Kvantifisere Glomerular permeabilitet i Fluorescent Macromolecules Bruke 2-Photon Mikroskopi i München Wistar rotter

Summary

En teknikk utnytte høy oppløsning intavital 2-foton mikroskopi å direkte visualisere og kvantifisere gloemrular filtrering i overflaten glomeruli. Denne metoden gjør det mulig for direkte bestemmelse av permeabilitet av makromolekyler i både normale og syke tilstander.

Abstract

Kidney sykdommer som involverer tap av store urin-essensielle makromolekyler, slik som serumalbumin, har lenge vært antatt å være forårsaket av forandringer i permeabilitet barriere består av podocytes, vaskulære endotelceller, og en basalmembran arbeider i samklang. Data fra vårt laboratorium ved hjelp intravital 2-foton mikroskopi avslørte en mer gjennomtrengelig glomerulær filtrering barriere (GFB) enn tidligere antatt i henhold fysiologiske forhold, med henting av filtrert albumin forekommer i en tidlig undergruppe av celler som kalles proksimale tubulære celler (PTC) ^{1,2, 3.}

Tidligere teknikker som brukes til å studere nyrefiltrasjon, etablere de karakteristiske for filtrerings-barriere involvert micropuncture av lumen av disse tidlige rørformede segmenter med prøvetaking av væskeinnhold og analyse ^4.. Disse studier fastslått albuminkonsentrasjon i den luminale væske for å være praktisk talt ikke-eksisterende, tilsvarende tettmed det som normalt detekteres i urinen. Avslørte imidlertid karakterisering av dekstran polymerer med definerte størrelser til denne teknikken de av en størrelse lik serumalbumin hadde høyere nivåer i den rørformede lumen og urin; tyder økt permeabilitet ^5..

Heri er en detaljert skisse av den teknikk som brukes til direkte å visualisere og kvantifisere glomerulær fluorescerende albumin permeabilitet in vivo. Denne metoden gjør det mulig for påvisning av filtrert albumin over filtrering barriere i Bowmans plass (den første kammer av urin filtrering), og også tillater kvantifisering av albumin reabsorpsjon av proksimale tubuli og visualisering av påfølgende albumin transcytosis ^seks. Fraværet av fluorescerende albumin sammen senere rørformede segmenter vei til blæren fremhever effektiviteten av henting veien i tidligere proksimale tubulære segmenter. Dessuten, når denne teknikken ble brukt bestemme permeabilitetav dextraner har en lignende størrelse til albumin nesten identiske permeabilitet verdier ble rapportert ^to. Disse observasjonene direkte støtter behovet for å utvide fokus for mange proteinuric nyresykdommer til inkluderte endringer i proksimale tubuli celle gjenvinning.

Protocol

1. Bøyning av Rat Serum Albumin til Sulfo-Rhodamine 101 sulfonyklorid (Texas Red)

1. Oppløs 100 mg Rotte serumalbumin (RSA) i 6,667 ml av 100 mM natriumbikarbonat, pH 9,0, sluttkonsentrasjon 15 mg / ml i en 50 ml konisk rør.
2. Sted oppløsning i is / vann begerglass og avkjøl til mellom 0-4 ° C.
3. Tilsett 200 ul av høy kvalitet vannfritt dimetylformamid (DMF) til en 10 mg ampulle med Texas Red sulfonylklorid (TRSC); vortex på medium i 15 sek.
4. Vortex RSA løsning på medium og tilsett oppløst TRSC.
5. Wrap 50 ml konisk i folien (Parafilm kan brukes for å sikre en tett forsegling dannes), sted horisontalt i is bøtte m / is og bare sted på rocker å agitere løsningen langsomt (unngå bobledannelse), tillate reaksjonen å fortsette ved 0 til 4 ° C i 1 time.
6. Lag 5 L av 0,9% saltløsning, og kan fjernes med en 50 kDa molekylvekt avskåret kammer som enten kan være a) dialysemembran med klips, b) dialysis slange som i en flottør-en-lyzer, eller c) skyv-en-lyzer kassett (alle egnet for å fjerne ukonjugert TRSC).
7. Plasser reaksjonsblandingen i dialyse-kammeret og plass i 5 l beholder w / i 0,9% saltløsning, Dialyser natten ved 4 ° C med en svak omristing ved hjelp av en rørestav.
8. Endre 5 L dialyse løsning i morgen og sen ettermiddag til en overnatting inkubasjon resulterer i nesten ingen fargeendring (Dette tar vanligvis ~ 48 timer med minst 4 børser). I tillegg, med MWCO på 50 kDa være så nær den MV på RSA, 66kDa, er det mulig å aldri dannet en klar oppløsning, og dette vil være avhengig av fordelingen i porestørrelsen til membranen, 60 timer og 5 er utvekslinger mer enn nok tid.
9. Mål volum og dele den opprinnelige vekt av 100 mg av volumet for å gi omtrentlig konsentrasjon av TR-RSA, vanligvis konsentrasjoner område 10-13 mg / ml. Den endelige dye: albumin ratio bør være ~ 04:01, en fluorophore per 15,000 Daltons protein MW. Oppbevar ved 4 ° C, ALDRI fryse TR-RSA-løsning, som resulterer fragmentering som kan oppstå vil endre permeabilitet verdier.

2. Klargjøre Inverted Microscope Stage for Imaging / Microscope Innstillinger

1. Plass ~ 4-7 stykker av autoklav tape (ca. ¾ "lang) perfekt stablet over hverandre i en 50 mm skål med en 40 mm dekkglass bunn (dekkglass nederste tallerken). Dette bør plasseres nærmere en av kantene, slik at kant av båndet i kontakt med kanten av krumningen av nyren, men ikke blokkerer den objektive lysbane (figurene 1A og 1B), idet større rotter vil kreve mer plass mellom båndet og kanten av fatet.
2. Plasser to Repti-Therm pads ved siden av scenen sammen med 50 mm fatet (figur 1A). Plasser en oppvarming vann jakke teppe over scenen.
3. Maksimere effektiviteten ved innsamling bilder ved å sikre målet turret har en 10x luft or 20x (luft eller vann nedsenking) objektiv og en høyere drevet vannimmersjonsobjektiv å samle bilder for kvantifisering.
4. Under bildebehandling den mest effektive måten å legge vann til målene er å rotere dem til side og tilsett vann ved hjelp av en 1 cc sprøyte med et langt stykke PE-200 rør som kan nå toppen av målene.
5. Sett eksitasjon intensiteten av laser til 10watt ~ 15-20% ved hjelp av nøytral tetthet filtre på programvare. De gallium-arsenide phosphide ikke-descanned photodetectors er satt til 750 for å samle grønne utslipp, og 625 for å samle røde utslipp. Blå utslipp (slik som den kjernefysiske flekken Hoechst 33342) er samlet ved hjelp av en standard nondescanned multialkaline detektor med en innstilling mellom 750-800.
6. For å sikre korrekt samling av de lav intensitet utslipp innenfor Bowman er plass, må den nedre grensen for detektorene er satt for ikke å utelukke disse verdiene. Visuell advarsel markører vil vise om følsomhetener for lav, og disse verdiene blir gitt en intensitet verdien null.
7. Legg en 1 cc sprøyte med ~ 5-8 mg av fluorescerende albumin fortynnet med 0,9% sterilt saltvann for å få opp det totale volumet til en cc.

3. Utsette Nyre i en München Wistar rotte for Intravital 2-Photon Imaging

1. Begynn med en pre-bedøvet rotte ved hjelp Pentabarbitol (50 mg / ml oppløsning, 120 μl/100 g kroppsvekt), Inactin (130 mg / ml oppløsning, 120 μ/100 g kroppsvekt), eller isofluorane (5% induksjon, 1.5 til 2,5% vedlikehold), et inneliggende venøs tilgang linje (enten jugular eller femoral venøs), og venstre flanke barbert fra like under brystkasse til like over venstre lår.
2. Plasser rotte flat på høyre side slik at venstre, barbert side vender opp, sørg for at det er flatt på bordet, med sin holdning langstrakt og ikke huket, med forbeina berører hverandre og bak poter berører hverandre (Figur 2A). Veldig forsiktig palpate å føle nyrene for å avgjøre hvor det naturlig legger i retroperitoneum og trekke en rett linje parallelt med kroppen (fra brystkasse til låret) med en tusj (Figur 2A).
3. Plukk opp huden med et par toothed tang og klemme huden langs den tegnede linjen ved hjelp av et par hemostats å knuse vev og hindre blødning. Skjær langs snittet bruke et par kirurgisk saks. Knusing den ytre hud og muskel lagene før skjæring vil dramatisk redusere og vanligvis eliminere blødning.
4. Gjenta denne fremgangsmåten for den ytre muskel laget, som er tynne.
5. For snittet inn i den indre muskel laget, som vil eksponere peritoneum, re-palpate nyre for å estimere størrelse. Knip et snitt linjen mindre enn nyrene, forsikrer snittet er litt over nyrene. Det er best å gjøre dette snittet for lite og gjøre den større om nødvendig. Dersom dette gjøres for stor, vil sutur være nødvendig.Denne siste snittet er kritisk, for langt over i hvilken som helst retning vil påvirke stabiliteten på scenen og indusere enten bevegelsesfeil fra puste (best case scenario) eller vil strekke nedsatt pedicle og negativt redusere renal perfusjon (worst case scenario).
6. Lokaliser nyre (som vist i figur 2B) og grep omkring fett ved å anvende pinsett, som arbeider mot bunnen pol av nyre i en hånd over hånd mote.
7. Når nedre pol av nyre er nådd, trekker nyrene gjennom snittet, mens svært forsiktig klemme under nyre til exteriorize. Hvis snittet er for liten, knuse muskel lag og kuttet å utvide det, gjenta prosedyren til exteriorize nyre.

4. Plassere München Wistar rotte på scenen for Imaging

1. Plasser nyre mot kanten av dekkglasset fatet med nyre litt rotert mot det dorsale (baksiden) av rotte så den ventrale side av nyre jegs å ta kontakt med dekkglass bunnen fatet (figur 1A). Legg en varmet, steril 09.% Saltløsning til parabolen.
2. Se gjennom 10x eller 20x objektiv og se etter bevegelse. Hvis det registreres bevegelse, rulle rotta løpet litt slik thorax er lenger borte fra dekkglass bunnen fatet, sørg for at nyrene er så nær kanten av fatet uten å strekke renal pedicle (Figur 1B).

5. Anskaffelse bilder til Kvantifisere Nedsatt permeabilitet av Albumin

1. Beregning av glomerulære permeabilitet (Glomeruluar Sikting koeffisient; GSC) av alle Makromolekyl vil kreve å ta referanse bakgrunnsbilder av individuelle glomeruli før infusjon av fluorescerende molekyl. Hvis mikroskop er utstyrt med en motorisert stadium i stand til merking steder, finne og senter individuelle glomeruli ved hjelp av lavere drevet objektiv og markere hvert sted. En dobbel pass Fluorescein / Rhodamine epifluorescence filter er ideelt for denne prosedyren selv enten utslipp filter vil fungere (fase kontrast eller andre ikke-fluorescens kilder til belysning vil ikke fungere). Glomeruli vises som tomme sirkulære strukturer omgitt av proksimale tubuli som har en iboende gul-oransje autoflourescence sett gjennom den doble pass filter.
2. Hvis mikroskop ikke har en motorisert stadium, skanne nyrene i et raster mønster med lavt strømforbruk objektiv og gjøre en elementær kart over hvor den enkelte glomeruli er plassert i, avhengig av naturlige landemerker som store overfladiske blodkar som ligger over nyre kapsel eller fett flekker.
3. Slå turret til høyere makt vannimmersjonsobjektiv og ta 3D-datasett av hver glomeruli å sørge for kapillær looper og Bowmans plass er klart synlig. Ved hjelp av en PseudoColor palett (noe annet enn B / W) vil bidra til å visualisere disse strukturene.
4. Fokusering på en overfladisk blodåre sakte sette mot i than fluorescerende albumin gjør at tid er gitt for å tillate systemisk distribusjon. For molekyler med lav GSC er det viktig å maksimere intensitetsverdiene i plasma, men ikke til å nå nivåer som vil mette foto-detektorer i mikroskopet. Dette øker detectability filtrerte molekyler. Merk: det er vanligvis en 5-7 sek lapse mellom tiden den fluorescerende albumin er introdusert til den tiden det vises på skjermen (anskaffe full rammer på ~ en ramme / sekund).
5. Tillat ca 10 min for å tillate eventuelle lav molekylvekt fragmenter for å fjerne før innsamling av 3D-volumer på omkring 1 pm mellomrom for å bli benyttet ved beregning av albumin GSC. Vanligvis har den Simonsens stamme av München Wistar rotter langt færre overflate glomeruli, så alt som kan visualiseres er avbildes og kvantifiseres. Den Frömter belastningen har et langt større antall, slik at vi begrense antallet kvantifisert til ~ 10.
6. Ved slutten av studien rotten avlives ved hjelp av en overdose av anesthetic brukt i studien. En dobbel pneumothoracotamy er utført for å sikre aktiv dødshjelp.

6. Beregning GSC for Fluorescent Albumin fra 3D Volumene

1. Ved hjelp Metamorph bildebehandling laste 3D datasett for hver glomeruli, både bakgrunnen sett og satt tatt etter infusjon av fluorescerende albumin.
2. I volumet som inneholder fluorescerende albumin finne en overfladisk kapillært sløyfe med nok plass tomrom mellom sine definerte marginer og kanten av Bowman kapselen.
3. I bakgrunnen volum finne samme fokusplan som skal inneholde alle de visuelle signaler av albumin som inneholder bildet. Velg en region i kapillært løkke av interesse og legg merke til middels intensitet lesing. Neste velge en region i den Bowman er plass og legg merke til middels intensitet lesing. Disse vil bli brukt som bakgrunnsverdier.
4. For kvantifisering, velger du tilsvarende region i Bowmans plass i albumin containing bilde. Gjør dette minst to andre regioner for å ta en gjennomsnittlig verdi for den gjennomsnittlige intensiteten innenfor Bowman er plass.
5. Velg kapillær sløyfe med den lyseste plasma intensitet og tegne en region rundt det. Neste bruker terskel, merker de lyse verdier innenfor sirkulerende plasma, unngå mørke striper som sirkulerer RBC-tallet. Legg merke til middels intensitet verdier av den valgte plasma plass. Det er viktig å fortrinnsvis velge de lyse delene av plasma fordi faktorer i blodet vil bare tjene til å føre og undervurdering av plasma fluorescens nivåer.
6. Ved hjelp av en Microsoft Excel-regneark inn verdiene for å beregne GSC der:

Representative Results

Figur 3 viser et eksempel på et bilde som er tatt fra en overflate av en glomerulus Munchen Frömter Wistar rotte og de ​​skritt som er tatt for å bestemme permeabiliteten av fluorescerende albumin. GSC verdi for albumin på 0,0111 avledet for denne personen glomerulus faller innenfor området sett i denne stamme av München Wistar rotter når i matet tilstand ^tre. Stabiliteten sett i dette bilde er på grunn av den nøye planlegging og utførelse av instruksjoner som er avbildet i figurene 1 og 2.. Som nevnt tidligere, er plassering av snitt brukes i eksteriorisere nyrene det mest avgjørende skritt i å produsere stabile bilder uten bevegelsesartefakt.

Figur 1. Et detaljert skjema for å posisjonere en orienteringav rotte på mikroskopet scenen før bildebehandling. Forsiktig lå rotte nyre ned (som vist i A) over Repti-Therm varmeputer med nyrene legging i dekkglass parabolen. Rull nyre utover (*) slik at baksiden side berører dekkglass bunnen og kommer i kontakt med den autoklav tape (AT). For å minimere puste indusert bevegelse, rulle rotte fremover (**) slik at thorax er ut av området umiddelbart over dekkglass parabolen. Fyll formen med steril 0,9% saltvann og dekk med vann jakke. Bruk et termometer for å overvåke rektal temperatur og slå Repi-Therm-pads av og på etter behov. Klikk her for å se større figur .

: Src = "/ files/ftp_upload/50052/50052figure2highres.jpg" />
Figur 2. . Exteriorization av nyre i München Wistar rotte før plassering på mikroskop scenen En bedøvet rotte er plassert med sin venstre størrelse opp, området mellom brystkassen og øvre del av låret barbert (vises i grått, A). Når sekvensielle snitt er laget for å skjære gjennom huden, muskel ytre deretter indre lag, som vist ved hjelp av linjen krysser nyrene hos A. Nyrene med tilhørende peri-renal fett skal være synlig (B). Ved hjelp av en pinsett, er fettet sammenklemt på en hånd-over-hånd måte inntil den nedre mest pol er nådd (BE). Klem forsiktig på området under nyre mens du trekker på fett å exteriorize. Klikk her for å se større figur .

052/50052figure3.jpg "alt =" Figur 3 "fo: content-width =" 5.5in "fo: src =" / files/ftp_upload/50052/50052figure3highres.jpg "/>
Figur 3. En plans bilder tatt fra 3D volumer viser en glomerulus av en München Wistar rotte. Paneler A og B viser bakgrunnsbilder og en tatt ~ 12 min etter infusjon av Texas Red Rat Serum Albumin (TR-RSA) i svart og hvitt. Legg merke til mangelen merkbar intensitet av kapillære sløyfer (CL) eller Bowmans plass (BowSp) i bakgrunnsbildet (A). Panel C viser en region tatt fra panel A i PseudoColor å bedre visualisere lav intensitet bakgrunnsnivåer av vev. Her blir en liten region trukket i en kapillær sløyfe (lengre region) og innenfor Bowman er plass til å estimere eksisterende fluorescerende intensitet nivåer som må trekkes fra verdiene oppnådd etter infusjon av fluorescerende albumin. Paneler D og E er tan fra panel B og vist i PseudoColor. Tre små regioner av interesse trukket i Bowman er plass brukes til å beregne den gjennomsnittlige intensiteten av fluorescerende albumin som har flyttet over filtrering barriere (D). Gjennomsnittlig intensitet verdier for de enkelte regioner ble rapportert i det uthevede området innenfor "Vis Region statistikk" dialogboksen (panel D '). For å beregne de sirkulerende plasma intensitet verdier innenfor kapillær looper (CL, i panel E) en stor region trekkes over smarteste kapillær loop og de ​​lyse verdier langs uthevet ved hjelp av en terskel (vist et oransje piksler). Bare intensitet verdier av pikslene uthevet i oransje vil bli rapportert uavhengig av formen eller størrelsen på den omkringliggende regionen. Panel E 'viser rå middels intensitet verdier av albumin i kapillær looper, merk sjekket "Bruk Threshold For Intensity Målinger" boksen som ersjekket. Panel F viser utviklingen av verdier danner venstre til høyre starter med bakgrunnen verdier for kapillær looper og Bowmans plass, som trekkes fra de ubehandlede verdiene oppnådd innenfor bildene. Når de korrigerte verdier blir avledet, er Bowmans plass intensitet verdien delt på Capillary Loop intensitetsverdi for å gi den glomerulære Sieving koeffisient som er et forhold mellom permeabilitet; impermeant molekyler har en verdi på null (0), mens de som er fritt filtrert har en verdi på én (1). Bar = 20 mikrometer. Klikk her for å se større figur .

Figur 4. Opptak av filtrert fluorescerende albumin forekommer hovedsakelig in den tidlige delen av proksimale tubulus, S1. Panel A viser et tverrsnitt av en glomerulus og S1-segmentet tatt ~ 20 min etter infusjonen av den innledende Texas Red RSA bolus. Den åpne Bowmans plass og ivrig opptak av albumin (rød) er show i S1-segmentet. Panel B viser et grunt 20 mikrometer 3D projeksjon av det samme datasettet. Panel C viser en 3D-projeksjon med en lavere effekt 20x objektiv ca 60 min etter infusjonen. Legg merke til den samme glomerulus sett i paneler A & B vist i C (*) og høyere nivåer av albumin gjenfinning sett i det segmentet versus andre proksimale tubulære segmenter. Bar = 20 mikrometer. Klikk her for å se større figur .

Discussion

Trinnene uthevet her representerer hva vi føler for å være de som vil produsere konsistente og nøyaktige permeabilitet verdier fordi de omgå disse fallgruvene:

1. Spredning: Bruken av en rød emitting fluorophores rette for mer effektiv innsamling av lys siden lengre bølgelengde fotoner er mindre tilbøyelige til å spre seg. Ved hjelp av enten grønne eller blå emitting fluorophores vil innføre større variasjon i GSC er på grunn av økt variasjon i intensitet verdier fra kapillær looper og Bowman er plass ^tre.
2. Bildedybde: Selv dype 3D datasett er vanligvis samlet (ofte mellom 30-45 mikrometer i total dybde), de øverste 10-15 mikron representerer de mest aktuelle fokale dybder å bestemme GSC verdier. Igjen med dypere dybder kommer en reduksjon i følsomhet og en økning av variasjonen på grunn av refleks fra fotoner som sendes ut. Enda viktigere er imidlertid den trengsel av kapillær looper som oppstår deeper i glomerulus. Her er kapillære loops presset opp tett til kanten av Bowman kapselen rundt Bowman sin plass. Dette øker sjansene for utilsiktet å velge et område rett over en av de mange podocytes som omgir kapillær looper. Dette vil føre til en undervurdering av GSC er fordi den sanne, høyere intensitet av den filtrerte albumin ikke vil bli rapportert. Note Panel B og D i figur 3 og den store mengden av tilstede mellom kanten av de kapillære sløyfer og kanten av Bowmans plass ^3..
3. Prøvetaking: Velge flere regioner innenfor Bowman er plass sikrer den beste tilnærming til å oppdage filtrert albumin nivåer. Det er også viktig å unngå områder som 11 og 12:00 posisjon over kapillær looper. Fokusering gjennom 3D volumet avslører et sett av kapillære sløyfer fanget nesten tverrstilte like under fokalplanet. Dette området vil gi et falskt forhøyet GSC verdi avoverestimating filtrert albumin. Omvendt, er det viktig å velge den lyseste del av plasmaet innenfor kapillære sløyfer å best fastslå den virkelige nivåer av sirkulerende fluorescerende albumin. Her underestimating disse nivåer vil også øke GSC ved å redusere verdien av nevneren i ligning.

Validering av denne teknikken skjer ved bildebehandling en fritt filtrert forbindelse med en GSC på ett (1). Her bekymringer som konsekvent undervurderer albumin i plasma, på grunn av optiske begrensninger være ansvarlig for overestimating albumin permeabilitet, blir annullert ^tre. I tillegg, etter å ha bestemt en GSC verdi for en 70kDa dekstran som er praktisk talt identisk med den som ble oppnådd ved å måle urin klaring / plasmanivåer og micropuncture bevise intravital to-foton mikroskopi er i stand til korrekt å bestemme permeabiliteten av fluorescerende makromolekyler ^2. Til slutt, evnen til raskt visualisere the glomerulus og rørformede segmenter langs filtratet banen, med en høy grad av oppløsning, to-foton mikroskopi står unikt posisjonert for å kvantifisere betydningen av glomerulær filtrering barriere og PT i å bestemme protienuria og albuminuri.

Fremgangsmåter beskrevet her, er basert på bruk av en to-foton-system med en invertert fase som har fordeler i enkelhet av de kirurgiske prosedyrer involvert og rotte plassering på scenen. For informasjon om å benytte en to-Photon system med en oppreist scenen i kapitlet av Dunn et al. ⁷ i Dagens Protokoller i Cytometry (2007).

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Olympus Floview 1000 confocal/Multi-photon microscope	Olympus America		Filters for detectors: Blue 430/100, Green 525/50, Red 605/90
Mode-Locked Ti:Sapphire Mai Tai Laser	Spectra-Physics		Tunable excitation wavelengths: ~750-1150 nm
Gallium arsenide phosphide photodetectors	Hamamatsu Corp		Note: Front or Side mounted configurations available.
Metamorph Image processing Software	Molecular Dynamics		Note: Version 6.1r1
Microsoft Excel	Microsoft Corportation		2007 version
Handling Forceps	Electron Microscopy Sciences	Cat# 78266-04
Mayo Dissecting Scissors	Electron Microscopy Sciences	Cat# 72962
CA Micro scissors Model 1C300	Electron Microscopy Sciences	Cat# 78180-1C3
Kelly Hemostatic Forceps (straight)	Electron Microscopy Sciences	Cat# 72930
Water Jacket Blanket + Heating Pad	Gaymar		T/Pump PN 11184-000 Blanket-66N111CC
Repti-Therm Under Tank Heater	ZooMed		RH-4
Texas Red Sulfonyl Chloride	Invitrogen/Molecular Probes	Cat# T-353
Rat Serum Albumin	Sigma Aldrich	Cat# A-6272
High Quality Anhydrous DMF	Sigma Aldrich	Cat# 270547
Strate-Line Autoclave Tape	Fisher Scientific	Cat# 11-889-1
Willco-dish Coverslip Bottom Dishes (50 mm/40 mm coverslip)	Electron Microscopy Sciences	Cat# 70665-07