Kvantificering Glomerular fyldbarhed Fluorescent Macromolecules Brug 2-Photon mikroskopi i München Wistarrotter

Summary

En teknik udnytter høj opløsning intavital 2-foton mikroskopi til direkte at visualisere og kvantificere gloemrular filtrering i overfladen glomeruli. Denne metode giver mulighed for direkte bestemmelse af permeabilitetsegenskaber af makromolekyler i både normale og syge tilstande.

Abstract

Nyresygdomme involverer urin tab af store væsentlige makromolekyler, såsom serumalbumin, har længe været anset for at være forårsaget af ændringer i permeabiliteten barriere består af podocytes, vaskulære endotelceller, og en basalmembran arbejder i fællesskab. Data fra vores laboratorium ved hjælp intravital 2-foton mikroskopi afslørede en mere permeabel glomerulær filtration barriere (GFB) end tidligere antaget under fysiologiske betingelser, med genfinding af filtreret albumin forekommer i en tidlig delmængde af celler, der kaldes proximale tubuliceller (PTC) ^{1,2, 3..}

Tidligere teknikker, der anvendes til at studere renal filtrering og oprettelse af karakteristisk for filtrering barriere involverede micropuncture af lumen af disse tidlige rørformede segmenter med prøveudtagning af væske indhold og analyse ^4.. Disse undersøgelser fastlagt albumin koncentrationen i den luminale væske til at være næsten ikke-eksisterende, svarende nøjehvilket normalt påvises i urinen. Imidlertid karakterisering af dextran polymerer med definerede størrelser af denne teknik viste de en størrelse svarende til serumalbumin havde højere niveauer i den rørformede lumen og urin, hvilket tyder øget gennemtrængelighed ^5..

Heri er en detaljeret skitse af teknik, der anvendes til direkte at visualisere og kvantificere glomerulær fluorescerende albumin permeabilitet in vivo. Denne metode giver mulighed for påvisning af filtreret albumin tværs filtrering barrieren til Bowmans rum (den oprindelige kammer urin filtrering), og også tillader kvantificering af albumin reabsorption af proximale tubuli og visualisering af efterfølgende albumin transcytose ^6.. Fraværet af fluorescerende albumin langs senere rørformede segmenter undervejs til blæren fremhæver effektiviteten af ​​hentning vej i de tidligere proksimale segmenter. Hertil kommer, at når denne teknik blev anvendt bestemme permeabilitetenaf dextraner med en lignende størrelse til albumin næsten ens permeabilitetsværdier blev rapporteret ^2. Disse observationer er direkte støtter behovet for at udvide fokus for mange proteinuric nyresygdomme til omfattede ændringer i proksimal tubulus celle regenerering.

Protocol

1. Konjugering af rotteserumalbumin til Sulfo-rhodamin 101 sulfonylchlorid (Texas Red)

1. Opløs 100 mg rotteserumalbumin (RSA) i 6.667 ml 100 mM natriumbikarbonat pH 9,0, slutkoncentration 15 mg / ml i en 50 ml konisk rør.
2. Placer løsning i is / vand bægerglas og afkøles til mellem 0 og 4 ° C.
3. Tilsæt 200 pi af høj kvalitet vandfrit dimethylformamid (DMF) til en 10 mg hætteglas af Texas Red sulfonylchlorid (TRSCs), vortex på medium i 15 sek.
4. Vortex RSA løsning på medium og tilsæt den opløste TRSC.
5. Wrap 50 ml konisk i folie (Parafilm kan anvendes for at sikre en tæt forsegling dannes), sted horisontalt i isspand m / is og kun sted på rocker at agitere opløsning langsomt (undgå dannelse af bobler), tillade reaktion at fortsætte ved 0 til 4 ° C i 1 time.
6. Gør 5 liter 0,9% saltvandsopløsning, og våde en 50 kDa molekylvægt afbrød kammer, som kan være enten a) dialysemembran med clips, b) dialysis slange som i en float-a-Lyzer eller c) slide-a-Lyzer kassette (alle velegnet til at fjerne ukonjugeret TRSC).
7. Sted reaktionsblanding i dialyse kammer og i det 5 liters beholder w / 0,9% saltvandsopløsning, dialyseres natten over ved 4 ° C med en forsigtig omrøring med en omrører.
8. Skift 5 L dialyse løsning morgenen og sidst på eftermiddagen, indtil inkubation natten resulterer i næsten ingen farveændring (Det tager typisk ~ 48 timer med mindst 4 børser). Derudover med MWCO på 50 kDa er så tæt på MW RSA, 66kDa, er det muligt at aldrig frembringe en klar opløsning, og dette vil afhænge af fordelingen i porestørrelsen af ​​membranen, 60 timer og 5 udvekslinger mere end tilstrækkelig tid.
9. Foranstaltning volumen og opdele den oprindelige vægt på 100 mg med volumenet til opnåelse af omtrentlige koncentration af TR-RSA, typisk koncentrationer intervallet 10-13 mg / ml. Den endelige farvestof: albumin ratio skal være ~ 4:1, 1 fluorofor per 15,000 Dalton protein MW. Opbevares ved 4 ° C, fryser aldrig TR-RSA løsning, da resultatet fragmentering, der kan opstå, vil ændre permeabilitetsværdier.

2. Klargøring af Inverted mikroskopbordet for Imaging / Microscope Settings

1. Sted ~ 4-7 stykker autoklave tape (ca. ¾ "lang) perfekt stablet over hinanden inde i en 50 mm skål med en 40 mm dækglas bund (dækglas bund skål). Disse bør placeres tættere på en af ​​kanterne, således at kant af båndet vil tage kontakt med kanten af krumning af nyrerne, men ikke blokere objektive strålegang (figur 1A og 1B) større rotter vil kræve mere plads mellem båndet og kanten af skålen.
2. Placer 2 Repti-THERM puder ud til fase sammen med 50 mm skål (figur 1A). Placer en opvarmning vand jakke tæppe over scenen.
3. Maksimere effektiviteten ved indsamling billeder ved at sikre målet tårn har en 10x luft or 20x (luft eller vand nedsænkning) målsætning og en højere powered nedsænkning i vand mål at indsamle billeder til kvantificering.
4. Under billedbehandling den mest effektive måde at tilføje vand til målene er at rotere dem til side og tilsæt vand med en 1 ml sprøjte med et langt stykke PE-200 rør, der kan nå toppen af ​​målene.
5. Indstil excitationsintensitet af 10watt laser til ~ 15-20% ved hjælp af neutralfiltre på softwaren. De gallium-arsenid phosphide non-descanned fotodetektorer er sat til 750 for at indsamle grønne emissioner, og 625 at indsamle røde emissioner. Blå emission (såsom nukleare pletten Hoechst 33342), er indsamlet ved hjælp af en standard nondescanned multialkaline detektor med en indstilling mellem 750-800.
6. For at sikre en korrekt opkrævning af de lavintensive emissioner i Bowman rummet, sørg de nedre grænser for detektorerne er indstillet, så for ikke at udelukke disse værdier. Visuel advarsel markører vil indikere hvis følsomhedenIndstillingen er for lavt, og disse værdier bliver givet en intensitet på nul.
7. Indlæse en 1 ml sprøjte med ~ 5-8 mg af det fluorescerende albumin fortyndet med 0,9% sterilt saltvand for at opdrage den samlede volumen til 1 cc.

3. Udsættes Nyre i en München Wistar Rat for Intravital 2-Photon Imaging

1. Start med en pre-bedøvet rotte ved hjælp Pentabarbitol (50 mg / ml opløsning, 120 μl/100 g kropsvægt), inactin (130 mg / ml opløsning, 120 μ/100 g kropsvægt), eller isofluoran (5% induktion, 1,5 til 2,5% vedligeholdelse), barberet en iboende veneadgang linje (enten jugularis eller collum vene) og den venstre flanke fra lige under brystkassen lige over venstre lår.
2. Placer rotte fladt på sin højre side, så venstre, barberede side vender op, sørg for at det er fladt på bordet, med sin kropsholdning langstrakt og ikke krøb med forpoterne rører hinanden og bag poter rører hinanden (figur 2A). Meget forsigtigt palpate at føle nyrerne at afgøre, hvor det naturligt indeholder i retroperitoneum og tegne en lige linie parallelt med kroppen (fra brystkassen til låret) med en Sharpie (figur 2A).
3. Saml huden med et par af fortandede pincet og tag fat i huden langs stregen hjælp af et par hemostats at knuse væv og forhindre blødning. Skær langs snittet hjælp af et par kirurgiske saks. Knusning den ydre hud og muskel lag før skæring vil dramatisk reducere og typisk eliminere blødning.
4. Gentag denne procedure for den ydre muskel lag, som er tyndt.
5. For indsnit ind i det indre muskel lag, som vil udsætte peritoneum-re palpate nyrerne at anslå størrelsen. Klem et snit linje mindre end nyrer; sikre snittet er lige over nyrerne. Det er bedst at gøre dette indsnit for lille og gøre det større, hvis nødvendigt. Hvis dette er gjort for stor, vil sutur være påkrævet.Denne sidste snit er kritisk, for langt ovre i hvilken som helst retning vil påvirke stabiliteten på scenen og inducere enten bevægelsesartefakter fra vejrtrækning (best case scenario), eller vil strække renal stilken og negativt reducere renal perfusion (worst case scenario).
6. Find nyrerne (som vist i figur 2B), og greb den omgivende fedt ved hjælp af pincet, der arbejder mod bunden pol af nyrerne i en hånd over hånd mode.
7. Når nederste pol af nyrerne er nået, skal du forsigtigt trække nyren gennem snittet mens meget forsigtigt klemme under nyrerne eksteriorisere. Hvis snittet er for lille, knuse musklen lag og skæres at udvide det, gentages proceduren til eksteriorisere nyre.

4. Placering af München Wistar Rat på scenen for Imaging

1. Placer nyren mod kanten af ​​dækglasset skål med nyrerne drejet lidt mod dorsale (bagsiden) af rotte så den ventrale side af nyre is gør kontakt med dækglas bund skålen (figur 1A). Tilføj en opvarmet, steril 09.% Saltvandsopløsning til fadet.
2. Kig gennem 10x eller 20x objektiv og tjekke for bevægelse. Hvis der registreres bevægelse, rulle rotten løbet lidt, så brystkassen er længere væk fra dækglasset bunden skål; sørg nyrerne er så tæt på kanten af fadet uden at strække renal stilken (figur 1B).

5.. Erhvervelse billeder at kvantificere Renal fyldbarhed Albumin

1. Beregning af glomerulære permeabilitet (Glomeruluar sigtningskoefficient, GSC) enhver makromolekyle vil kræve tage reference-baggrundsbilleder af individuelle glomeruli før infusion af fluorescerende molekyle. Hvis din mikroskop er udstyret med en motoriseret etape stand til at markere steder, finde og center individuelle glomeruli ved hjælp af lavere drevne mål og markere hvert sted. En dobbelt pass Fluorescein / Rhodamine epifluorescens filter er ideel til denne procedure, selv om begge emission filter vil arbejde (fasekontrast eller andre ikke-fluorescens belysningskilder vil ikke arbejde). Glomeruli vises som tomme cirkulære strukturer omgivet af proksimale tubuli har en iboende gul-orange autoflourescence når den ses gennem den dobbelte pass filter.
2. Hvis din mikroskop ikke har et motoriseret trin, scanne nyrerne i et raster-mønster med laveffekt målet og gøre en rudimentær kort over hvor den enkelte glomeruli er placeret, og hviler på naturlige vartegn såsom store overfladiske blodkar placeret over nyrekapslen eller fedt pletter.
3. Skift revolveren til højere magt nedsænkning i vand mål og tage 3D-datasæt for hver glomeruli og sørg for kapillar loops og Bowman plads er klart synlige. Ved hjælp af en pseudo-palet (noget andet end B / W) vil bidrage til at visualisere disse strukturer.
4. Fokusering på et overfladisk blodkar langsomt indgyde i tHan fluorescerende albumin sørge tid er givet for at tillade systemisk distribution. For molekyler med lav GSC er det vigtigt at maksimere intensiteten værdier i plasma, men ikke at nå et niveau, der vil mætte foto-detektorer i mikroskopet. Dette øger spores filtrerede molekyler. Bemærk: der er typisk en 5-7 sek bortfalder mellem det tidspunkt, den fluorescerende albumin bliver introduceret til den tid, det vises på skærmen (overtagende hele billeder på ~ 1 ramme / sekund).
5. Tillad ca 10 min for at tillade eventuelle små molekylvægt fragmenter at rydde før erhverve 3D volumener ved 1 um intervaller, der skal anvendes ved beregningen albumin GSC. Typisk Simonsens stamme af München Wistarrotter har langt færre overflade glomeruli, så alt det kan visualiseres er afbildet og kvantificeres. Det Frömter stammen har et langt større antal, så begrænser vi antallet kvantificeret til ~ 10.
6. Ved afslutningen af ​​undersøgelsen rotten aflivet via en overdosis af anesthetic brugt i undersøgelsen. En dual pneumothoracotamy udføres for at forsikre dødshjælp.

6. Beregning GSC for Fluorescent Albumin fra 3D Volumes

1. Brug Metamorph billedbehandling software indlæse 3D datasæt for hver glomeruli, både baggrunden sæt og sæt taget efter infusion af det fluorescerende albumin.
2. I volumen indeholder den fluorescerende albumin finde en overfladisk kapillær løkke med plads tom plads mellem dens definerede margener og kanten af ​​Bowman kapsel.
3. I baggrunden volumen lokalisere den samme fokusplan som skal indeholde alle de visuelle referencer for albumin indeholder billedet. Vælg en region inden for den kapillære løkke af interesse og notere den gennemsnitlige intensitet læsning. Derefter skal du vælge en region i Bowman rummet og notere den gennemsnitlige intensitet læsning. Disse vil blive anvendt som baggrund værdier.
4. For kvantificering, vælg lignende region i Bowman plads i albumin containing billede. Gør dette i mindst to andre regioner til at tage en gennemsnitsværdi for den gennemsnitlige intensitet inden Bowmans plads.
5. Vælg den kapillære loop med den klareste plasma intensitet og tegne en region omkring det. Næste bruge tærsklen funktionen fremhæve de lyse værdier inden for cirkulerende plasma, undgår de mørke striber, der cirkulerer RBC'er. Bemærk den gennemsnitlige intensitetsværdier for den valgte plasma rummet. Det er vigtigt at fortrinsvis vælge de lyse områder i plasmaet, fordi faktorer inden blodet kun vil tjene til at bevirke og undervurdering af plasma niveauer af fluorescens.
6. Ved hjælp af en Microsoft Excel-regneark indtaste værdier til at beregne GSC hvor:

Representative Results

Figur 3 viser et eksempel på et billede taget fra en overflade glomerulus en München Wistar Frömter rotter og de ​​skridt til at bestemme permeabiliteten af fluorescerende albumin. GSC værdi for albumin af 0,0111 udledt for denne person glomerulus falder inden for intervallet ses i denne stamme af München Wistarrotter når i fastende tilstand ^3.. Stabiliteten set i disse billeder skyldes omhyggelig planlægning og udførelse af instruktioner afbildet i figur 1 og 2. Som tidligere nævnt, placeringen af ​​snittet bruges i exteriorizing nyren er det mest afgørende skridt i at producere stabile billeder fri af bevægelse artefakt.

Figur 1. En detaljeret skematisk at placere en orienteringaf rotte på mikroskopbordet før billeddannelse. forsigtigt lægge rottenyren nedad (som vist i A) over de Repti-Therm varmepuder med nyrerne om i dækglasset skålen. Rul nyre udad (*), så den ventrale side rører dækglasset bund og der er kontakt med autoklaven bånd (AT). At minimere vejrtrækning induceret bevægelse, rulle rotten fremad (**), så brystkassen er ude af området umiddelbart over dækglasset skålen. Fyld skålen med steril 0,9% saltvand og dæk med vand jakke. Brug et termometer til at overvåge rektal temperatur og drej Tore-Therm pads til og fra efter behov. Klik her for at se større figur .

: Src = "/ files/ftp_upload/50052/50052figure2highres.jpg" />
Figur 2. . Eksteriorisering af nyre-i München Wistar Rat før placering på mikroskopbordet en bedøvet rotte placeres med sin venstre størrelse op, området mellem brystkassen og overlår barberet (vist i grå, A). Når sekventielle snit at skære gennem huden, ydre derefter inderste muskel lag som vist ved linien gennemkører nyrerne i A. Nyren med tilhørende perirenale fedt skal være synlig (B). Ved hjælp af en pincet, fedtet er klemt i en hånd-over-hånd mode indtil den nedre mest pol er nået (BE). Forsigtigt klemme området under nyren, mens du trækker på fedt at eksteriorisere. Klik her for at se større figur .

052/50052figure3.jpg "alt =" Figur 3 "fo: content-width =" 5.5in "fo: src =" / files/ftp_upload/50052/50052figure3highres.jpg "/>
Figur 3. Single plane billeder taget fra 3D volumener viser et glomerulus en München Wistar rotter. Paneler A og B viser baggrundsbilleder og en taget ~ 12 minutter efter infusion af Texas Red rotteserumalbumin (TR-RSA) i sort og hvid. Bemærk den manglende mærkbar intensitet kapillære sløjfer (CL) eller Bowmans rum (BowSp) i baggrundsbilledet (A). Panel C viser en region taget fra panel A i pseudo bedre at visualisere lave intensitet baggrundsniveauer af væv. Her er en lille region trukket i en kapillær løkke (længere område) og inden Bowmans plads at estimere eksisterende fluorescerende intensitet niveauer, som skal trækkes fra værdier opnået efter infusion af fluorescerende albumin. Paneler D og E er at tagen fra panel B og vist i pseudo. Tre små områder af interesse trukket i Bowmans rum anvendes til at beregne den gennemsnitlige intensitet af fluorescerende albumin, der er flyttet over filtrering barriere (D). Gennemsnitlig intensitet værdier for de enkelte regioner blev rapporteret i det fremhævede område inden for de "Vis Region Statistik" dialogboksen (panel D '). For at beregne de cirkulerende plasma intensitet værdier inden kapillær sløjfer (CL, i panel E) en stor region trækkes henover lyseste kapillær løkke og de ​​lyse værdier langs den fremhævede ved hjælp af en tærskel funktion (vist et appelsin pixels). Kun intensitetsværdierne af pixels fremhævet i orange vil blive rapporteret uanset form eller størrelse af den omkringliggende region. Panel E 'viser de rå gennemsnitlig intensitet værdier af albumin inden for de kapillære loops, bemærk kontrolleret "Use Threshold For Intensitet Målinger" boks, der erkontrolleres. Panel F viser progressionen af værdier danner venstre til højre startende med baggrundsværdierne for de Kapillære Loops og Bowman plads, der trækkes fra de rå værdier opnået inden billederne. Når de korrigerede værdier er afledt, er Bowman plads intensitet divideret med Kapillær Loop intensitet værdi til opnåelse af glomerulær sigtningskoefficient der er et forhold mellem permeabilitet, impermeabel molekyler har en værdi på nul (0), mens dem, der filtreres frit have en værdi på en (1). Bar = 20 pm. Klik her for at se større figur .

Figur 4. Optagelse af filtreret fluorescerende albumin overvejende forekommer in tidlige segment af proksimale tubuli, S1. Panel A viser et tværsnit af en glomerulus og S1 segment taget ~ 20 minutter efter infusion af den oprindelige Texas Red RSA bolus. Den åbne Bowman rum og ivrig optagelse af albumin (rød) er show i S1 segmentet. Panel B viser en lavvandet 20 um 3D projektion af samme datasæt. Panel C viser en 3D-projektion med en lavere effekt 20x objektiv cirka 60 minutter efter infusion. Bemærk den samme glomerulus set i panel A og B er vist i C (*) og de ​​højere niveauer af albumin hentning ses i dette segment i forhold til andre proximale tubulus segmenter. Bar = 20 pm. Klik her for at se større figur .

Discussion

Trinene fremhævet her repræsenterer, hvad vi føler for at være dem, der vil producere konsistente og præcise permeabilitetsværdier fordi de omgå de følgende faldgruber:

1. Spredning: Brugen af ​​en rød udsender fluorophores give mulighed for mere effektiv indsamling af lys, da længere bølgelængde fotoner er mindre tilbøjelige til at sprede. Brug enten grønne eller blå udsender fluoroforer vil indføre større variation i generalsekretariatets på grund af den øgede variation i intensitet værdier fra de kapillære loops og Bowman plads ^3..
2. Billede dybde: Selvom dybe 3D datasæt normalt er indsamlet (ofte mellem 30-45 mikron i samlet dybde), de øverste 10-15 mikron repræsenterer de mest hensigtsmæssige fokale dybder at bestemme GSC værdier. Igen med dybere dybder kommer et fald i følsomhed og en stigning i variabilitet skyldes scatter emission af fotoner. Vigtigere er imidlertid den fortrængning af kapillære sløjfer, der opstår deeper i glomerulus. Her er kapillære loops skubbet op tæt til kanten af ​​Bowman kapsel omkring Bowmans plads. Dette øger chancerne for uforvarende at vælge et område direkte over en af ​​de mange podocytes der omgiver de kapillære loops. Dette vil føre til en undervurdering af generalsekretariatets fordi den sande, højere intensitet af den filtrerede albumin ikke bliver rapporteret. Note Panel B og D i figur 3 og den store mængde plads til stede mellem kanten af de kapillære loops og kanten af Bowman plads ^3..
3. Sampling: Valg af flere regioner i Bowmans plads forsikrer den bedste tilnærmelse af afsløre filtrerede albumin niveauer. Det er også vigtigt at undgå områder såsom 11 og 12:00 position over de kapillære loops. Fokusering gennem 3D volumenet afslører et sæt kapillære sløjfer fanget næsten tværs lige under brændplanet. Dette område ville give et falsk forhøjet GSC værdi vedovervurderer filtrerede albumin. Omvendt er det vigtigt at vælge den lyseste del af plasmaet i kapillære sløjfer til bedst bestemme den sande niveauer af cirkulerende fluorescerende albumin. Her undervurderer disse niveauer vil også øge GSR ved at reducere værdien af ​​nævneren i ligningen.

Validering af denne teknik sker ved billeddannelse en frit filtreret forbindelse med en GSR på en (1). Her bekymringer, der konsekvent undervurderer albumin plasmaniveauer, som følge af optiske begrænsninger er ansvarlig for at overvurdere albumin permeabilitet, er ophævet ^3.. Derudover have konstateret en GSR værdi for en 70 kDA dextran der er næsten identisk med den, der opnås ved at måle urin clearance / plasma niveauer og micropuncture bevise intravital 2-foton mikroskopi er i stand til korrekt bestemmelse af permeabiliteten af fluorescerende makromolekyler ^2. Endelig er evnen til hurtigt at visualisere the glomerulus og rørformede segmenter langs filtratet sti, med en høj grad af opløsning, 2-foton mikroskopi står entydigt klar til at kvantificere betydningen af ​​den glomerulære filtrationshastighed barriere og PT ved fastlæggelsen protienuria og albuminuri.

Protokollerne der er beskrevet heri, er baseret på anvendelsen af ​​en 2-Photon-system med en inverteret fase, som har fordele i enkeltheden af ​​de kirurgiske involverede procedurer og rotte placering på scenen. For information om at udnytte en 2-Photon system med en opretstående fase henvises til kapitel ved Dunn et al. ⁷ i Current Protocols in Cytometry (2007).

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Olympus Floview 1000 confocal/Multi-photon microscope	Olympus America		Filters for detectors: Blue 430/100, Green 525/50, Red 605/90
Mode-Locked Ti:Sapphire Mai Tai Laser	Spectra-Physics		Tunable excitation wavelengths: ~750-1150 nm
Gallium arsenide phosphide photodetectors	Hamamatsu Corp		Note: Front or Side mounted configurations available.
Metamorph Image processing Software	Molecular Dynamics		Note: Version 6.1r1
Microsoft Excel	Microsoft Corportation		2007 version
Handling Forceps	Electron Microscopy Sciences	Cat# 78266-04
Mayo Dissecting Scissors	Electron Microscopy Sciences	Cat# 72962
CA Micro scissors Model 1C300	Electron Microscopy Sciences	Cat# 78180-1C3
Kelly Hemostatic Forceps (straight)	Electron Microscopy Sciences	Cat# 72930
Water Jacket Blanket + Heating Pad	Gaymar		T/Pump PN 11184-000 Blanket-66N111CC
Repti-Therm Under Tank Heater	ZooMed		RH-4
Texas Red Sulfonyl Chloride	Invitrogen/Molecular Probes	Cat# T-353
Rat Serum Albumin	Sigma Aldrich	Cat# A-6272
High Quality Anhydrous DMF	Sigma Aldrich	Cat# 270547
Strate-Line Autoclave Tape	Fisher Scientific	Cat# 11-889-1
Willco-dish Coverslip Bottom Dishes (50 mm/40 mm coverslip)	Electron Microscopy Sciences	Cat# 70665-07