Summary
在这里，我们描述了一个全型日光灯
Abstract
评估的表达模式的基因，以及其转录RNA的亚细胞定位性能，了解其生物学功能在开发过程中的关键功能。 RNA 原位杂交（RNA-ISH）是一个功能强大的方法，用于可视化的RNA分布特性，无论是在有机体，细胞或亚细胞水平的1。 RNA-ISH基于杂交的标记的核酸探针（ 例如，反义RNA，寡核苷酸）互补的mRNA的序列，或一个非编码RNA靶景点2。由于该过程要求单独初级序列信息来生成序列特异性探针，它可以普遍适用于范围广泛的生物体和组织标本3。事实上，一些大型ISH研究已实施的记录在各种模式生物的基因表达和RNA的本地化动态，这导致了重要的社会资源，建立4-11。虽然多年来，已开发各种探针标记和检测策略的结合使用荧光标记的检测试剂和酶的信号放大步骤提供显着增强的灵敏度和分辨率的程序12。在这里，我们描述了一个优化的荧光原位杂交法（FISH）采用酪胺信号放大（TSA）中上演了果蝇胚胎的RNA表达和定位动态可视化。该过程进行96孔PCR板格式，极大地方便了同时处理大量的样品。
Protocol
1。 RNA探针制备
概述：以下部分介绍了所需要的步骤，使地高辛（DIG）标记的RNA探针适合鱼类。第一步涉及克隆或PCR扩增的序列对应于感兴趣的基因的转录区域，将用于生成一个序列特异性探针。这可以通过以下来实现第一个克隆的基因片段插入的质粒，其中的多个克隆位点的两侧是噬菌体启动子元件（T7，T3或SP6），然后可以使用侧翼结合的启动子序列的引物，作为用于PCR的模板，从而产生与不同的启动子序列，在每个末端（ 图1A）的直链的PCR产物。或者，要避免的克隆步骤，也可以执行PCR扩增，从基因组DNA或cDNA，使用寡核苷酸，包括T7，T3或Sp6启动序列在其5'四肢（ 例如 T7：5'-TAATACGACTCACTATAGGGAGA-3'; T3：5'-AATTAACCCTCACTAAAGGGAGA-3'; Sp6启动：5'-ATTTAGGTGACACTATAGAAGAG-3'）。线性PCR产物为模板，然后使用由运行适当聚合酶体外转录（ 图1B） 中，使高辛标记的正义或反义RNA探针。使特定基因的探针时，我们建议制备义和反义RNA探针的使用，这将是有帮助的，以评估FISH信号的特异性（ 即，除非感兴趣的基因的转录的反义方向中的不同的聚合酶，有义RNA探针将揭示水平的背景信号）。下面的步骤，在所有的人都不应采取非常谨慎，以避免潜在的污染核糖核酸（RNA酶）降解，首先用70％乙醇或商业RNA酶净化解决方案，并清洗所有的板凳区域和设 备，用无RNA酶的用品（ 如：水，提示，微量离心管）。
妈terials
- 1.5 ml微量离心管（Abgene，罗切斯特，NY，USA猫。0900）
- 凝胶提取试剂盒（QIAGEN，密西沙加，ON，加拿大，目录号28706）。
- 无RNA酶的水（欧洲野牛，目录号809-115-CL）
- RNA聚合酶（T7，T3或SP6）。 （20 U /μL，Fermentas公司的生物科技公司。猫。EP0101，EP0111，EP0131）。
- RNA酶-OUT核糖核酸酶抑制剂（40 U /μl），（Invitrogen公司，伯灵顿ON。Canada.Cat号10777-019）。
- 地高辛（DIG）核苷酸混合物（DIG-11-UTP，罗氏应用生物科学，拉瓦尔，QC，加拿大猫。No.11209256910）。
设备
- 桌面微型离心机
- 凝胶电泳装置
- PCR扩增的基因特异性序列的基因组DNA，cDNA或质粒DNA，以产生一个线性的两侧由噬菌体T7，T3或Sp6启动子序列的PCR产物。按照制造商的建议，PCR条件。
- 检查的质量和SI平仄的PCR产物通过琼脂糖凝胶电泳。海关和纯化的PCR产物，使用一个标准的凝胶提取试剂盒，根据制造商建议，以及在50微升缓冲液洗脱产物。
- 通过加入5μl3M乙酸钠（pH 5.2）和150微升冰冷的100％乙醇沉淀出的PCR产物，并将其放置在管，于-70℃下过夜。离心管在13,000 xg离心10分钟，在4℃，并用70％乙醇洗涤沉淀。再次离心，除去乙醇和空气干燥沉淀的痕迹。重悬在25-50微升的无RNA酶的水。
- 转录地高辛标记的探针在20μl反应如下：2μl的10X T7转录缓冲液（Invitrogen公司），1μL（20 U /μl）的RNA酶抑制剂，2μLDIG-NTP混合使用200〜500 ng纯化的PCR产物，和2μl的T7 RNA聚合酶（20单位/微升）。使终体积20微升用无RNA酶的水。转录反应在37℃下温育3-4小时。
- 调节转录ription混合用无RNA酶的水至50μl，并沉淀的地高辛标记的RNA探针在步骤4中所描述的。洗过的RNA沉淀重悬在100μl的无RNA酶的水。再悬浮的样品储存在-70℃下
- 量化探头使用的NanoDrop分光光度计。要验证探头质量，运行一个1-2微升样品1-2％的琼脂糖凝胶染色，用溴化乙锭。
2。 果蝇胚胎的收集和固定的
概述：本节介绍的步骤，收获和加工上演了果蝇胚胎。根据所需的胚胎的数目，苍蝇可以维持在人口笼各种尺寸。下面的步骤是对集合进行900厘米3圆柱笼百毫米苹果汁采集板。适当的固定，需要去除保护层，周围的胚胎外绒毛膜内卵黄E透析膜13。一旦收获，在50％的漂白剂溶液以除去绒毛膜胚胎首先沐浴，然后它们在一个含两相溶液的庚烷（permeabilizes卵黄膜），及PBS含有3.7％甲醛混合。卵黄膜，然后裂解除去胚胎转移到一个双相庚烷和甲醇的混合物。适当的胚胎固定和卵黄膜的除去，是为下游FISH程序成功的关键。
物料
- 苹果汁琼脂平板（40％的苹果汁，4％的蔗糖，3.5％琼脂，0.3％甲基对羟基苯甲酸酯）与硬币大小的酵母膏（面包酵母与水混合到黄油的一致性）
- 粉末状多聚甲醛（电子显微镜科学，哈特菲尔德，PA，USA;货号19208）
- 正庚烷
- 甲醇
- 3％的漂白粉溶液
- 20毫升的玻璃闪烁瓶（赛默飞世尔科技，渥太华，ON，加拿大猫号03-337-15）。
设备
- 人口笼
- 收集筐（使用Nitex网格和切断50ml聚丙烯管中，已被切割的孔在盖子的顶部部分）。
- 小油漆刷
- 桌面涡
- 预清除以及美联储人口笼子里，与一个新鲜的苹果汁/酵母板1小时，在25°C。
- 添加一个新的苹果汁/酵母片的笼子里收获早期胚胎。孵育笼4小时在25℃（注意，收集时间可以调整，这取决于所需的阶段）。
- 准备通过结合3.7克多聚甲醛粉末，70微升的2N KOH，和7.3毫升的milliQ水中的化学下罩的玻璃闪烁小瓶的新鲜的37％甲醛溶液。煮沸的溶液中，直至粉末完全溶解的多聚甲醛，然后冷却至室温，并过滤器进入新的闪烁瓶中。
- 准备一个双相固定解决方案结合2.25毫升的1X PBS中，用250毫升37％的甲醛，在闪烁瓶中，然后加入7.5毫升的庚烷中。
- 从笼子里收获的苹果汁板，并增加了一点室温的自来水，精心涂刷的油漆刷落盘的胚胎，胚胎收集。再悬浮胚胎转移到一个篮子，不冷不热的自来水冲洗。
- 90秒Dechorionate胚胎收集洗澡篮子里的漂白粉溶液，然后用清水冲洗彻底，不冷不热的自来水（，直到漂白剂气味没有了）。
- 拆开收集篮，轻轻地用画笔收集胚胎，并将它们传送到双相固定的解决方案。将PBS和庚烷层之间的界面处积累的胚胎。
- 密封闪烁瓶，并固定在旋涡混合器。摇上的最低设置为20分钟。
- 移除并丢弃大部分低级PBS及上层庚烷相，使用巴斯德吸管。吸气剩余的PBS /庚烷/胚胎混合物进入移液管。在滴加的方式，丢弃较低的的PBS阶段从移液器，照顾，以消除胚胎。定金到1.5毫升试管中的双相500μl的庚烷溶液（上层相）和500μl甲醇（下层相）中的胚胎。
- 大力摇晃管手为30-45秒破解的卵黄膜。一旦破裂，胚胎吸收到甲醇。
- 丢弃上正庚烷/甲醇相间庚烷相和未开裂的胚胎，并添加500μL甲醇。摇晃持续5秒。
- 用甲醇洗涤3次，并存储在-20℃（在这一点上的胚胎可以存储为周/月）的胚胎。
3。固定处理后，杂交，杂交后洗
概述：本节将详细对鱼的胚胎通透的处理步骤之前，预杂交，杂交的RNA探针和杂交后的洗涤液。对于初始的通透性步骤处理的胚胎在单管中作为池（下面的步骤1-9，瞄准为10-15微升结算胚/样品），但它们被分装到一个96孔PCR板的各孔中进行预杂交步骤（下面的步骤10）。这将有助于确保治疗所有的胚胎在初始阶段的实验。设立一个FISH实验时，它是重要的，包括阴性对照以确定个别实验中的背景信号的水平。为此，我们建议，包括“没有探头的样品，并指出在第1节，杂交意识RNA探针，它通常会发出一个信号相媲美的”探针“条件的样本。
材料：
- 甲醇
- 磷酸盐缓冲盐水，0.1％Tween-20的（PBT）
- 蛋白酶-K 1毫克/毫升原液（Sigma Aldrich公司，奥克维尔，ON，加拿大。产品编号P2308）
- 甘氨酸（20毫克/毫升原液）
- 杂交溶液：50％甲酰胺，5×SSC，0.1％Tween-20的，100克/毫升的剪切鲑鱼精子DNA，100μg/ ml的肝素。
- 0.2毫升halfskirted 96孔PCR板，Abgene，罗切斯特，NY，USA猫。没有0900）
设备
- 杂交烘箱，数字加热块或水浴可调至56℃，80℃或100℃，或PCR机器。
- 多通道移液器（建议简化洗涤步骤）
- 章动搅拌机
- 冲洗胚胎在甲醇中，然后在甲醇中的1:1混合物：PBT，然后在PBT的两倍。
- 20分钟，在1毫升含有3.7％的甲醛（新鲜制备的，如步骤11中所述）的PBT与恒定摆动上nutator修复胚胎。
- 洗3次，每次2分钟，PBT而摇摆的胚胎。
- 准备的溶液为3微克/毫升的蛋白酶K（PK），在PBT稀释，并添加500微升的样品溶液。孵育10分钟，在室温下，无晃动。混合胚胎通过喷射用移液管或轻轻倒转管每2分钟。
- 转移胚胎样品在冰上1小时。
- 移动样品至室温，删除PK溶液。洗2次，持续2分钟，用1ml的PBT + 2毫克/毫升甘氨酸。
- 修复样品20分钟，在1毫升的PBT + 3.7％甲醛与摆动。冲洗胚胎在PBT的5倍。
- 用1毫升的1:1的混合物，PBT和HYB溶液冲洗胚胎。更换用0.5-1毫升100％HYB溶液（在此步骤中的胚胎可以储存在-20℃下的数天/周）。
- 分装胚胎成单个井的96孔板（10-15μl的结算胚胎/孔，照顾到使用较大的光圈提示，以避免破坏胚胎的目的）。
- HYB溶液100μl/孔样品煮沸5分钟，然后在冰上冷却5分钟。此解决方案是用于样品预杂交（预HYB）。
- 加入100μl/样品预HYB溶液孵育至少2小时，在56°C。
- 对于每个样品，稀释〜100纳克的探针在100微升HYB溶液。热，在80℃下进行3分钟，然后在冰上冷却5分钟（加热探针可以保存在冰中，几个小时）。
- 前HYB的解决方案从胚胎中取出和更换的RNA探针解决方案。
- 杂交，在56℃下进行12-16小时。
- 预温以下的洗涤溶液在56℃下：（A）200微升/样品的HYB溶液;（B）的100微升/样品的3:1混合HYB：PBT，（C）以100μl/样品的1:1混合HYB：PBT，（D）以100μl/ HYB：PBT的1:3混合样品（E）400微升/样本的PBT。
- 冲洗样品用100μl的洗涤溶液A，然后执行洗涤步骤，在56℃用100μl/样品的解决方案的AD，每次15分钟。然后，洗净样品4次5分钟，在56℃下用100μl/样品溶液E
- 酷样品至室温。
概述：这部分描述的抗体和检测试剂，用于检测和可视化的分布的RNA探针信号以下杂交。这些步骤在图2中示意性概述。在这里，我们只给出的标准，我们使用的健壮信号扩增的检测试剂，但存在的各种市售的试剂，可以用来作为替代物，尤其是当执行双-FISH实验合作同时检测不同的RNA，蛋白质-RNA双染色。本协议获得的结果显示在图3 mRNA的表达/本地化图案镶嵌在。
物料
- HRP共轭的小鼠单克隆抗DIG（Jackson ImmunoResearch Laboratories公司公司猫。编号200-032-156）
- 生物素结合的小鼠单克隆抗-DIG（杰克逊IMMUNoResearch安全检测实验室公司猫。号200-062-156）
- 链霉亲和素-HRP结合物（分子探针，尤金OR，USA，大类No.S991）
- CY3-酪胺结合物（Perkin Elmer公司生命科学学院，波士顿，MA，USA，猫号SAT704A）
- DABCO安装解决方案：在一个50毫升的试管中，稀释的1.25克DABCO（1,4 - 二氮杂双环[2.2.2]辛烷;度Sigma D-2522），在15毫升的1X PBS中，然后加入35毫升甘油并混合直到完全均匀。通过预混合，用PBS，DABCO粉末溶解非常迅速。在-20°C的商店安装解决方案
- 载玻片，盖玻片
设备
- 章动搅拌机
- 多通道移液器
- 荧光显微镜
- 准备PBTB溶液，含有PBT + 1％无脂干牛奶（通常为50-100毫升是足以满足所有的检测试剂孵育和洗涤步骤）。
- 块样品在100的微升PBTB /样品在室温下10分钟而摇摆nutator。 <李>删除阻塞的解决方案，从胚胎和孵化样品在室温下用100微升/样品的单克隆生物素的抗DIG抗体溶液（稀释1/400现货成PBTB），与摇摆1.5-2小时。
- 洗净样品6次，每次5分钟用100μlPBTB的/样品，与摆动。
- 在室温下孵育1.5小时，用75毫升/样品的链霉亲和素-HRP溶液（1/100稀释库存在PBTB，10μg/ ml的最终浓度）与摆动。
- 洗净样品5分钟6次各100μlPBTB的/样品与摆动（为的DNA counterstaining，稀释的DAPI 1X工作在PBTB浓度和使用这种解决方案，在第一清洗工序中）。
- 的胚胎冲洗与PBT，然后5分钟，PBS洗2次。
- 孵育2小时，在室温下对样品用50μl/样品的Cy3酪胺的溶液（稀释1/50酪胺扩增缓冲液中）的nutator。从这个步骤上，一定要保持样品的光屏蔽插座。/ P>
- 洗净样品6次，用100μl的PBS /样品上nutator每次5 min。
- 移除PBS及添加100-125微升/安装解决方案的样品含有70％甘油和2.5％（DABCO）。将样品在4°C。这些样本可以被存储了好几年。
- 使用一个大孔的前端，轻轻移液管的样品悬浮胚胎转移胚胎到玻璃载片上的25微升，然后放置在胚胎和密封到与指甲油滑动盖玻片。
- 分析胚胎样品用荧光显微镜。
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Representative Results
当成功执行，这个程序提供了一个在果蝇胚胎发育早期的基因表达和mRNA的定位动态的时空分析的详细程度显着增强。事实上， 如图3A所示为经典的配对规则基因欠幅脉冲 （ 运行 ），可以使用这个协议来观察基因表达事件通过检测组新生成绩单灶的表达核。此外，如胚胎镶嵌在图3B中所示，该方法能够在高分辨率的mRNA的定位功能的可视化。
图1。纲要 （A）示意图，我们的战略在体外转录全光照合成地高辛标记的RNA探针的RNA探针制备程序。GA两侧用噬菌体RNA聚合酶启动子元件的线性DNA模板。 （B）标准的1％琼脂糖凝胶中示出的例子是在体外转录的RNA探针的组蛋白H2A，运行和doc转座子的RNA的照片。我们通常执行的侧侧电泳PCR模板和RNA探针。 RNA通常会出现强烈的离散带具有较高的流动性相比模板
图2。 FISH方法探头检测的步骤中的示意性表示。探针杂交处理的胚胎，确认的地高辛标记的探针，使用生物素标记的的α地高辛抗体，然后将其络合的HRP偶联的链霉抗生物素蛋白。酪胺信号放大（TSA），然后在改造酪胺试剂自由基的形式为Through的HRP的活性。瞬时无功酪胺自由基芳香族氨基酸残基附近的蛋白质共价结合，防止其扩散距离探头位置。酪胺衬底络合的荧光染料，可以用荧光显微镜检测。
图3。使用这种鱼的过程，强调在果蝇胚胎中的mRNA表达和亚细胞定位模式的多样性得到的结果的例子。（A）FISH分析对运行的规则基因在胚胎发育的不同阶段，初步揭示了广泛表达的中间部分在胚胎阶段的胚胎被提炼成一个分段的条纹图案在以后的阶段。（B）马赛克描绘的FISH结果显示不同品种的mRNA localizatioŇ模式阶段4-7的胚胎中。使用地高辛标记的反义探针进行杂交和检测的通过顺序孵育与生物素化的抗地高辛抗体，链霉亲和素-HRP，和Cy3酪胺酰胺进行FISH。 RNA，DNA =红色=蓝色。比例尺中的（A）= 25μM，而在（B）= 50μM。
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Discussion
探针的合成步骤，我们通常会产生径流的反义RNA探针， 通过体外转录全长果蝇的cDNA扩增出质粒发现在果蝇的基因收藏（DGC），资源详载于以下网址： http://www .fruitfly.org / DGC / index.html的 14,15的 。这种方法已被广泛使用在的大型原位杂交研究，目的是在果蝇胚胎9,16测绘基因的表达和mRNA的定位模式。 DGC的质粒可以订购果蝇的基因组资源中心（ https://dgrc.cgb.indiana.edu/vectors/“ ）。的原料和设计定制的引物T7，SP6，或T3悬的灵活性，使人们可以轻松地生成探针来检测特定的基因亚型（ 如选择性剪接变体）OR非编码RNA中未表示的标准的cDNA收藏。当考虑设计亚型特异性探针，我们已经发现，从250-1000基地的模板可以产生良好的FISH结果。
FISH在果蝇胚胎，我们不片段探针碳酸盐治疗;而我们使用全长成绩单，可以的大小介于500-5000基地的。当进行FISH其他组织的渗透性较差的大型探测器，碎片可能确实有利于探头渗透。但是，我们更愿意选择准备使用较小的PCR扩增DNA模板的探针，或多个单独合成的小探头汇集在一起，而不是分裂的大探头，可能会得到不同的结果，并降低整体的探测质量进行化学。
如在胚胎收集步骤，我们通常会添加酵母膏的胚胎收集板。酵母膏将大大由苍蝇产卵的数量增加，鸡蛋生产的营养环境17。此外， 果蝇苍蝇会经常产卵，直接进入酵母膏。这些胚胎可以很容易地溶解在水中的酵母膏使用一个小的油漆刷，使混合物通过一个集合购物篮收集。对于dechorionation工序，3％的漂白剂溶液，制备商业漂白剂（通常为6％的浓度）与水1:1稀释，使用在大多数协议13,18,19。在我们的经验中，我们发现，3％的漂白粉溶液为90秒培育胚胎提供了高效的dechorionation。这些参数可能的商业漂白剂可用的解决方案，是根据需要进行调整，但应该注意不要过度曝光的胚胎漂白剂，因为这可能会损坏样品。要更加紧密地监控dechorionation程序，它是可以看的胚胎在显微镜下吨o确保的dechorionation反应完成后， 即胚胎失去其背附肢当它们dechorionated时。最后，为了确保适当的胚胎固定，我们使用新鲜配制的甲醛溶液，旧的解决方案往往沉淀。如需进一步参考，此过程中已经描述了在以前的方法的文章13,18,19。
的步骤有关通透性的胚胎组织蛋白酶K，或检测试剂，如抗体和Cy3标记的酪胺，我们已经发现了最佳的结果，使用此协议中描述的稀释。然而，由于在实验室环境中的变化和试剂的股票，我们建议每个实验室的实证检验试剂，以确定自己的最佳工作浓度为他们的特定需求。此外，我们已经找到了最佳的浓度可能会有所不同，具体取决于组织分析。
为了确保鱼的程序我被赋予了一致的可重复的结果，我们建议增加几个阳性对照分析，其中可能包括探针成绩单定义的表达式/本地化模式（ 例如运行 ）。以醒目的mRNA定位在果蝇胚胎发育早期模式上可以找到飞FISH网络的网站（ http://fly-fish.ccbr.utoronto.ca/ ）的成绩单。相反，来控制背景信号检测中，如上所述，应该还包括'无探头的和/或有义RNA探针样品。
在除了此协议中描述的Cy3标记的酪胺酰胺的共轭，有各种其他市售的荧光标记的酪胺酰胺试剂从Perkin Elmer生命科学或分子探针（Invitrogen公司，加拿大，Inc制造），它可以提供额外的灵活性的多色成像实验。虽然这种方法描述了我们的基本程序源码，URE单个RNA鱼，该方法的变体，可以实现更复杂的实验，如双RNA FISH或RNA-蛋白联合检测。有关这些程序的详细信息，我们建议在现有的FISH方法的论文18-20描述的过程。
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Disclosures
没有利益冲突的声明。
Acknowledgments
由国家科学和工程委员会（NSERC），加拿大，加拿大卫生研究院（CIHR）和德Recherche全宗连接桑特杜魁北克省（FRSQ）的资助下进行的工作在Lécuyer实验室的支持。法比奥·亚历克西斯列斐伏尔和盖尔Moquin丽怡NSERC本科生科研奖学金的支持，，而卡罗尔Iampietro所支持的的安杰洛Pizzagalli的博士后奖学金。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| T7, T3 or SP6 RNA Polymerase | Fermentas Life Sciences | EP0101,EP0111,EP0131 | Kits contain reaction buffer. |
| DIG RNA Labeling Mix | Roche Applied Science | 11 277 073 910 | |
| RNAguard | Amersham Biosciences | 27-0816-01 | |
| 3M sodium acetate | |||
| Cold 100% ethanol. | |||
| Cold 70% ethanol. | |||
| Chlorine bleach solution diluted 1:1 with water. | |||
| Heptane | |||
| Methanol | |||
| proteinase K | Sigma Aldrich Oakville, ON, Canada | Catalog No. P2308 | |
| 40% formaldehyde solution, freshly prepared | |||
| PBS-Tween solution (PBT) | 1xPBS, 0.1% Tween-20 | ||
| Glycine solution | 2 mg/ ml glycine in PBT | ||
| HRP-conjugated mouse monoclonal anti-DIG | Jackson ImmunoResearch Laboratories Inc | 200-032- 156 | (1/400 dilution of a 1 mg/ml stock solution in PBTB |
| HRP-conjugated sheep monoclonal anti-DIG | Roche Applied Science, Laval, QC | 1 207 733 | 1/500 dilution of stock solution in PBTB |
| Biotin-conjugated mouse monoclonal anti-DIG | Jackson ImmunoResearch Laboratories Inc., West Grove, PA, USA | 200-062-156 | (1/400 dilution of a 1 mg/ml stock solution in PBTB |
| Streptavidin-HRP conjugate | Molecular Probes, Eugene OR, USA | S991 | (1/100 dilution of a 1 μg/ml stock |
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