Summary
Biz dobutamin ile tetiklenen ve normal farelerde kalp kateterizasyonu tarafından izlenen bir kardiyak stres testi gerçekleştirmek için protokol açıklar. Ayrıca yüksek yağlı diyet bağlı obez farelerde subklinik kardiyak hastalık meydana çıkarmak için uygulama göstermektedir.
Abstract
Dobutamin arter (β 2) olarak ifade reseptörlerine göre kalp (β 1) olarak ifade reseptörü için yüksek bir afiniteye sahip bir β-adrenerjik agonistidir. Sistemik olarak uygulandığında, kardiyak tüketimini artırır. Böylece, dobutamin potansiyel enfarktüs riski anormal ritmi veya iskemik alanlar unmasks.
Bir kardiyak stres testi sırasında kalp fonksiyonlarının izlenmesi ekokardiyografi veya kalp kateterizasyonu da yapılabilir. İkincisi bu eski bir invaziv, ancak daha doğru ve bilgilendirici bir tekniktir.
Kalp atım hızı (KAH), sistolik basınç, diyastolik basınç, diyastol sonu basıncı, maksimal pozitif basınç: Kalp stres testi dobutamin ile tetiklenen ve burada açıklandığı gibi başarılı kardiyak kateterizasyon tarafından izlenen tek bir deneyde, aşağıdaki hemodinamik parametrelerin ölçümünde, izin geliştirme (dP / dtmax) ve maksimal olumsuz basınure geliştirme (dP / dt min), bazal şartlarda ve dobutamin artan dozlarda altında.
Beklendiği gibi, normal farelerin biz İK, dP / dt max ve dP / dt min bir dobutamin doza bağlı artış gözlendi. Ayrıca, en yüksek dozda, yüksek yağ içerikli diyet ile endüklenen aşırı şişman farelerde kalp dekompensasyon ortaya çıkmasından sonra (12 ng / g / dak) test edilmiştir.
Protocol
Protokol Facultad de Medicina Clinica Alemana-Universidad del Desarrollo ve Etik Komitesi tarafından onaylandı.
I. Dobutamin İnfüzyon hazırlamak
- 500 ug / ml dobutamin bir stok çözeltisi elde etmek için, steril distile su, 20 ml dobutamin 10 mg eritilir. -20 ° C'de kısım ve mağaza Bu çözelti 3 ay için en azından kullanılabilir.
- Oda sıcaklığında dobutamin stok çözeltisi bir kısım çözülme.
- Dobutaminin (ug / ml) = vücut ağırlığı x 0.2: formül kullanılarak hesaplanır konsantrasyon dobutamin çalışma çözeltisi, elde etmek için, steril% 0.9 NaCI içinde dobutamin stok çözeltisi seyreltilir.
- Dobutamin çalışma çözeltisi ile 1 ml şırınga 29Gx1 / 2 "doldurun.
- Bir 20 cm PE-10 tüp içine şırınga iğnesi yerleştirin.
- Üreticinin talimatları izleyerek infüzyon pompası şırınga ayarlayın.
- Bir adımda rampa infüzyon ayarlama6 adımlar için, her adım için 10 ul / dak artışla biçimi-to-adım.
II. Basınç Sensörü hazırlanması
- En az 15 dakika boyunca 37 ° C 'de steril su içinde sinyal kayması, batırmak basınç sensörü en aza indirilmesi. Bu hidrostatik basınç basınç sensörü etkiler önlemek için, daha fazla 0.5 cm derinliğinde kateter emmek etme.
- Elektronik 25 ve 100 mmHg basınç sensörü kalibre. Elektrik girişi (Volt) basınç sinyali (mmHg) dönüştürülür.
- 2 k / s örnekleme hızı ayarlayın ve 100 Hz'de kesilerek filtre alçak geçiren kullanın. Basınç sinyali sıfıra mmHg olarak ayarlayın.
- Sonda ucundan 15 mm işaretleyin. Giriş noktasından kalp ulaşmak için Distant sol ventrikül içine kateter varlığı tespit, ekokardiyografi ile tahmin edilmiştir.
III. Kateterizasyon için Fare hazırlanması
- Ağırlık C57BL / 6 erkek fareler, haftalık 30-32.
- Intraperitoneal 60 mg / kg ketamin ve 4 mg / kg ksilazin 1 enjekte edilir. Not: Diğer anestezikler, örneğin, kullanılan olabilir: 350 - 450 mg / kg avertin, 50 mikrogram / pentobarbital kg veya 1.5 - 2% izofluran 2-3.
- Elektrikli ustura ile boyun Tıraş.
- Isıtılmış bir izotermal ısıtma plakası üzerine sırtüstü pozisyonda anestezi fare yerleştirin. Kağıt bant ile bacaklarda sabitleyin.
- Tam sedasyon onaylamak için bir ayak tutam gerçekleştirin.
- Yavaşça vücut sıcaklığını izlemek için bir rektal prob yerleştirin. Vaselinized prob kullanılması önerilir.
- Vücut ısısı 37 farklıysa ° C ± 0.5 ° C, ısıtma plakası yoluyla ayarlayabilirsiniz.
- Oksijen kaynağı yakınında fare burun koyun.
- Stereomikroskop altında fare boyun bölgesinde yerleştirin.
IV. Veri Toplama
- LabChartPro 7 yazılımı, basınç kayıt için tek kanallı ve kalp hızı için bir kanal (İK) seçinkaydı. Ikincisi için, seçenek "Döngüsel Ölçümleri" ve hızı gibi kurulum ölçümü seçin.
- 0 ila 150 mmHg: basınç kanalı için ölçek aralığı ayarlayın.
- 200 ila 600 bpm For: HR kanal ölçek aralığı ayarlayın.
- Kayıt başlamak için start tuşuna basınız.
- Prosedürleri, örneğin yapılan gösteren yorumlarla takın: anestezi yönetimi, değişiklikler solunum, dobutamin infüzyonu, dobutamin konsantrasyon başlar.
V. Kalp Kateterizasyonu 4,5
- Çene yakın sağ tarafında küçük bir kesi yapın. Makas deri-kas bağ dokusu ayırmak ile.
- Trakeanın sağ tarafta - bir uzunlamasına diseksiyon (2 cm 1.5) gerçekleştirin. Trakea yakınındaki sağ karotis arter ortaya koymak için, kavisli bir forseps ile bağ dokusu, yağ ve kas ayırın.
- Karotis arter maruz hayvan sağ tarafına bir genişletici yerleştirin. Vurmalıkalp tarafından oluşturulan basınç arter tarafından bulunması kolaylaşmaktadır. Koyu kırmızı juguler ven, sağ tarafta.
- Kavisli bir forseps ile bitişik dokulardan arter ayırın. Bir beyaz ipliği andıran vagus siniri, arter boyunca yatıyor.
- 6/0 ipek iplik ve "çift" bir 20 cm parça kesin.
- Soldan sağa arter altındaki "çift" iplik geçirin. Ayrı ayrı uçları elde etmek için, iplik kes.
- Arter altında üçüncü bir iş parçacığı (10 cm) Min.
- Başlığına yakın konumlandırılmış parçacığı sıkı bir düğüm ve daha distal iplik gevşek bir tek bağla.
- Orta iplik gevşek bir düğüm ve bir kağıt bant ile ısıtma pedi için orta iplik sağ ucunu sabitleyin.
- Steril% 0.9 NaCl bırakarak karotis arter nemli tutun. Pamuk tomurcukları ile sıvı aşırı kurumasını bekleyin.
- Bir hemostat klemp ile alt iplik gerin.
- P hemostat makas konumunu saptamakkan akışı tıkamak için, karın derisi Santimleme üst iplik germe. Arter çevresinde bağ dokusu çıkarıldığından emin olun. Arter kan dolu ve nabız yoksun olmalıdır. Arter üzerinde bir tork kuvveti üreten Konuları önleyin.
- Bir Vannas mikro-makas ile arterin alt kısmına yakın bir kesit nick olun. Kan damlaları dökülen edilecektir.
- Karotis arter içine kateter yerleştirin. Tüm basınç sensörü tanıtmak için emin olun. Hiçbir kan kaybı olduğunu doğrulayın.
- Nazikçe yerinde tutmak kateter için, orta düğüm iplik ayarlayın. Çok fazla sıkıştırmak etmeyin, basınç sensörü çok kırılgandır.
- Hayvanın karın hemostat makas bırakın.
- Kan kaybını önlemek için, el ile kateter tutun ve orta iplik itme. Not: arter kan dolu olmalıdır.
- Kaydı basınç sinyalleri başlayın.
- Kateter içinde olduğunda,arteriyel basınç sinyali 60-70 100-120 mmHg dalgalanır. Basıncı sinyalinin şekli Şekil 1.A. Not gösterilmiştir: Eğer ilgilenen varsa sinyal en az 5 dakika boyunca sabit ise, bu kez noktada arter basıncı kaydedebilirsiniz. HR değerleri kayıt sinyali 30 saniye arayla dikkate basınç dalga elde edilmiştir. Bu soruşturma hedefleri doğrultusunda, İK doğrudan ölçümü için de bir EKG yöntemi kullanmak mümkündür.
- Yavaşça basınç sinyali (Şekil 1.B) şeklinde bir değişiklik gözlemlemek için kateter yukarıya doğru itilir. Kateter sol ventrikül içine sonra, basınç sinyali 0 100-120 mmHg dalgalanır. Bu kateter kaydırın zor ise, iki parmak ile hayvan göğüs çimdik.
- Sürekli nefes hızı, vücut ısısı, anestezi seviyesi ve basınç sinyalini kontrol. Hepsi de sabit kalmalıdır.
VI. Dobutamin infüzyonu
- Damar içine PE-10 tüp tanıtın. Kan akımı onaylayın geriye şırınganın pistonu hareket engellenmez.
- Dobutamin infüzyonu 10 ul / dk ile başlar ve 60 ul / dk ile bitiriyoruz. Her adımda, infüzyon hızı 2 dakika 6 için korunur.
- Son dobutamin dozdan sonra, anestezi, bir doz aşımı ile hayvan ötenazi.
VII. Veri Analizi
- Veri analizi için, ilgi kayıtlı veri bölümünü seçin. Basınç sinyali stabil olduğu bir zaman aralığı dikkate aldığınızdan emin olun.
- Kan Basıncı modülü Kurulum simgesini seçin. Basıncı sinyalinin seçilen türü belirtin.
- Otomatik LabChartPro 7 yazılımı görüntüler demek, maksimumve HR için minimum değerler, sistolik basıncı (P max), diyastolik kan basıncı (P min), diyastol sonu basıncı (EDP), maksimal pozitif basınç gelişimi (dP / dtmax) ve maksimal negatif basınç gelişimi (dP / dt min). Buna ek olarak, kalp parametrelerini basınç izleme üzerinde tasvir edilebilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Arteriyel basınç sinyali sistolik ve diyastolik kan basıncı ile tanımlanır. Basınç sensörü sol ventrikül içinde olduğunda, onun basınç (LVP) dalga diyastolik basınç sıfır bir damla ve ventrikül kasılma öncesinde sol atriyal kasılma (Şekil 1) ile karakterizedir. Mevcut durum, ketamin-ksilazin anestezisi normal farelerin 280 HR ± 24, 107 P maks ± 8, 5 P dk ± 1, 14 ± 2 EDP, dP / 6081 dt max ± 365 ve dP / dt min vardı 5230 ± 526.
Şekil 2'de görüldüğü gibi, normal farelerdeki LVP ve İK giderek dobutamin infüzyonu birlikte artmıştır ve infüzyon kesildikten sonra normale döndü. Beklendiği gibi, her hemodinamik parametreler de bir dobutamin doza-bağlı bir şekilde (Şekil 3) de artış değerlendirildi. Bu nedenle, dobutamin kronotropik (HR artış) ve pozitif olarak otropic (LVP ve dP / dt max artış) etkileri kanıtlanmıştır.
Kardiyak stres (Şekil 4) test edilen en yüksek dobutamin dozunda istatistiksel olarak anlamlı, indüklenen zaman yüksek yağlı diyete bağlı obez farelerde İK ve dP / dt max daha düşük bir artış gözlendi, normal fareler ile karşılaştırıldığında. Bu farklılıklar temel koşulları (0 ng / g / dk) görülmedi.
Şekil 1. Arteriyel (A) ve ventriküler (B) basınç normal farelerin kateter sonra elde edilen kaydeder. Hemodinamik parametreler temsilcisi LVP vs zaman kardiyak döngü belirlenmiştir. 5 hayvanların Örnek verileri. büyük bir rakam görmek için buraya tıklayın .
Şekil 2.. LVP (A) ve HR (B) normal farelerdeki dobutamin infüzyonu sırasında kaydeder. 5 hayvanların Temsilcisi verileri.
Şekil 3. HR (A), LVP (B), dP / dt max (C) ve dP / dt min (D) normal farelerdeki dobutamin infüzyonu sırasında değişir. Veriler ortalama ± SEM olarak ifade edilmiştir. n = 5
Şekil 4. HR (A) ve normal ve yüksek yağlı diyetle indüklenen obez farelerde dobutamin infüzyonu sırasında dP / dt max (B) değişiklikler. Veriler ortalama ± SEM olarak ifade edilmiştir. * = P <0.05, n = 5
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Dobutamin ile tetiklenen ve kardiyak kateterizasyon ile takip Kalp stres testi zahmetli. Bununla birlikte, burada protokolü takip tanımlamak ve eğitim kısa bir süre ile, tek bir deneyde geçen yaklaşık bir saat içinde altı hemodinamik parametreleri değerlendirmek mümkündür.
Sunulan burada protokol kritik adımlar kan damarlarının cannulations vardır. Karotid arter kanülasyonu ile ilgili olarak, yapılan kesi üç doku arter katmanları, ve kateter geçişine izin vermek için yeterince büyük kırmak için yeterince derin olmalıdır. Kanama riski düşük ise, juguler venin kanülasyonu ile ilgili olarak, damar tıkanıklığı olasılığı yüksektir. Böylece, protokol tekrarlanabilirlik fazlasıyla kullanılan nickleme stratejinin standardizasyon asılı.
Anestezi, hipotermi ve hipoksi depresif etkinin etki önlenmelidir en aza indirmek ve, gerekirse, düzeltmesi için,ted. Derin veya düzensiz nefes LVP kayıt etkiler çünkü Solunum ritmi düzenli tutmak gerekir.
1 ila 1.5 mikrogram / g / dk 9,10), ii) kalp büyüklüğü:;: yönetim i) yolu (intravenöz: intraperitoneal 0,5-40 ng / g / dk 7,8 kullanılan Dobutamin dozu göre ayarlanmalıdır kardiyak alterasyon disfonksiyon ve iii) etyolojisi.
Ve son ama en az değil, üç pratik tavsiyeler: i) şahdamarından çevreleyen bol yağ dokusu olan hayvanlar, insizyon sınırları tespit etmek için, çıkıp kan küçük bir miktar izin ii) çalışma alanı nemlendirin tutmak çünkü kanülasyon prosedürü kateter iyi yağlanmış zaman basittir; iii) etiketleme kateteri mikroskop altında görüntülenmesini kolaylaştırır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Çıkar çatışması ilan etti.
Acknowledgments
Biz Dr Helio Salgado, Renata Lataro ve Mauro de Oliveira, kurulum işlemini sırasında cömert yardım için Ribeirão Preto, Sao Paulo ve Dr Ben Janssen, Kardiyovasküler Araştırma Enstitüsü Maastricht, Maastricht Üniversitesi, Üniversitesi Tıp Fakültesi ederim.
Bu çalışma SDC FONDECYT hibe N ° 11090114 tarafından desteklenmiştir
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagents | |||
| PE-50/10 | Warner Instruments | 64-0752 | |
| Silk thread 6/0 HR17 | Tagum | SN0713K | |
| Xylacin 20 mg/ml | Laboratorio Centrovet | ||
| Ketamine 100 mg/ml | Drag Pharma | ||
| Sodium chloride 0.9% | Lab Sanderson S.A. | ||
| Dobutamine hydrochloride | Sigma-Aldrich | D0676 | |
| Syringe U-100 Insulin 29G x ½" | Terumo Medical Co. | ||
| Forceps Dissecting Micro 11.5 cm Style 7 | Lawton Medizintechnik | 09-0959 | |
| Graefe Forceps Cvd 0.7mm 7cm | Lawton Medizintechnik | 62-0263 | |
| Clamps Dieffenbach bulldog Cl Str 38 mm | Lawton Medizintechnik | 60-010 | |
| Vannas Scissors 8 cm Str Fh | Lawton Medizintechnik | 63-1400 | |
| Equipment | |||
| SPR-671 MiKro-Tip Pressure catheter | Millar instruments | 840-6719 | |
| PCU-2000 Pressure Control Unit | Millar instruments | 880-0129 | |
| PowerLab 4/30 | ADinstruments Pty Ltd. | ML866 | |
| LabChartPro 7 | ADinstruments Pty Ltd. | MLU260/7 | |
| Legato200 Infusion Pump | KdScientific | KD-KDS210P | |
| TCAT-2LV Temperature controller and isothermal heating plate | PhysiTemp instruments Inc. | ||
| Medical Oxygen supply | Indura | ||
| Rectal probe | ADinstruments Pty Ltd. | MLT1404 | |
| Trinocular microscope, axial illumination | LW Scientific | Z2B-TRI-ETNE, ILP-1502-LTS1, ILP-1502-DGGF | |
References
- Hart, C. Y., Burnett, J. C., Redfield, M. M. Effects of avertin versus xylazine-ketamine anesthesia on cardiac function in normal mice. Am. J. Physiol. Heart Circ. Physiol. 281, H1938-H1945 (2001).
- Janssen, B. J., et al. Effects of anesthetics on systemic hemodynamics in mice. Am. J. Physiol. Heart Circ. Physiol. 287, H1618-H1624 (2004).
- Lorenz, J. N. A practical guide to evaluating cardiovascular, renal, and pulmonary function in mice. Am. J. Physiol. Regul. Integr. Comp. Physiol. 282, R1565-R1582 (2002).
- Lorenz, J. N., Robbins, J. Measurement of intraventricular pressure and cardiac performance in the intact closed-chest anesthetized mouse. Am. J. Physiol. 272, H1137-H1146 (1997).
- Nemoto, S., DeFreitas, G., Carabello, B. A. Cardiac catheterization technique in a closed-chest murine model. Contemp. Top. Lab Anim. Sci. 42, 34-38 (2003).
- Daniels, A., et al. Impaired cardiac functional reserve in type 2 diabetic db/db mice is associated with metabolic, but not structural, remodelling. Acta Physiol. (Oxf). 200, 11-22 (2010).
- De Celle, T., et al. Long-term structural and functional consequences of cardiac ischaemia-reperfusion injury in vivo in mice. Exp. Physiol. 89, 605-615 (2004).
- Huntgeburth, M., et al. Transforming growth factor beta oppositely regulates the hypertrophic and contractile response to beta-adrenergic stimulation in the heart. PLoS One. 6, e26628 (2011).
- Reddy, A. K., et al. Cardiac function in young and old Little mice. J. Gerontol. A. Biol. Sci. Med. Sci. 62, 1319-1325 (2007).
- Christoffersen, C., et al. Cardiac lipid accumulation associated with diastolic dysfunction in obese mice. Endocrinology. 144, 3483-3490 (2003).
