Münih Wistar Sıçanlarda 2-Foton Mikroskopi kullanarak Floresan Makromoleküllerin Glomerüler geçirgenliği miktarının

Summary

2-foton mikroskopi yüksek çözünürlüklü intavital kullanan bir teknik doğrudan görselleştirmek ve yüzey glomerüllerde gloemrular filtrasyon ölçmek için. Bu yöntem, normal ve hastalıklı hem Devletler makromoleküllerin geçirgenlik özelliklerinin doğrudan belirlenmesi için olanak sağlar.

Abstract

Bu albümin serum, uzun geçirgenliği podocytes oluşan bariyer, damar endotel hücreleri ve uyum içinde çalışan bir bazal membran değişiklikler neden olduğu düşünülmüştür gibi büyük temel makromoleküllerin idrar kaybı, ilgili Böbrek hastalıkları. Intravital 2-foton mikroskopi kullanılarak laboratuarda elde edilen veriler, proksimal tübül hücreleri (PTC), ^1,2 adlandırılan hücrelerin erken altkümedeki süzüldü albümin alma ile daha önce fizyolojik koşullar altında düşünce göre daha geçirgen glomerüler filtrasyon bariyer ^(GFB), ortaya ^3.

Önceki teknikler böbrek filtrasyon incelemek için kullanılır ve sıvı içerik ve analiz ⁴ örnekleme ile bu ilk boru bölümlerinin lümeninin micropuncture dahil Süzme bariyerinin karakteristik kurulması. İlgili yakından; Bu çalışmalar yok denecek kadar olması luminal sıvı albümin konsantrasyonu tespitnormalde idrarda tespit ne için. Ancak, bu teknik tarafından tanımlanan boyutlar ile dekstran polimerlerin karakterizasyonu serum albümin benzer bir büyüklükte, ortaya boru şekilli lümeni ve idrarda yüksek seviyelere sahipti; artan geçirgenliği ⁵ düşündürmektedir.

Burada doğrudan görselleştirmek ve in vivo olarak glomerüler floresan albümin geçirgenliği ölçmek için kullanılan tekniğin ayrıntılı bir taslak olduğunu. Bu yöntem, Bowman adlı kullanıcının alanı (idrar filtrasyon ilk odası) içine filtrasyon bariyeri genelinde filtre albumin tespiti için izin verir ve aynı zamanda proksimal tübüllerde ve sonraki albümin transcytosis ⁶ görselleştirme ile albümin reabsorbsiyonu ölçümü sağlar. Mesane yolda daha sonra boru segmentleri boyunca floresan albumin yokluğu önceki proksimal tübül segmentlerinde alma yolunun etkinliğini vurgulamaktadır. Ayrıca, bu teknik uygulandığında geçirgenliğini saptamak içinalbumin, hemen hemen aynı geçirgenlik değerlerine benzer bir boyutu olan dekstranlar ^2. bildirildi. Bu gözlemler doğrudan proksimal tübül hücre ıslahı dahil değişiklikler için birçok proteinürik böbrek hastalıklarının odak genişletmek için ihtiyaç destek.

Protocol

1. Sulfo-Rodamin 101 Sülfanil Klorür (Texas Kırmızı) için Albümin Rat Serum Çekimi

1. Nihai konsantrasyon 50 ml konik bir tüp içinde 15 mg / ml, 100 mM sodyum bikarbonat pH 9.0 arasında Rat (RSA) Serumu Albümini 6.667 ml, 100 mg çözülür.
2. Yeri buz / su kabı çözüm ve 0 ile 4 ° C arasında serin
3. 15 saniye boyunca ortam üzerinde girdap; Texas Kırmızı sülfonil klorit (TRSC) bir 10 mg flakon için yüksek kaliteli susuz dimetil formamid (DMF) içinde 200 ul ekleyin.
4. Vortex RSA ortamda çözüm ve çözünmüş TRSC ekleyin.
5. Folyo ile sarın 50 ml konik (oluşan Parafilm sıkı bir mühür sağlamak için kullanılabilir), yatay w / buz sadece ve yeri (kabarcık oluşumunu önlemek) yavaş yavaş çözüm kışkırtmak için rocker üzerinde buz kovası yer, reaksiyon 0 devam etmesine izin 4 ° C'de 1 saat boyunca kanştınldı.
6. % 0.9 serum fizyolojik 5 L olun ve klipleri ile ya) diyaliz membran olabilir odası kesilmiş bir 50 kDa molekül ağırlığı, b) di ıslakbir float-bir-leriyle, veya c) slayt-bir-leriyle kaset (indirekt TRSC kaldırmak için tüm uygun) olduğu gibi alysis boru.
7. 5 litrelik konteyner w /% 0.9 tuzlu su çözeltisi içinde diyaliz bölmesi ve bir yerde yer Reaksiyon karışımı, bir karıştırma çubuğu kullanılarak hafif çalkalama ile 4 ° C'de gece boyunca dialyze.
8. Neredeyse hiç renk değişimi bir gecelik inkübasyon sonuçları (Bu genellikle en az 4 değişim ile ~ 48 saat sürer) kadar sabah ve ikindi 5 L diyaliz solüsyonu değiştirin. Ayrıca, 50 kDa MWCO RSA, 66kDa en MW kadar yakın olmak, bu bir berrak bir solüsyon elde asla mümkün olduğunu, bu membran gözenek boyutu dağılımı bağlı olacaktır, 60 saat ve 5 değişim olduğu yeterli bir süre daha fazladır.
9. Ölçü hacmi ve TR-RSA yaklaşık konsantrasyon elde etmek için hacim ile 100 mg başlangıç ​​ağırlığı bölme, tipik konsantrasyon aralığı 10-13 mg / ml arasındadır. Son boya: albümin oranı 15,00 ~ 4:1 1 fluorofor olmalıdırProtein MW 0 Dalton. 4 ° C'de saklayın; oluşabilir parçalanması sonucu geçirgenlik değerleri değiştirecek gibi, TR-RSA çözüm FREEZE ASLA.

2. Görüntüleme / Mikroskop Ayarları için Ters Mikroskop Sahne hazırlanması

1. Yer ~ otoklav bant 4-7 parça (yaklaşık ¾ "uzunluğunda) mükemmel bir şekilde, bir 40 mm altındaki lamel (lamel alt çanak) sahip 50 mm'lik bir çanak içinde birbiri üzerine yığılmış. Bu kenar uçlarından biri ile daha yakın yerleştirilmesi gerekir, böylece bant kenarı böbrek eğrilik kenarı ile temas ancak objektif ışık yolu (Şekil 1A ve 1B) engellemez; büyük sıçan yemeğin bant ve kenar arasında daha fazla boşluk gerektirir.
2. 50 mm çanak (Şekil 1A) ile birlikte sahne yanında yer 2 Repti-therm pedleri. Sahne üzerinde bir ısınma su ceketi battaniye yerleştirin.
3. Objektif taret temin görüntüleri toplama bir 10x hava o olduğunda verimliliği maksimizer 20x (hava veya su daldırma) objektif ve kantitatif için görüntüleri toplamak için daha yüksek enerjili su daldırma hedefi.
4. Görüntüleme sırasında hedefleri su eklemek için en etkili yolu tarafa çevirin ve hedefleri üst ulaşabilirsiniz PE-200 boru uzun bir parça ile bir 1 cc şırınga kullanarak su eklemektir.
5. Yazılım nötral yoğunluk filtreleri kullanarak ~% 15-20 için 10watt lazer ikaz yoğunluğunu ayarlayın. Galyum-arsenit fosfit olmayan descanned fotodedektörler kırmızı emisyon toplamak için yeşil emisyon ve 625 toplamak için 750 olarak ayarlanır. Mavi emisyon (örneğin nükleer leke Hoechst 33.342 gibi) 750-800 arasında bir ayar ile standart nondescanned multialkaline dedektör kullanılarak toplanır.
6. Bowman alanı içinde düşük yoğunluklu emisyonlarının uygun toplama sağlamak için, dedektörlerin alt limitleri değerleri dışlamak için değil şekilde ayarlanmış olduğundan emin olun. Görsel uyarı işaretleri gösterir, hassasiyetayarı çok düşük ve bu değerler sıfır bir yoğunluk değeri verilmektedir.
7. 1 cc toplam hacmi getirmek için% 0.9 steril serum fizyolojik ile sulandırılmış floresan albumin çözüm ~ 5-8 mg ile 1 cc şırınga yükleyin.

3. Intravital için Münih Wistar Rat Böbrek açığa 2-Foton Görüntüleme

1. Pentabarbitol (50 mg / ml solüsyon, 120 μl/100 g vücut ağırlığı), Inactin (130 mg / ml solüsyon, 120 μ/100 g vücut ağırlığı) ya da izofloran (% 5 indüksiyonu, 1,5 ile bir ön anestezi sıçan başla ) 2.5% bakım, bir kalıcı venöz erişim hattı (ya juguler veya femoral ven), ve sol kanattan sadece göğüs kafesi altında sadece sol uyluk yukarıdan tıraş.
2. Bu yüzden onun sağ tarafındaki düz sıçan yerleştirin ki sol, tıraşlı yüzü yukarı bakacak, onun duruş uzatılmış ve (Şekil ön pençeleri birbirlerine dokunmadan birbirleriyle ve arka pençeleri dokunmadan, çömelmiş değil ile, masada düz olmasına dikkat edin 2A). Çok hafifçe doğal retroperiton içinde bırakır belirlemek ve bir Sharpie kullanarak vücudun (uyluk göğüs kafesi itibaren) (Şekil 2A) paralel düz bir çizgi çizmek için böbrek hissetmek palpe.
3. Dişli forseps bir çift ile cilt Pick up ve doku ezmek ve kanamayı önlemek için hemostat bir çift kullanarak çizilen hat boyunca cilt çimdik. Cerrahi bir makas kullanarak kesi boyunca kesin. Önce kesim için dış deri ve kas tabakaları Kırma önemli ölçüde azaltmak ve genellikle kanama ortadan kaldırır.
4. Ince dış kas tabakası, için bu yordamı yineleyin.
5. Periton gösterecektir iç kas tabakası, içine kesi için, boyutunu tahmin etmek böbrek yeniden palpe. Böbrek daha küçük bir kesi hat sıkıştırın; kesi güvence sadece böbrek bitti. Bu kesi çok küçük yapmak ve gerekirse daha büyük yapmak için en iyisidir. Bu çok büyük yapılmış ise, dikiş gerekli olacaktır.Bu son kesi önemlidir; çok uzakta herhangi bir yönde üzerinde sahnede istikrarı etkileyen ve neden nefes (en iyi durum senaryosu) den ya hareket eserler veya renal pedikül ve olumsuz azaltmak böbrek perfüzyon (en kötü durum senaryosu) uzatmak olacaktır.
6. El moda üzerinde el böbreğin alt kutbu doğru çalışma, böbrek (Şekil 2B gösterildiği gibi) ve kavrama forseps kullanarak çevreleyen yağ bulun.
7. Böbreğin alt kutbu ulaşıldığında çok yavaşça exteriorize için böbrek altında sıkma ise, hafifçe kesiden böbrek çekin. Kesi çok küçük ise, kas tabakası ezmek ve genişletmek için kesilmiş, böbrek exteriorize için prosedürü tekrarlayın.

4. Görüntüleme için Sahne Alanı'nda Münih Wistar Rat yerleştirme

1. Böbrek ile lamel çanak kenarına doğru böbrek yerleştirin biraz sıçan dorsal (arka taraf) doğru döndürülmüş böbreğin ventral tarafı bu yüzdens lamel alt çanak (Şekil 1A) ile temas. Çanak bir ılık, steril 09.% Tuz solüsyonu eklenir.
2. 10x veya 20x objektif bakmak ve hareket kontrol edin. Hareket tespit edilirse göğüs uzağa lamel alt çanak bu yüzden, biraz üzerinde fare döndürün; böbrek gibi renal pedikül (Şekil 1B) zorlamadan çanak kenarına yakın olduğundan emin olun.

5. Albümin renal geçirgenliği ölçmek için Görüntü Alma

1. Glomerüler geçirgenlik (Glomeruluar Eleme Katsayısı; GSC) hesaplanması herhangi makromolekülün önce floresan molekülün infüzyon bireysel glomerül referans arka plan resimleri alarak gerektirecektir. Mikroskop işaretleme yerleri kapasitesine sahip motorlu bir sahne ile donatılmış ise, bulmak ve düşük güçlü amacı ile merkezi bireysel glomerüller ve her yeri işaretlemek. Bir iki geçişli Fluorescein / Rodamin Epifloresans filya emisyon filtresi (faz kontrast veya aydınlatma olmayan diğer floresan kaynakları çalışmaz) çalışacaktır rağmen ter bu işlem için idealdir. Glomerüller çift geçiş filtresi bakıldığında doğal bir sarı-turuncu autoflourescence olan proksimal tübüllerde çevrili boş dairesel yapılar olarak görünür.
2. Mikroskop motorlu bir sahne yoksa, düşük güç amacı ile bir raster desen böbrek tarama ve bireysel glomerül bulunduğu ilkel bir harita yapmak, bu tür böbrek kapsül üzerinde bulunan büyük yüzeysel kan damarları gibi doğal yerlerinden dayanarak veya yağ yamalar.
3. Yüksek güç suya daldırma hedefi için taret geçin ve kılcal döngüler ve Bowman adlı kullanıcının alanı açıkça görülebilir emin her glomerüller 3D veri setleri almak. Bir Pseudocolor palet (S / B başka bir şey) kullanarak bu yapıların görselleştirmek için yardımcı olacaktır.
4. Yüzeysel bir kan damarı üzerinde odaklanarak yavaş yavaş t demlenmeyeo floresan albümin verme emin zaman sistemik dağıtımı için izin verilir. Düşük GSC ile moleküller için plazma yoğunluk değerleri en üst düzeye çıkarmak, ancak mikroskop fotoğraf detektörler doyurabilecek olacak seviyelere ulaşmak için değil önemlidir. Bu süzüldü moleküllerin tespit edilebilirliğini arttırır. Not: (1 kare / saniye ~ tam kare edinme) ekranda görünür floresan albümin zaman tanıtıldı zaman arasında bir 5-7 saniye hızlandırılmış genellikle yoktur.
5. Yaklaşık 10 dakika süresince herhangi bir olası küçük molekül ağırlıklı parçalarının albümin GSC hesaplanmasında kullanılmak üzere 1 mm aralıklarla 3 boyutlu hacim elde önce temizlemek için izin verin. Tipik olarak, Münih Wistar sıçan Simonsen'in gerginlik çok daha az yüzey glomerüllerde vardır, görülebilmesi tüm görüntülü ve sayısal böylece. Biz ~ 10 sayısal sayısını sınırlamak çok Frömter gerginlik çok daha büyük bir numarası vardır.
6. Çalışmanın sonunda, fare anesthet bir aşırı ile ötenaziic çalışmada kullanılan. Bir çift pneumothoracotamy ötenazi sağlamak için gerçekleştirilir.

6. 3D Birimleri gelen Floresan Albumin için GSC hesaplanması

1. Metamorph görüntü işleme yazılımı kullanarak arka plan seti hem, her glomerüller için 3D veri setleri yük ve floresan albumin infüzyonu sonra alınan ayarlayın.
2. Tanımlanmış marjları ve Bowman kapsül kenarı arasında yeterli alan boş yere sahip bir yüzeysel kılcal döngü bulun floresan albümin içeren hacmi.
3. Arka hacmindeki albümin içeren görüntünün tüm görsel ipuçları içermelidir aynı odak düzlemi bulun. Ilgi kılcal döngü içinde bir bölge seçin ve ortalama yoğunluk okuma unutmayın. Sonraki Bowman alanı içinde bir bölge seçin ve ortalama yoğunluk okuma unutmayın. Bu arka plan değerleri olarak kullanılır.
4. Kantitatif için, albümin c Bowman alanı içinde benzer bölgeyi seçingörüntü ontaining. Bowman alanı içinde ortalama yoğunluğu için ortalama bir değer almak için en az iki diğer bölgeler için bunu yapın.
5. En parlak plazma yoğunluğu ile kılcal döngü seçin ve çevresinde bir bölge çizin. Eşik işlevini kullanarak sonraki, RBC en dolaşan karanlık çizgiler kaçınarak, dolaşımdaki plazma içindeki parlak değerleri vurgulayın. Seçilen plazma alanı ortalama yoğunluk değerleri unutmayın. Kan içinde faktörler sadece yol ve plazma floresan düzeylerinin küçümsenmesi hizmet edecektir çünkü tercihen plazma parlak alanları seçmek önemlidir.
6. Bir Microsoft Excel elektronik nerede GSC hesaplamak için değerleri girin kullanarak:

Representative Results

Şekil 3 Münih Wistar Frömter sıçan ve floresan albumin geçirgenliğini belirlemek için atılan adımların bir yüzey glomerulus alınan bir görüntü bir örneğini göstermektedir. 0.0111 albumin için GSC değeri Münih Wistar rat zaman beslenen durumu ³ bu gerginlik görülen aralığında bu bireysel glomerulus sonbaharda elde. Bu görüntüler görülen kararlılık dikkatli planlama ve Şekiller 1 ve 2 de gösterilen, talimatların yürütülmesi kaynaklanmaktadır. Daha önce belirtildiği gibi, böbrek exteriorizing kullanılan kesi yerleştirme hareket eser ücretsiz istikrarlı görüntüleri üretiminde en önemli adımdır.

Şekil 1. Bir oryantasyon konumlandırma ayrıntılı bir şematikönce görüntüleme için mikroskop sahnede sıçan. yavaşça böbrek lamel çanak döşeme ile Repti-Therm ısıtma pedleri üzerinde basılı sıçan böbrek tarafı (gibi bir gösterildiği gibi) yatıyordu. Ventral tarafta lamel alt dokunur ve iletişim otoklav bandı (AT) ile yapılır, böylece (*) böbrek dışa döndürün. Bağlı hareket nefes en aza indirmek için, toraks hemen lamel çanak üzerindeki alana taşımaktadır dışarı böylece (**) ileri sıçan rulo. Su ceketi ile steril% 0.9 serum fizyolojik ve kapak ile çanak doldurun. Rektal ısı izlemek ve gerektiğinde açık ve kapalı Repi-Therm yastıkları açmak için bir termometre kullanın. büyük rakam görmek için buraya tıklayın .

: Src = "/ files/ftp_upload/50052/50052figure2highres.jpg" />
Şekil 2. . Önce mikroskop sahnede yerleştirme Münih Wistar Rat böbrek eksteriorizasyon bir anestezi sıçan sol boyutunu ile yerleştirilir, göğüs kafesi ve uyluk üst arasında alanı (A, gri olarak gösterilir) traş. Bir kez sıralı kesiler A böbrek geçme çizgi ile gösterildiği gibi cilt, dış sonra iç kas tabakası kesmek için yapılır. Ilgili peri-böbrek yağ ile böbrek (B) görünür olmalıdır. Alt En kutup (BE) ulaşana kadar forseps bir çift kullanarak, yağ bir el-over-el moda kısılmıştır. Exteriorize için yağ çekerken yavaşça böbrek altında kalan alan sıkın. büyük rakam görmek için buraya tıklayın .

052/50052figure3.jpg "alt =" Şekil 3 "fo: içerik-width =" 5.5 inç "fo: src =" / files/ftp_upload/50052/50052figure3highres.jpg "/>
Şekil 3,. Bir Münih Wistar Rat bir glomerulus gösteren 3D hacimleri alınan tek uçak görüntüler. Paneller & B gösterisi arka plan resimleri ve bir siyah beyaz Albümin serum Texas Red Rat (TR-RSA) bir ~ 12 dakika sonrası infüzyon alınır. A Arka plan görüntüsü (A) olarak eksikliği fark edilebilir kılcal döngüler yoğunluğu (CL) veya Bowman adlı kullanıcının alanı (BowSp) unutmayın. Panel C, Pseudocolor daha iyi bir doku düşük yoğunluklu arka plan seviyelerinin görselleştirmek için panelden alınan bir bölgesini göstermektedir. Burada, küçük bir bölgenin bir kılcal döngü (uzun bölge) ve floresan albumin infüzyonu sonra elde edilen değerler çıkarılır olmalıdır önceden var olan floresan yoğunluğu seviyelerini belirlenmesi için Bowman alanı içinde çizilir. Paneller D ve E almak olann paneli B ve Pseudocolor gösterilen. Bowman alanı çizilen ilgi üç küçük bölgeler Süzme bariyerinin (D) boyunca hareket biriktirdi floresan albümin ortalama yoğunluğunu hesaplamak için kullanılır. Bireysel bölgeler için ortalama yoğunluk değerleri "göster Bölge İstatistikleri" iletişim kutusunda (panel D ') içinde vurgulu alan bildirilmiştir. Kılcal döngüler içinde dolaşan plazma yoğunluk değerleri (CL, panel E) hesaplamak için büyük bir bölge boyunca en parlak kılcal döngü ve parlak değerler üzerinden çizilir bir eşik fonksiyonu (bir turuncu piksel gösterildiği gibi) kullanarak dikkat çekti. Sadece turuncu vurgulanan piksel yoğunluğu değerleri çevreleyen bölgenin şekli veya boyutu ne olursa olsun rapor edilecektir. Panel E 'kılcal döngüler içinde albumin ham ortalama yoğunluk değerleri gösterir; olan kontrol "Yoğunluk Ölçümleri için kullanın Eşik" not kutusukontrol etti. Panel F değerleri doğru ilerlemesi görüntüleri içinde elde edilmiş olan ham değerlerden çıkarılır Kılcal Döngüler ve Bowman alanı için, arka plan değerleri ile başlayan bırakılmıştır formunu göstermektedir. Serbestçe filtrelenmiş olan bu süre, geçirgen olmayan moleküller sıfır (0) arasında bir değere sahiptir; düzeltilmiş değeri elde edildikten sonra, Bowman alan şiddeti değerinden bir geçirgenlik oranı glomerüler Eleme katsayısı elde etmek için Kılcal döngü yoğunluk değeri ile bölünür bir (1) arasında bir değere sahiptir. Bar = 20 mikron. büyük rakam görmek için buraya tıklayın .

Şekil 4. Süzüldü floresan albümin Alımı ağırlıklı i meydanaN proksimal tübüllerde, S1 erken kademeli. Panel A, ilk Texas Kırmızı RSA bolus ~ 20 dakika infüzyon sonrası alınan bir glomerülleri ve S1 kısmında bir enine kesitini göstermektedir. Açılış Bowman alan ve albumin hırslı alımı (kırmızı) S1 segmentinde göstermeleridir. Panel B aynı veri seti basit bir 20 mikron 3D projeksiyon gösterir. Panel C daha düşük bir güç 20x objektif yaklaşık 60 dakika sonrası infüzyon kullanarak 3D projeksiyon gösterir. Panellerinde görülen aynı glomerulus Not C (*) ve diğer proksimal tübül segmentlerinde karşı bu segment görülen albümin alma en yüksek düzeyde gösterilen A & B. Bar = 20 mikron. büyük rakam görmek için buraya tıklayın .

Discussion

Burada vurgulanan adımları biz aşağıdaki tuzaklar aşmak için tutarlı ve doğru geçirgenlik değerleri üretecek olanlar için ne hissediyorum temsil:

1. Saçılma: uzun dalga boyu fotonlar dağılım daha az eğilimli olduğundan kırmızı yayan fluorophores kullanımı ışık daha verimli toplama için izin verir. Ya yeşil ya da mavi yayan fluorophores kullanarak çünkü kılcal döngüler ve Bowman adlı kullanıcının alanı ³ yoğunluk değerleri artan değişkenlik GSC yıllarda büyük değişim tanıtacak.
2. Resim derinliği: Derin 3D veri setleri genellikle (genellikle toplam derinlemesine 30-45 mikron arasında) toplanır rağmen, üst 10-15 mikron GSC değerlerini belirlemek için en uygun odak derinlikleri temsil eder. Yine derin derinliklerinde ile duyarlılık azalma ve fotonların dağılım nedeniyle değişkenliği bir artış gelir. Daha da önemlisi ancak d oluşur kılcal döngüler kalabalık olanglomerulus içinde eeper. Burada, kapiller döngü Bowman alanı çevreleyen Bowman kapsülü kenarına yakın kadar itilir. Bu yanlışlıkla doğrudan kılcal döngüler çevreleyen çok sayıda podocytes birinin üzerine bir alanı seçerek şansını artırır. Filtre albumin gerçek, daha yüksek yoğunlukta rapor olmayacak çünkü bu GSC en bir küçümsenmesi yol açacaktır. Şekil 3 ve kılcal döngüler kenarına ve Bowman alanı ³ kenarı arasındaki boşluk mevcut olan büyük miktarda Not Panel B, ve D.
3. Örnekleme: Bowman alanı içinde çeşitli bölgelerinde seçilmesi filtre albümin düzeyleri tespit en iyi yaklaşım sağlar. Bu tür kılcal döngüler üzerinde 11 ve 00:00 pozisyon gibi alanlarda önlemek için de önemlidir. 3D ses ile Odaklama sadece odak düzlemi altında neredeyse enine yakaladı kılcal döngüler bir dizi ortaya koymaktadır. Bu alan bir yanlış olarak yükselmesine GSC değeri verecekfiltre albumin abartmanin. Bunun aksine, iyi floresan albümin dolaşımdaki gerçek düzeylerini belirlemek için kılcal döngüler içinde plazma en parlak bölümü seçmek önemlidir. İşte bu seviyeleri küçümseyen da denkleminde payda değerini azaltarak GSC artacaktır.

Bu tekniğin doğrulama görüntüleme, bir (1) bir GSC ile serbestçe süzüldü bileşik meydana gelir. Burada, sürekli albümin geçirgenliği abartmanin sorumlu olmak optik sınırlamaları nedeniyle albumin plazma düzeyleri, küçümseyen ³ geçersiz olduğunu endişeler. Ayrıca, idrar temizleme / plazma düzeyleri ve micropuncture intravital 2-foton mikroskopi doğru floresan makromoleküllerin ² geçirgenliği belirleme yeteneğine sahiptir kanıtlamak ölçülerek elde edilen hemen hemen aynı olan bir 70kDa dekstran için GSC değer tespit sahip. Son olarak, yeteneği hızla inci görselleştirmekE glomerülleri ve çözünürlük, yüksek derecede, 2-foton mikroskopi anlamına gelir benzersiz proteinüri ve albüminüri belirlenmesinde glomerüler filtrasyon bariyer ve PT önemini ölçmek için hazır olan süzüntü yolu boyunca boru şekilli segmentleri.

Burada açıklanan protokol cerrahi dahil usul ve sahnede sıçan yerleştirme basitlikte faydaları vardır ters evre 2-Foton sisteminin kullanımı dayanmaktadır. Sitometrisi Mevcut Protokoller (2007) Dunn ve ark. ⁷ ile bölümüne bakınız dik evre bir 2-Foton sistemi kullanan hakkında bilgi için.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Olympus Floview 1000 confocal/Multi-photon microscope	Olympus America		Filters for detectors: Blue 430/100, Green 525/50, Red 605/90
Mode-Locked Ti:Sapphire Mai Tai Laser	Spectra-Physics		Tunable excitation wavelengths: ~750-1150 nm
Gallium arsenide phosphide photodetectors	Hamamatsu Corp		Note: Front or Side mounted configurations available.
Metamorph Image processing Software	Molecular Dynamics		Note: Version 6.1r1
Microsoft Excel	Microsoft Corportation		2007 version
Handling Forceps	Electron Microscopy Sciences	Cat# 78266-04
Mayo Dissecting Scissors	Electron Microscopy Sciences	Cat# 72962
CA Micro scissors Model 1C300	Electron Microscopy Sciences	Cat# 78180-1C3
Kelly Hemostatic Forceps (straight)	Electron Microscopy Sciences	Cat# 72930
Water Jacket Blanket + Heating Pad	Gaymar		T/Pump PN 11184-000 Blanket-66N111CC
Repti-Therm Under Tank Heater	ZooMed		RH-4
Texas Red Sulfonyl Chloride	Invitrogen/Molecular Probes	Cat# T-353
Rat Serum Albumin	Sigma Aldrich	Cat# A-6272
High Quality Anhydrous DMF	Sigma Aldrich	Cat# 270547
Strate-Line Autoclave Tape	Fisher Scientific	Cat# 11-889-1
Willco-dish Coverslip Bottom Dishes (50 mm/40 mm coverslip)	Electron Microscopy Sciences	Cat# 70665-07