利用双光子显微镜在慕尼黑Wistar大鼠量化肾小球通透性荧光大分子

Summary

利用高分辨率intavital 2 - 光子显微镜的技术直接可视化和量化表面肾小球过滤gloemrular。此方法允许在正常和疾病状态的大分子渗透特性的直接测定。

Abstract

肾疾病，尿中丢失大必不可少的大分子，如血清白蛋白，一直被认为由足细胞的通透性屏障，血管内皮细胞，和以协调方式工作的基底膜的改变引起的。数据从我们的实验室中使用活体双光子显微镜揭示一个更具渗透性的肾小球滤过屏障（GFB），比以前认为的生理条件下，过滤白蛋白发生在早期的子细胞，称为肾小管上皮细胞^（PTC）1,2检索^{， 3。}

用以前的技 ​​术研究肾小球滤过和建立滤过屏障特性，包括微注射，这些早期的管状部分的内腔中的流体含量的采样和分析^4。这些研究确定管腔液中的白蛋白浓度几乎不存在相应密切通常是在尿中检测到。然而，葡聚糖聚合物，用这种技术定义的大小的表征显示大小类似血清白蛋白的管状腔体和尿中有更高的水平;提示通透性增加^5。

本文是一个详细的轮廓，所使用的技术，直接可视化和量化肾小球荧光体内白蛋白通透性 。这种方法可以检测过滤白蛋白整个鲍曼的空间（初始尿过滤室）的滤过屏障进入，也允许由近端肾小管重吸收白蛋白定量和随后的白蛋白transcytosis的⁶可视化。荧光白蛋白的情况下购买沿管状段途中膀胱突出检索通路在较早的近端小管段的效率。此外，当这种技术用于测定渗透率葡聚糖具有类似大小白蛋白几乎相同的渗透率值报告^2。这些意见直接支持需要扩大许多蛋白尿的肾脏疾病的重点包括改变近端小管细胞填海的。

Protocol

1。共轭大鼠血清白蛋白磺酸罗丹明101磺酰氯（德州红）

1. 溶解100mg大鼠血清白蛋白（RSA）6.667毫升100毫米碳酸氢钠pH值9.0;终浓度为15毫克/毫升，50毫升锥形管。
2. 将溶液在冰/水的烧杯中，并冷却至0至4℃之间
3. 高品质的无水二甲基甲酰胺（DMF）中加入200微升10毫克小瓶德克萨斯红磺酰氯（TRSC）培养基上，在15秒的涡流。
4. 的涡RSA解决方案培养基上，并添加溶解TRSC。
5. 余音50毫升​​锥形箔（封口膜可以用来保证形成紧密的密封），在水平方向冰桶/冰和摇杆慢慢搅拌溶液（避免形成气泡）的地方，使反应继续在0至4℃，1小时。
6. 5升0.9％的生理盐水溶液，湿50 kDa的分子量切断腔室可以是一个）透析膜用夹子，二）二“辩管浮法一个仪，或c）滑一仪盒（适合除去未结合TRSC）。
7. 在透析室和5升的容器瓦特/ 0.9％的生理盐水溶液，将反应混合物在4℃透析过夜用温和的用搅拌棒搅拌。
8. 更改在早晨和傍晚5升透析液，直到孵育过夜结果几乎没有颜色的变化（这通常需要交流至少4〜48小时）。此外，用截留分子量为50 kDa的如此接近的采用RSA，分子量66kDa;可能永远不会产生澄清的溶液，这将依赖于膜的孔径分布在60小时和第5交流超过足够的时间。
9. 测量体积和划分的初始重量为100毫克的体积，得到浓度大约TR-RSA，典型的浓度范围为63-82毫克/毫升。最终染料：白蛋白比例应该是4:1，每1荧光15,00道尔顿的蛋白质兆瓦。储存在4℃;切勿冻结TR-RSA解决方案，产生的碎片可能发生改变渗透率值。

2。倒置显微镜舞台成像/显微镜设置的准备

1. 位〜完美地堆叠在彼此的高压釜中带4-7枚（约¾英寸长）与40毫米的盖玻片的底部（盖玻片底菜）在一个50毫米的菜。这些应该放在靠近其中一个边缘，使得在纸带边缘接触与肾脏曲率的边缘，但不阻断的客观的光路（ 图1A和1B）;，较大的大鼠，将需要更多的空间之间的磁带和边缘菜。
2. 地点的2 Repti热垫下一阶段沿着50毫米的菜（ 图1A）。在舞台上放置变暖的水套毯。
3. 最大限度地提高效率时，采集图像，通过确保客观炮塔有10倍的空气Oŗ20X（空气或水浸泡）目标和更高的供电水浸泡客观定量采集图像。
4. 在成像过程中加水的目标是最有效的方式将其旋转到一边，加水用1毫升注射器PE-200管一根长长的，可以达到的目标的顶部。
5. 设置的激发光强度的激光10瓦特〜15％至20％的中性密度过滤器上的软件。砷化镓磷化的非退探测器设置为750至收集绿色排放，625收集红色排放。蓝色的发光（如核染色Hoechst 33342荧光）的被收集使用标准nondescanned multialkaline检测器750-800之间的设置。
6. 鲍曼的空间内，以保证适当的强度低排放的集合，确保探测器的下限设置为不排除这些值。视觉警告标志表示如果灵敏度设置太低，这些值是给定的强度值为零。
7. 加载〜5-8毫克的荧光白蛋白溶液稀释，用0.9％的无菌生理盐水，使总体积为1毫升1毫升注射器。

3。暴露在慕尼黑Wistar大鼠肾脏活体2光子成像

1. 开始与预麻醉大鼠使用Pentabarbitol（50 mg / ml的溶液，120μl/100克体重），Inactin（130毫克/毫升的溶液，120克μ/100体重），或Isofluorane（5％的诱导，1.5维护2.5％），从正下方肋骨左大腿正上方的留置静脉通道线（或颈静脉或股静脉），和左翼剃光。
2. 将鼠平在其右侧，左，剃了头的一面朝上，确保它是平放在桌子上，其姿态拉长，而不是蹲下，用前爪抚摸对方后方的爪子抚摸对方（ 图2A）。 非常轻轻触诊感觉肾脏，以确定它自然奠定腹膜内画一条直线平行于身体（从肋骨到大腿）使用一个骗子（ 图2A）。
3. 拿起一对齿镊皮肤，捏皮肤沿画线，用一对止血，，粉碎组织和防止出血。利用一对沿切口手术剪剪切。破碎外的皮肤和肌肉层切割前将大大减少，通常消除出血。
4. 重复此过程外肌肉层，这是薄。
5. 对于内部肌肉层，这将暴露腹膜切口进入，再触诊肾脏估计大小。捏住小于肾脏的切口线，保证切口仅仅是在肾脏。这是最好的，此切口太小，使其变大，如果需要。如果这是过大，缝合是必需的。这最后一个切口是至关重要的;太远在任何方向会影响舞台上的稳定性和诱发呼吸（最好的情况下）无论是运动伪影，或将延伸肾蒂不利减少肾脏灌注（最坏的情况）。
6. 找到（ 如图2B所示）和抓地力肾周围脂肪，使用镊子，一只手在手时尚肾脏的底部极努力。
7. 一旦到达肾脏下极，轻轻一拉肾脏通过切口，同时轻轻挤压低于肾脏exteriorize。如果切口过小，粉碎肌肉层切拓宽;重复的过程exteriorize肾。

4。配售慕尼黑Wistar大鼠在舞台上成像

1. 肾脏放置走向与肾平皿盖玻片的边缘稍微旋转肾脏的腹侧向背侧（背面侧）的大鼠，以便我S制作接触与盖玻片底菜（ 图1A）。添加一个温暖，无菌的09％盐溶液的菜。
2. 翻阅10倍或20倍的目标和检查的议案。如果检测到运动，滚大鼠略有所以胸部比较远从盖玻片底部菜;确保肾脏尽可能靠近边缘的菜不拉伸肾蒂（ 图1B）。

5。图像采集量化肾渗透白蛋白

1. 任何大分子计算肾小球通透性（Glomeruluar筛分系数; GSC）将荧光分子输液前需要采取个别肾小球的参考背景图像。如果您的显微镜配备有电动载物台的标记位置的能力，发现中心单个肾小球使用低功率的目标，并记下每一个位置。双通荧光/罗丹明萤光的过滤ter是这个程序的理想选择，虽然无论是发射滤波器（相衬或其他非荧光照明来源将无法正常工作）。肾小球会出现空的圆形结构由近端肾小管时，通过双通滤波器，其固有的橙黄色autoflourescence包围。
2. 如果您的显微镜不具有电动载物台，扫描的栅格图案中的肾，低功耗的目标，并位于单个肾小球的一个基本地图，依靠自然地标，例如大的浅表血管上方肾日本或脂肪补丁。
3. 炮塔切换到更高的功率水浸泡的目的和，拍摄3D数据集的每个肾小球毛细血管袢和鲍曼的空间都清晰可见的。使用伪彩色调色板（其他的东西比B / W），将有助于这些结构可视化。
4. 聚焦在浅表血管慢慢注入在t他荧光白蛋白确保时间，让全身分布。对于低GSC的分子，它是必不可少的，以最大限度地提高在血浆中的强度值，但没有达到的水平，将光检测器饱和，在显微镜。这增加过滤的分子的可探测性。注：通常是5-7秒延时荧光蛋白引入的时间之间的时间，屏幕上出现的（收购全帧，1帧/秒〜）。
5. 允许约10分钟，以使任何潜在的小分子量的碎片，以清除在获取三维体积在1微米的间隔被用在计算白蛋白GSC之前。通常情况下，西蒙森的应变慕尼黑Wistar大鼠肾小球少得多的表面，所以可以可视化成像和量化。的Frömter株具有非常大的号码，以便我们量化的数量限制在10〜。
6. 在研究结束时，将大鼠安乐死通过anesthet了过量的IC在研究中使用。双pneumothoracotamy以确保安乐死。

6。三维卷荧光白蛋白计算GSC

1. 使用的MetaMorph图像处理软件加载的三维数据集的每个肾小球，无论是背景设置并设置输注后的荧光白蛋白。
2. 在体积含有荧光蛋白定位浅表毛细血管襻有足够的空间之间的边界和边缘的鲍氏囊空。
3. 背景音量，找到同一焦平面白蛋白含图像应该包含所有视觉线索。选择一个区域内的毛细血管襻还注意的平均强度读数。下一页鲍曼的空间内，并注意选择一个区域的平均强度读数。这些将被用来作为背景值。
4. 定量，选择类似的鲍曼的空间区域内的白蛋白containing图像。做到这一点的至少两个其他地区鲍曼的空间内的平均​​强度的平均值。
5. 选择毛细血管襻最亮的等离子强度和它周围绘制一个区域。其次，利用阈值函数，突出循环血浆内明亮的价值，避免循环RBC的暗条纹。请注意所选的等离子体空间的平均强度值。血浆中的明亮区域是很重要的优先选择，因为血液内的因素，只会导致血浆荧光水平的低估。
6. 使用Microsoft Excel电子表格中输入值来计算GSC：

Representative Results

图3显示拍摄的图像，例如，从一个表面肾小球慕尼黑WistarFrömter的大鼠和所采取的步骤，以确定荧光蛋白的渗透性。 GSC的白蛋白的值0.0111来自这个人肾小球下降的慕尼黑Wistar大鼠的供给条件³时，该菌株在看到的范围内。在这些图像中看到的稳定性是由于仔细地规划和在图1和图2中所示的指令的执行。如前所述，切口的位置外肾是最关​​键的一步，在生产稳定的图像无运动伪影。

图1。定位方向的详细图解大鼠前显微镜舞台上成像。轻轻地将大鼠肾脏面朝下（如在A所示），在Repti千卡加热垫与肾脏铺设盖玻片菜。轧辊肾脏向外（*），使腹侧盖玻片接触 ​​底部和接触被用高压釜中的磁带（AT）。为了最大限度地减少呼吸引起的运动，向前滚动大鼠（**）使胸部正上方的区域盖玻片菜。填补了0.9％无菌生理盐水和水套盖菜。使用温度计来监测直肠温度和开启和关闭需要的REPI千卡垫点击这里查看大图 。

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图2。肾外化在慕尼黑Wistar大鼠放置在显微镜阶段前的麻醉大鼠置于其左侧的尺寸可达;剃光之间的肋骨和大腿上部区域（以灰色显示，A）。一旦连续的切口是在A线穿越肾脏划破皮肤，外内肌肉层。肾脏相关的肾周脂肪应该是可见的（B）。使用一对镊子，脂肪捏在手手的时尚，直到最下达到极点（BE）。轻轻挤压下面积肾，而脂肪exteriorize拉点击这里查看大图 。

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图3。单平面图像3D卷慕尼黑Wistar大鼠肾小球面板A和B显示的背景图片和采取〜12分钟后输液德州红鼠血清白蛋白（TR-RSA）在黑色和白色。注意缺乏明显的强度毛细血管袢（CL）或鲍曼的空间（BowSp）的背景图像中的（A）。 C显示面板从面板区域，在伪更好地可视化的组织水平低强度背景。在这里，一个小的区域绘制在毛细管循环（更长的区域），并在鲍曼估计荧光白蛋白输注后获得的值必须减去预先存在的荧光强度水平的空间之内。面板D和E是采取n从B组，并显示在伪。三个小区域还鲍曼的空间中绘制用于 ​​计算荧光白蛋白，横过过滤屏障（D）的平均强度。对各个区域的平均照度值的报道中突出显示的区域内的“显示区统计”对话框（图D）。计算循环内毛细血管袢（CL，在面板E）等离子强度值绘制在一个大区域最亮的毛细血管襻和明亮值以及突出显示的阈值函数使用（显示橙色像素）。只有以橙色高亮显示的像素的强度值将被报告，无论周围的区域的形状或尺寸。面板E'内毛细血管袢白蛋白的原料平均强度值，注意选中“使用强度测量的阈值”框检查。面板的F显示值的进展形成左到右开始毛细管循环和鲍曼的空间内获得的图像从原始值中减去背景值。一旦来自校正后的值，鲍曼的空间强度值除以在毛细管循环强度值，得到的肾小球筛分系数这是磁导率的比率;不能渗透分子为零（0）的值，而这些，被可自由过滤一（1）有一个值。酒吧= 20微米。 点击这里查看大图 。

图4。过滤荧光蛋白的吸收主要发生我n的早期段的近端小管的S1。小组A示出了横截面的肾小球和S1段〜20分钟后输注初始得克萨斯红RSA丸剂。鲍曼的开放空间和狂热的吸收白蛋白（红色）是在S1段的节目。图B示出了浅20μm的相同的数据集的3D投影。图C显示了3D投影，采用低功耗20倍的目标，约60分钟后输液。注意面板中看到同样的肾小球A和B在C（*）和更高水平的白蛋白检索看到该分部与其他近端小管段所示。酒吧= 20微米。 点击这里查看大图 。

Discussion

这里强调的步骤代表我们的感受是，将产生一致和准确的渗透值，因为他们规避以下陷阱：

1. 散射：使用红色发光的荧光基团可以更有效地收集光，因为较长的波长的光子是不容易分散。使用绿色或蓝色发光荧光团将在GSC的引入更大的变化，因为增加了毛细血管袢和鲍曼的空间变异强度值。
2. 图像深度：尽管深通常是收集3D数据集（通常是总深度在30-45微米之间）;高10-15微米代表震源深度最合适的确定GSC值。再次更深的深度来，在灵敏度和变化性的增加，由于发射的光子的散射减少。然而更重要的是拥挤发生毛细血管袢ð肾小球内eeper。在这里，毛细血管袢推高密切鲍曼的胶囊鲍曼的空间周围的边缘。这无意中选择一个区域，直接超过了无数足细胞周围的毛细血管循环的机会增加。这会导致低估GSC的，因为真正的，更高强度的过滤白蛋白不会被报告。注意面板B和D在图3和毛细管循环的边缘和边缘鲍曼的空间³空间之间存在大量的。
3. 采样：选择几个地区鲍曼的空间内，确保检测过滤白蛋白水平的最佳逼近。同样重要的是，以避免区域，如11和12点的位置，毛细管循环。通过三维体积为重点，揭示了几乎陷入横向略低于焦平面毛细血管袢。这个区域将给予虚假GSC值升高高估过滤白蛋白。相反，重要的是选择明亮的部分于毛细血管循环的等离子体，以更好地确定真正的循环荧光白蛋白水平。这里低估这些水平也将增加GSC通过减少在方程中的分母的值。

这种技术的验证时，由成像GSC的一（1）的化合物与可自由过滤。在这里，关注持续低估血浆白蛋白，由于光学限制负责高估白蛋白的通透性，无效^3。此外，已确定为70kDa的葡聚糖一个GSC值，几乎是相同的，通过以下方式获得检测尿中清场/血浆水平和微注射证明活体2光子显微镜能够正确地确定的磁导率的荧光大分子^2。最后，能够快速可视化日ê肾小球和肾小管段沿的滤液路径，具有高度的分辨率，独特的双光子显微镜站准备量化的肾小球滤过屏障和PT在确定protienuria和蛋白尿的重要性。

本文中所述的协议是基于使用的双光子系统与一个倒置的阶段，这一点有利于在涉及外科手术和大鼠放置在舞台上的简单性。直立阶段利用双光子系统的信息，请参见Dunn 等⁷流式细胞仪（2007）在当前协议。

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Olympus Floview 1000 confocal/Multi-photon microscope	Olympus America		Filters for detectors: Blue 430/100, Green 525/50, Red 605/90
Mode-Locked Ti:Sapphire Mai Tai Laser	Spectra-Physics		Tunable excitation wavelengths: ~750-1150 nm
Gallium arsenide phosphide photodetectors	Hamamatsu Corp		Note: Front or Side mounted configurations available.
Metamorph Image processing Software	Molecular Dynamics		Note: Version 6.1r1
Microsoft Excel	Microsoft Corportation		2007 version
Handling Forceps	Electron Microscopy Sciences	Cat# 78266-04
Mayo Dissecting Scissors	Electron Microscopy Sciences	Cat# 72962
CA Micro scissors Model 1C300	Electron Microscopy Sciences	Cat# 78180-1C3
Kelly Hemostatic Forceps (straight)	Electron Microscopy Sciences	Cat# 72930
Water Jacket Blanket + Heating Pad	Gaymar		T/Pump PN 11184-000 Blanket-66N111CC
Repti-Therm Under Tank Heater	ZooMed		RH-4
Texas Red Sulfonyl Chloride	Invitrogen/Molecular Probes	Cat# T-353
Rat Serum Albumin	Sigma Aldrich	Cat# A-6272
High Quality Anhydrous DMF	Sigma Aldrich	Cat# 270547
Strate-Line Autoclave Tape	Fisher Scientific	Cat# 11-889-1
Willco-dish Coverslip Bottom Dishes (50 mm/40 mm coverslip)	Electron Microscopy Sciences	Cat# 70665-07