Summary
技術が直接表面糸球体でgloemrularろ過を視覚化し、定量化するために、高解像度intavital 2光子顕微鏡を用いた。このメソッドは、正常および病的両方の状態における高分子の透磁率特性を直接測定することができます。
Abstract
例えば、血清アルブミンなどの大型不可欠巨大分子の尿中損失を伴う腎疾患は、長い足細胞、血管内皮細胞、および一斉に作業基底膜からなる透過バリアの変化によって引き起こされると考えられてきた。生体2光子顕微鏡を用いた我々の研究室からのデータは、フィルタアルブミンの取得は、近位尿細管細胞（PTC）1,2、と呼ばれる細胞の初期のサブセットに生じると、以前に生理的条件下では考えられていたよりも透過性の糸球体濾過障壁（GFB）を明らかにした3。
腎臓のろ 過および流体内容と分析4のサンプリングでこれらの初期の管状セグメントの内腔の微小穿刺を関与ろ過障壁の特性を確立することを研究するために使用前のテクニック。密接に対応し、これらの研究は事実上存在しないことを腔液のアルブミン濃度を決定する通常は尿中に検出されるものである。しかし、この技術によって定義されたサイズを有するデキストランポリマーの特徴付けは、血清アルブミンと同様のサイズのものを明らかにした管状の管腔および尿中のより高いレベルを持っていた。透過性の増大5を示唆している。
ここでは、直接生体内での糸球体蛍光アルブミン透過性を可視化し、定量化するために使用される技術の詳細な概要です。この方法は、ボーマンスペース（尿ろ過の初期室）にろ過関門フィルタリングアルブミンの検出を可能に、そしてまた近位尿細管およびその後アルブミントランス6の可視化により、アルブミン再吸収の定量が可能になります。膀胱への途中後で管状セグメントに沿って蛍光アルブミンが存在しないことは、以前の近位尿細管セグメントにおける検索経路の効率を強調しています。さらに、この技術を適用したときの浸透性を決定するアルブミン実質的に同一の透過性値に類似した大きさを有するデキストランの2を報告した。これらの観察結果は、直接、近位尿細管細胞の埋め立てに含まれる改変には多くの蛋白尿腎疾患の焦点を拡大する必要性をサポートしています。
Protocol
1。スルホ-ローダミン101スルホニルクロリド（テキサスレッド）へアルブミンラット血清の結合
- 50ミリリットルコニカルチューブ中の最終濃度15 mg / mlの、100mMの重炭酸ナトリウムのpHは9.0の6.667ミリリットルで（RSA）ラット血清アルブミン100mgを溶かす。
- 場所の氷/水ビーカー内の溶液と0〜4℃の間にクール
- テキサスレッド塩化スルホニル（TRSC）10mgのバイアルに高品質の無水ジメチルホルムアミド（DMF）を200μlを加え、15秒間媒体上渦。
- 渦RSA媒体上の液と溶解TRSCを追加します。
- ホイルでラップ50ミリリットルコニカル（形成されたパラフィルムは、密封を確実にするために使用することができます）、水平方向のw /アイスのみと場所（気泡の形成を避ける）をゆっくりとソリューションを撹拌するためのロッカー上の氷のバケツに場所は、反応は0で継続することができますに4℃で1時間。
- 0.9％食塩水の5 Lを作成し、クリップ付きのいずれか）を透析膜することができます室カットオフ50 kDaの分子量、b）は、ジを濡らすフロート·アナライザ、またはc）のスライド·アナライザカセット（すべての非共役TRSCの除去に適しています）のようにalysisチューブ。
- 5 Lコンテナのw / 0.9％生理食塩水で透析室と所定の位置に置く反応混合物は、攪拌棒を用いて穏やかに撹拌しながら4℃で一晩透析する。
- ほとんどない色の変化で一晩インキュベーション結果（これは典型的には少なくとも4交換で〜48時間かかります）まで、午前中と夕方の5 Lの透析液を変更します。さらに、50 kDaでMWCOがRSA、66kDaの分子量に非常に近いことと、それは明確な解決策を生み出すことはありませんすることが可能であるが、これは膜の孔径に分布に依存することになる; 60時間と5交流がある十分な時間以上。
- 測定量とTR-RSAの近似濃度を与えるようにボリュームで100ミリグラムの初期重量を分け、通常の濃度範囲10-13 mg / mlのから。最後の染料：アルブミン比は15,00あたり〜4時01分、1発蛍光団であるべきタンパク質MWの0ダルトン。 4℃で保存、発生する可能性があり、断片化を結果としては透磁率の値が変更されますように、TR-RSAソリューションを凍結しないでください。
2。イメージング/顕微鏡セッティング用倒立顕微鏡ステージの準備
- 場所〜完全に40ミリメートルのカバースリップ底（カバーガラスボトムディッシュ）で50ミリメートル皿の内側に互いに上に積層オートクレーブテープの4-7枚（約¾ "長い）。これらは近いエッジのいずれかに配置する必要がありますので、それはテープの端は、腎臓の曲の端に接触することなく、客観的な光パス（ 図1Aおよび1B）をブロックしません。大きいラットは料理のテープとエッジの間に多くのスペースが必要になります。
- 50ミリメートル皿（ 図1A）と並んで、ステージ横にプレイス2 REPTI-サームパッド。ステージ上の温暖化ウォータージャケット毛布を置きます。
- 客観的なタレットを保証することで画像を収集すると、10倍の空気Oを持っている時の効率を最大化R 20X（空気や水浸）客観的かつ定量のための画像を収集するために、より高い動力を与えられた水浸対物レンズ。
- 撮像中の目標に水を追加するには、最も効率的な方法は、側にそれらを回転させ、目標のトップに到達することができますPE-200チューブの長い作品と1ccのシリンジを用いて水を追加することです。
- ソフトウェア上のNDフィルターを使用して〜15〜20％に10ワットレーザーの励起強度を設定します。ガリウム砒素リン非デスキャン検出器は、赤の排出量を収集するための緑の排出量、および625を収集するために750に設定されています。青色発光（例えば、核の染色ヘキスト33342など）は750から800の間で設定で標準nondescanned multialkaline検出器を使用して収集されます。
- ボーマン空間内で低強度の排出量の適切な回収を確保するため、検出器の下限値は、これらの値を除外しないように設定されていることを確認。ビジュアル警告マーカーは感度があれば表示されます設定が低すぎると、これらの値は、ゼロの強度値を与えられている。
- 1 CCの総容積を持ち出すために0.9％滅菌生理食塩水で希釈した蛍光アルブミン溶液の約5-8 MGと1ccのシリンジをロードします。
3。生体内のためにミュンヘンのWistar系ラットにおける腎臓を露出する2光子イメージング
- Pentabarbitol（50 mg / mlの溶液を、120μl/100体重100g）、Inactin（130 mg / mlの溶液を、120μ/100グラム体重）、またはイソフルラン（5％誘導、1.5を使用して事前に麻酔をかけたラットで始まる留置静脈アクセス回線（どちら頚または大腿静脈）、とばかりにただ左大腿上記胸郭下から剃ら左脇腹、）2.5％保守まで。
- ように、その右側にフラットラットを置きその左、坊主側が上を向いている、その姿勢が伸長します（ 図前足がお互いに触れ、お互いとリアの足に触れて、うずくまっていないと、それは、テーブルの上に平らであることを確認してください2A）。 非常に軽く、それが自然に後腹膜内に産む場所を決定し、シャーピーを使って本体（胸郭から太ももまで）（ 図2A）に平行な直線を描画するために腎臓を感じるように触診。
- 歯ピンセットで皮膚をピックアップし、組織をつぶすと出血を防ぐために、止血のペアを使用して描かれた線に沿って皮膚をつまむ。手術用はさみのペアを使用して切開に沿ってカットします。カットする前に外側の皮膚と筋肉の層を破砕すると劇的に削減し、一般的に出血がなくなります。
- 薄くて外側の筋肉層、について、この手順を繰り返します。
- 腹膜を公開します内側の筋肉層、切開の場合は、大きさを推定するために腎臓を再度触診。腎臓より小さい切開ラインをつまんで、切開を保証するだけで、腎臓の上にある。この切開があまりに小さく、必要に応じて、それを大きくすることをお勧めします。これは大きすぎるなされた場合は、縫合が必要となる。この最後の切開が重要であり、あまりにも遠く任意の方向に経由すると、ステージ上の安定性に影響を与え、呼吸からモーションアーチファクトのいずれかを誘発する（ベストケースシナリオ）や腎茎を伸ばすに悪影響腎灌流を（最悪の場合）削減されます。
- 腎臓の位置を確認します（ 図2（b）に示すように）とグリップピンセットを用いて周囲の脂肪、手のファッションの上に手に腎臓の下極に向けて取り組んでいます。
- 腎臓の下極に到達すると、非常に静かに体外に出すために腎臓の下に絞りながら、優しく切開を通して腎臓を引き出します。切開が小さすぎると、筋層を粉砕し、それを広げるためにカット、腎臓を露出させるための手順を繰り返す。
4。イメージングのために、ステージ上のミュンヘンのWistarラットを配置
- 腎臓とカバースリップの皿の端の方に腎臓を置き、わずかに、ラットの背側（背面側）に向かって回転させ、腎臓の腹側ので、私sがカバーガラスボトムディッシュ（ 図1A）と接触する。お皿に温め、無菌の09％食塩水を追加します。
- 10倍または20倍客観的に目を通すと、動きを確認してください。動きが検出された場合は胸部が遠くカバーガラスボトムディッシュからですので、少し上のラットを転がし、腎臓などの腎茎（ 図1B）を伸ばすことなく、お皿の端に近いことを確認してください。
5。アルブミンの腎透過を定量化するために画像を取得
- 糸球体透過性（Glomeruluarふるい係数; GSC）を計算する任意の高分子のことは事前の蛍光分子の注入への個々の糸球体の基準背景画像を撮影する必要があります。あなたの顕微鏡はマーキング位置が可能な電動ステージが装備されている場合は、検索および低電力対物レンズを用いて個々の糸球体の中心と、それぞれの場所をマーク。デュアルパスフルオレセイン/ローダミン落射蛍光FILどちらエミッションフィルタは（位相コントラストや照明の他の非蛍光源は動作しません）動作しますが、ターは、この手順のために理想的です。糸球体は、デュアルローパスフィルタを通して見たときに特有の黄橙色autoflourescenceを持つ近位尿細管に囲まれた空の円形の構造として表示されます。
- あなたの顕微鏡は電動ステージを持っていない場合は、低消費電力を目的としたラスタパターンで腎臓をスキャンして、個々の糸球体がどこにあるかの初歩的なマップを作ること、そのような腎カプセルの上にある大規模な表在血管のような自然なランドマークに頼るまたは脂肪パッチ。
- 高電力、水浸対物レンズにタレットを切り替えて毛細血管ループやボーマン空間がはっきりと見えることを確認し、それぞれの糸球体の3Dデータセットを取る。擬似カラーパレット（B / W以外のもの）を使用すると、これらの構造を視覚化するのに役立ちます。
- 表在血管の中を当て、ゆっくりとTで吹き込む彼は、蛍光アルブミン意思確認時間は全身分布を可能にするために与えられている。低GSCを有する分子のためには、プラズマ中の強度値を最大化することではなく、顕微鏡の光検出器を飽和させるレベルに到達しないことが不可欠である。これは、フィルタリングされた分子の検出能を向上させます。注：時間の間に5-7秒経過は通常存在する蛍光アルブミンは、それが画面に表示されます（約1コマ/秒でフルフレームを取得する）時に導入される。
- 約10分はアルブミンGSCの計算に使用される1ミクロン間隔で3Dボリュームを獲得する前にクリアして、潜在的な小分子量のフラグメントを許可することができます。一般的には、ミュンヘンのWistarラットのシモンセンの株がはるかに少ない表面糸球体があり、視覚化することができることすべてを撮像し、定量化されているそう。 Frömter株は、我々は〜10に定量数を制限するように、はるかに大きな数を持っています。
- 研究の終わりに、ラットをanesthetの過剰摂取を介して安楽死させているicが研究に使用した。デュアルpneumothoracotamyは安楽死を保証するために行われる。
6。 3Dボリュームから蛍光アルブミンための計算GSC
- 各糸球体用の3Dデータセットをロード変形者の画像処理ソフトウェアを用いて、両方の背景セットと蛍光アルブミンの注入後に撮影セット。
- その定義されたマージンとボーマン嚢の端の間に十分なスペースが空きスペースとの表面的な毛細血管ループを見つけ蛍光アルブミンを含むボリュームで。
- 背景ボリュームにアルブミンを含む画像のすべての視覚的な手がかりが含まれている必要があり、同じ焦点面を探します。関心の毛管ループ内の領域を選択し、平均強度の読みに注意してください。次にボーマン空間内の領域を選択し、平均強度の読みに注意してください。これらは、バックグラウンド値として使用される。
- 定量のために、アルブミンのCボーマン空間内類似領域を選択画像をontaining。ボーマン空間内の平均強度の平均値を取るために、少なくとも2つの他の地域のためにこれを行います。
- 明るいプラズマ強度と毛細血管のループを選択し、周囲の領域を描画します。閾値関数を使用して、次の、RBCのを循環している暗い縞を回避、循環血漿内明るい値を強調。選択されたプラズマ空間の平均強度値に注意してください。血中の要因が唯一の原因と血漿蛍光レベルの過小評価するのに役立つでしょうので、それは優先的にプラズマの明るい部分を選択することが重要である。
- Microsoft ExcelスプレッドシートがどこGSCを計算するために値を入力します使用：
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Representative Results
図3は、ミュンヘンウィスター系ラットFrömterと蛍光アルブミンの浸透性を決定するために取られるステップの表面の糸球体から撮影画像の一例を示す図である。ミュンヘンWistarラットとき飼育条件3でのこの株で見られる範囲内で、この個々の糸球体の落下に対して導出0.0111のアルブミンためGSC値。これらのイメージで見られる安定性は、慎重な計画と、図1および図2に示されている命令の実行によるものです。前述のように、腎臓を視るに使用される切開の配置はモーションアーチファクトのない安定した画像を生成する中で最も重要なステップです。
図1。向きを位置決めする詳細な概略前イメージング顕微鏡のステージ上にラット。ゆっくり腎臓はカバースリップの皿に敷設REPTIサーモ暖房パッド上ダウンラット腎臓側（に示すように）横たわっていた。腹側はカバースリップの底部に接触したと連絡をオートクレーブテープ（AT）で作られていますように（*）腎臓は外側に転がる。誘導運動を呼吸最小限に抑えるために、胸部、直ちにカバースリップの皿の上にエリア外になるように（**）フォワードラットをロール。ウォータージャケットと滅菌0.9％食塩水とカバーでお皿を埋める。直腸温度を監視し、必要に応じてオンとオフREPIサーモパッドを回すために温度計を使用してください。 大きい数字を表示するには、ここをクリックしてください 。
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図2。前顕微鏡ステージ上の配置にミュンヘンのWistarラットにおける腎臓の具象麻酔ラットは、その左のサイズアップで配置され、。（グレーで表示）剃ら胸郭と上部の腿の間の領域。一度シーケンシャル切開で腎臓を横断線で示すように、皮膚は、外側その後内側の筋肉の層を介してカットに作られています。関連する周囲の腎脂肪と腎臓（B）が表示されるはずです。最も低い極に到達するまで、ピンセットを用いて、脂肪（BE）ハンドオーバーハンド方式で挟持される。体外に出すための脂肪に引っ張りながらゆっくりと腎臓の下の面積を絞る。 より大きい数字を表示するには、ここをクリックしてください 。
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図3。ミュンヘンのWistarラットの糸球体を示す3Dボリュームから取ら単一平面画像。パネル＆Bショーの背景画像と1黒と白の血清アルブミンテキサスレッドラット（TR-RSA）の約12分後の注入を撮影。毛細血管ループ（CL）や背景画像（）でボーマンスペース（BowSp）の欠如認識できる強度に注意してください。パネルCは、より良い組織の低強度のバックグラウンドレベルを可視化するために擬似カラーでパネルから取られた領域を示しています。ここで、小領域は、キャピラリーループ（より長い領域）と蛍光アルブミンの注入後に得られた値から差し引く必要があり、既存の蛍光強度レベルを推定するためのボーマン空間内で描かれている。パネルDとE取るさパネルBから、nと擬似カラーで示さ。ボーマン空間に描画されたその他の三つの小領域を濾過関門（D）を横切って移動した蛍光アルブミンの平均強度を計算するために使用される。個々の地域の平均強度値は"表示地域統計"ダイアログ（パネルD '）内の強調表示された領域で報告された。毛細血管ループ内循環血漿強度値（CL、パネルEの）を計算するには、大きな領域が一緒に明るい毛細血管ループと明るい値上に描画されるしきい値機能（オレンジ色のピクセルを示す）を使用して強調した。唯一のオレンジ色で強調表示された画素の強度値は、周囲の領域の形状やサイズにかかわらず報告される。パネルE 'は、毛細血管ループ内アルブミンの生の平均強度値を示し、ある調べ"強度測定のしきい値を使用する"ボックスに注意してくださいチェックした。パネルFは、値の進行が右の画像内に得られた生の値から減算さキャピラリーループとボーマン空間のバックグラウンド値で始まるに委ね形成するを示しています。自由にフィルタリングされたものその一方、透過性分子は、ゼロ（0）の値を有し、補正後の値が導出されると、ボーマン空間強度値は、透磁率の比である糸球体ふるい係数を得キャピラリループ強度値で除算するオン（1）の値を有する。バー=20μmである。 より大きい数字を表示するには、ここをクリックしてください 。
図4。フィルタリング蛍光アルブミンの取り込みiは主に発生nの近位尿細管、S1の初期のセグメント。パネルは、初期テキサスレッドRSAボーラス〜20分後に注入を取っ糸球体とS1セグメントの断面を示している。アルブミンのオープニングボーマン空間と熱心な取り込み（赤）はS1セグメントのショーです。パネルBは、同じデータセットの浅い20μmの3D投影を示しています。パネルCは 、低消費電力20倍客観約60分後の注入を使用して3D投影を示しています。 ＆B C（*）と、他の近位尿細管セグメントに対して、そのセグメントで見られるアルブミン検索のより高いレベルに示すパネルで見られる同じ糸球体に注意してください。バー=20μmである。 より大きい数字を表示するには、ここをクリックしてください 。
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Discussion
手順はここで我々は、彼らが次の落とし穴を回避するため、一貫性のある正確な透過性値が生成されたものであると感じるものを表す強調：
- 散乱：長い波長の光子が散乱しにくい傾向があるので、赤色発光蛍光体の使用は、光をより効率的に回収を可能にする。どちら緑色または青色発光蛍光団を使用するので、毛細血管ループとボーマン空間3からの強度値の増加変動GSC年代に大きな変化をご紹介します。
- 画像の深さ：深い3Dデータセットが通常（しばしば総深さ30-45ミクロンの間）に収集されていますが、上位10〜15ミクロンGSC値を決定するために最も適切な焦点深度を表しています。再び深い深度と感度の低下と放出された光子の散乱に起因する変動性の増加が来る。さらに重要なことはしかし、dは発生毛細血管ループの混雑です糸球体内eeper。ここでは、毛細血管ループはボーマンスペースを取り囲むボーマン嚢の端に密接に押し上げている。これは、誤って直接毛細血管ループを囲む多数の足細胞の1以上の領域を選択する可能性が高くなります。フィルタリングアルブミンの真の、より高い強度が報告されませんので、これはGSCのの過小評価につながる。 図3と毛細血管ループのエッジとボーマン空間3のエッジとの間の空間に存在する大量のメモパネルBとD。
- サンプリング：ボーマン空間内のいくつかの地域を選択すると、フィルタリングされたアルブミンのレベルを検出することが最良の近似を保証します。これは、ループ状毛細血管上記11と12時の位置などの分野を回避することも重要である。 3Dボリュームを通して焦点は、単に焦点面の下にはほぼ横方向に巻き込ま毛細血管ループのセットを明らかにする。このエリアは、誤って高いGSC値によって与えるだろうフィルタリングアルブミンを過大評価。逆に言えば、最良の蛍光アルブミンを循環させるの真のレベルを決定するためにループ状毛細血管内のプラズマの最も明るい部分を選択することが重要である。ここではこれらのレベルを過小評価しても式の分母の値を減少させることによってGSC増加します。
この技術の検証は、イメージング1（1）のGSCと自由にフィルタリング化合物によって起こる。ここでは、一貫してアルブミン透過性を過大評価するための責任を負って、光制限によりアルブミン血漿レベルを、過小評価すると、3を無効にしていることを懸念。また、尿クリアランス/血漿レベルおよび微小穿刺生体2光子顕微鏡が正しく蛍光巨大分子2の透過性を決定することが可能であることを証明を測定することによって得られるものと実質的に同一である70kDaデキストランGSCの値を決定した。最後に、能力が急速に目を可視化する電子糸球体と解像度の高いろ液経路に沿って管状セグメントは、2光子顕微鏡を一意protienuriaおよびタンパク尿を決定する際に、糸球体濾過障壁とPTの重要性を定量化する態勢に立っている。
ここに記載されているプロトコルは、外科関連する手順と、ステージ上のラット配置のシンプルで利点があり、反転ステージが2光子システムの使用に基づいています。直立ステージはダンらの章を参照してくださいと2光子システムを活用方法について。7メトリにおけるカレント·プロトコール（2007年）にしてください。
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Disclosures
著者らは、開示することは何もありません。
Acknowledgments
著者は、静脈アクセスラインの配置を伴う外科手術を完了するため博士シルビアBカンポス-BilderbackとジョージJロードスに感謝したいと思います。彼らはまた、シモンセンとFrömter株の両方で構成されるミュンヘンのWistarコロニーを維持するためにサラE離乳に感謝したいと思います。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Olympus Floview 1000 confocal/Multi-photon microscope | Olympus America | Filters for detectors: Blue 430/100, Green 525/50, Red 605/90 | |
| Mode-Locked Ti:Sapphire Mai Tai Laser | Spectra-Physics | Tunable excitation wavelengths: ~750-1150 nm | |
| Gallium arsenide phosphide photodetectors | Hamamatsu Corp | Note: Front or Side mounted configurations available. | |
| Metamorph Image processing Software | Molecular Dynamics | Note: Version 6.1r1 | |
| Microsoft Excel | Microsoft Corportation | 2007 version | |
| Handling Forceps | Electron Microscopy Sciences | Cat# 78266-04 | |
| Mayo Dissecting Scissors | Electron Microscopy Sciences | Cat# 72962 | |
| CA Micro scissors Model 1C300 | Electron Microscopy Sciences | Cat# 78180-1C3 | |
| Kelly Hemostatic Forceps (straight) | Electron Microscopy Sciences | Cat# 72930 | |
| Water Jacket Blanket + Heating Pad | Gaymar | T/Pump PN 11184-000 Blanket-66N111CC | |
| Repti-Therm Under Tank Heater | ZooMed | RH-4 | |
| Texas Red Sulfonyl Chloride | Invitrogen/Molecular Probes | Cat# T-353 | |
| Rat Serum Albumin | Sigma Aldrich | Cat# A-6272 | |
| High Quality Anhydrous DMF | Sigma Aldrich | Cat# 270547 | |
| Strate-Line Autoclave Tape | Fisher Scientific | Cat# 11-889-1 | |
| Willco-dish Coverslip Bottom Dishes (50 mm/40 mm coverslip) | Electron Microscopy Sciences | Cat# 70665-07 |
References
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