Lawton Medizintechnik	09-0959
Graefe Forceps Cvd 0.7mm 7cm	Lawton Medizintechnik	62-0263
Clamps Dieffenbach bulldog Cl Str 38 mm	Lawton Medizintechnik	60-010
Vannas Scissors 8 cm Str Fh	Lawton Medizintechnik	63-1400
Equipment
SPR-671 MiKro-Tip Pressure catheter	Millar instruments	840-6719
PCU-2000 Pressure Control Unit	Millar instruments	880-0129
PowerLab 4/30	ADinstruments Pty Ltd.	ML866
LabChartPro 7	ADinstruments Pty Ltd.	MLU260/7
Legato200 Infusion Pump	KdScientific	KD-KDS210P
TCAT-2LV Temperature controller and isothermal heating plate	PhysiTemp instruments Inc.
Medical Oxygen supply	Indura
Rectal probe	ADinstruments Pty Ltd.	MLT1404
Trinocular microscope, axial illumination	LW Scientific	Z2B-TRI-ETNE, ILP-1502-LTS1, ILP-1502-DGGF