Summary
Hier beschrijven we een geheel gemonteerde fluorescent
Abstract
Beoordelen het expressiepatroon van een gen, alsmede de subcellulaire lokalisatie eigenschappen van het getranscribeerde RNA, zijn kenmerkend voor het begrijpen van de biologische functie tijdens de ontwikkeling. RNA in situ hybridisatie (ISH-RNA) is een krachtige methode voor het visualiseren RNA distributie eigenschappen, ten organismale cellulaire of subcellulaire niveau 1. RNA-ISH is gebaseerd op de hybridisatie van een gemerkte probe nucleïnezuur (bijvoorbeeld antisense RNA, oligonucleotiden) complementair aan de sequentie van een mRNA of een niet-coderende RNA doelwit van belang 2. De procedure vereist primaire sequentie informatie alleen te genereren sequentie-specifieke probes, kan algemeen worden toegepast op een groot aantal organismen en weefselmonsters 3. Uit een aantal grootschalige ISH studies zijn uitgevoerd om genexpressie documenteren en lokalisatie dynamiek RNA in verschillende modelorganismen, heeft dat tot devestiging van belangrijke communautaire middelen 4-11. Hoewel verschillende probe labeling en detectie strategieën zijn ontwikkeld de afgelopen jaren de gecombineerde gebruik van fluorescentie-gemerkt detectiereagentia en enzymatische signaalversterking stappen bieden significante verbeteringen in de gevoeligheid en resolutie van de procedure 12. Hier beschrijven we een geoptimaliseerd fluorescente in situ hybridisatie methode (FISH) gebruik tyramide signaalamplificatie (TSA) om RNA expressie en lokalisatie dynamiek opgevoerd Drosophila embryo zichtbaar. De procedure wordt uitgevoerd in 96-well plaat formaat PCR, die aanzienlijk vergemakkelijkt het gelijktijdig verwerken van grote aantallen monsters.
Protocol
1. Bereiding RNA Probe
Overzicht: De volgende sectie beschrijft de stappen die nodig zijn om Digoxigenine (Dig)-gemerkte RNA-probes die geschikt zijn voor FISH te maken. De eerste stap betreft het kloneren of PCR amplificatie van een sequentie die overeenkomt met het getranscribeerde gebied van een gen van interesse dat wordt gebruikt om een sequentie-specifieke probe te genereren. Dit kan worden bereikt door eerst het kloneren van het gen segment in een plasmide waarin de meervoudige kloneringsplaats geflankeerd door bacteriofaag promoter elementen (T7, T3 of SP6), die vervolgens kan dienen als een sjabloon voor PCR met primers flankerende de promoter sequenties bevatten , waardoor het genereren van een lineaire PCR product met verschillende promoter sequenties aan elk uiteinde (Figuur 1A). Alternatief de kloneringsstap voorkomen, kan men ook uitvoeren PCR amplificatie van genomisch DNA of cDNA met behulp van oligonucleotiden die T7, T3 of SP6 sequenties aan hun 5'-uiteinden (bv. T7 omvatten:5'-TAATACGACTCACTATAGGGAGA-3 'T3: 5'-AATTAACCCTCACTAAAGGGAGA-3' Sp6: 5'-ATTTAGGTGACACTATAGAAGAG-3 '). De lineaire PCR-producten worden vervolgens gebruikt als sjablonen Dig gemerkte sense of antisense RNA probes afspoeling in vitro transcriptie met het geschikte polymerase (Figuur 1B). Indien de probes voor specifieke genen, raden bereiden sense en antisense RNA probes met verschillende polymerasen die nuttig zijn voor de beoordeling FISH signaal specificiteit (dat wil zeggen tenzij het gen van belang wordt getranscribeerd in de antisense oriëntatie, zullen de sense RNA probe onthullen de niveau van achtergrond signaal). In alle van de volgende stappen, moet men grote zorg om mogelijke degradatie te voorkomen door besmetting ribonucleasen (RNAses) door eerst het reinigen van alle bank en apparatuur met 70% ethanol of commerciële RNAse ontsmetting oplossingen en door het gebruik van RNAse-vrij diensten (bv. water, tips, microcentrifugebuizen).
Mamaterialen
- 1,5 ml microcentrifugebuisjes, (ABgene, Rochester, NY, USA Cat. Nr. 0900)
- Gel-extractie kits (QIAGEN, Mississauga, ON, Canada,. Art.-Nr. 28706).
- RNAse vrij water (Wisent, Inc Cat. Nr. 809-115-CL)
- RNA polymerase (T7, T3 of SP6). (20 U / ul, Fermentas Biosciences. Cat. No EP0101, EP0111, EP0131).
- RNAse-OUT Ribonuclease remmers (40 U / pl) (Invitrogen, Burlington ON. Canada.Cat. Nr. 10777-019).
- Digoxigenine (DIG) nucleotide mixen (DIG-11-UTP, Roche Applied Biosciences, Laval, QC, Canada. Cat. No.11209256910).
Uitrusting
- Tafelblad micro-centrifuge
- Gel-elektroforese-inrichting
- PCR amplificeren genspecifieke sequentie van genomisch DNA, cDNA of plasmide-DNA met een lineaire PCR product geflankeerd door bacteriofaag T7, T3 of SP6 promoter sequenties. Volg de aanbevelingen van de fabrikant voor de PCR-condities.
- Controleer de kwaliteit en de siZE het PCR product door agarosegelelektroforese. Accijns en zuiveren PCR product met een standaard-gel extraction kit volgens de aanbevelingen en produceert elueren het product in 50 pi buffer.
- Precipiteren het PCR product door toevoeging van 5 pi 3M natriumacetaat (pH 5,2) en 150 pl ijskoude 100% ethanol en zet de buizen bij -70 ° C geroerd. Centrifugebuizen bij 13.000 xg gedurende 10 min bij 4 ° C en was de pellet met 70% ethanol. Spin weer, verwijdert u alle sporen van ethanol en dan laten drogen de pellet. Resuspendeer in 25-50 pi RNAse-vrij water.
- Transcriberen DIG gemerkte probe met 200-500 ng gezuiverd PCR product in een 20 ui reactie als volgt: 2 ui 10X T7 transcriptie buffer (Invitrogen), 1 ui (20 U / ul) van RNAse inhibitor, 2 ui Dig-NTP mix en 2 pi T7 RNA polymerase (20 U / pl). Breng het eindvolume tot 20 pi met RNAse-vrij water. Incubeer de transcriptiereactie bij 37 ° C gedurende 3-4 uur.
- Pas Transcription mix tot 50 ui met RNAse-vrij water en neerslaan van de DIG gemerkte RNA probe zoals beschreven in stap 4. Resuspendeer de pellet gewassen RNA in 100 pi RNAse-vrij water. Sla de geresuspendeerde monsters bij -70 ° C.
- Kwantificeren van de sonde met behulp van een nanodrop spectrofotometer. De probe kwaliteit verifiëren, voert een 1-2 ul monster op een 1-2% agarose gel gekleurd met ethidiumbromide.
2. Verzameling en Fixatie van Drosophila embryo's
Overzicht: dit gedeelte wordt beschreven stappen voor het oogsten en verwerken van geënsceneerde Drosophila embryo. Afhankelijk van het aantal benodigde embryo's kunnen vliegen worden gehandhaafd in kooien populatie van verschillende grootte. De volgende stappen zijn voor verzamelingen uitgevoerd met behulp van 900 cm 3 cilindrische kooien met behulp van 100mm appelsap collectie platen. Een goede fixatie vereist de verwijdering van twee beschermende lagen rond het embryo: de buitenste chorion en de binnenste vitelline membraan 13. Na de oogst worden de embryo's eerst ondergedompeld in een 50% bleekmiddeloplossing het chorion verwijderen en ze worden gemengd in een bifasische oplossing die heptaan (permeabilizes de vitelline membraan) en PBS met 3,7% formaldehyde. De vitelline membraan wordt vervolgens gekraakt en verwijderd door overdracht van het embryo in een tweefasig mengsel van heptaan en methanol. Goede embryo fixatie en verwijdering van de vitelline membraan is cruciaal voor het succes van de stroomafwaartse FISH procedure.
Materieel
- Apple-juice agarplaten (40% appelsap, 4% sucrose, 3,5% agar, 0,3% methylparabeen) met dime-en kleinbedrijf gist pasta (bakkersgist met water gemengd tot boter consistentie)
- Poedervormige paraformaldehyde (Electron Microscopy Sciences, Hatfield, PA, USA;. Art.-Nr. 19208)
- Heptane
- Methanol
- 3% Bleach-oplossing
- 20 ml glazen scintillatieflesjes (Thermo Fisher Scientific, Ottawa, ON, Canada,. Art.-Nr. 03 tot 337-15).
Uitrusting
- Bevolking kooien
- Collection manden (gemaakt van een Nitex mesh en het bovenste deel van een snede 50 ml polypropyleen buis waarin een gat is gesneden in het deksel).
- Kleine kwast
- Tafelblad vortex
- Pre-clear weldoorvoede populatie kooien met een verse appelsap / gist plaat gedurende 1 uur bij 25 ° C.
- Voeg een nieuwe appelsap / gist plaat om de kooi te vroeg stadium embryo's te oogsten. Incubeer de kooi gedurende 4 uur bij 25 ° C (merk op dat ophaaltijden kan worden aangepast afhankelijk van de gewenste stappen).
- Bereid een verse 37% formaldehyde oplossing door 3,7 g paraformaldehyde poeder, 70 pl 2N KOH en 7,3 ml milliQ water in een glazen scintillatieflesje onder een chemische afzuigkap. Kook de oplossing tot de paraformaldehyde poeder volledig is opgelost, daarna afkoelen tot kamertemperatuur en filtreer in nieuwe scintillatieflesje.
- Bereid een bifasische oplossing fixatiecombineren 2,25 ml 1X PBS met 250 ml 37% formaldehyde in een scintillatieflesje en voeg vervolgens 7,5 ml heptaan.
- Oogst de appelsap plaat uit de kooi en het verzamelen van de embryo's door het toevoegen van een beetje op kamertemperatuur leidingwater en fijn borstelen de embryo's van de plaat met de kwast. Breng de geresuspendeerde embryo's in een mand en spoel met lauw kraanwater.
- Dechorionate embryo's voor 90 sec door het wassen van de collectie manden in bleekwater oplossing, spoel dan grondig met lauw kraanwater (tot chloorlucht is verdwenen).
- Demonteer de collectie mand, het verzamelen van embryo's voorzichtig met een penseel en breng ze in de bifasische fixatie-oplossing. De embryo's zich ophopen op het grensvlak tussen de lagen PBS en heptaan.
- Seal scintillatieflesjes en te bevestigen aan een vortex-mixer. Schud gedurende 20 minuten op de laagste stand.
- Verwijder en gooi de meeste van de onderste en bovenste PBS heptaan fasen met behulp van een Pasteur pipet. Aspirerende resterende PBS / heptaan / embryo 's mengsel in de pipet. In druppelsgewijze wordt de bovenste PBS fase van de pipet, zorg ervoor dat u de embryo's te elimineren. Storten de embryo's in een 1,5 ml buis die een tweefasige oplossing van 500 ul heptaan (bovenste fase) en 500 ul methanol (onderste fase).
- Schud buizen met de hand gedurende 30-45 seconden naar de vitelline membranen te kraken. Eenmaal gekraakt zullen de embryo's wegzakken in de methanol.
- Gooi de bovenste fase en heptaan gebarsten embryo's in het heptaan / methanol interfase en voeg 500 pl methanol. Schud gedurende 5 sec.
- 3 keer wassen met methanol en bewaar het embryo bij -20 ° C (op dit punt embryo's kunnen worden opgeslagen week / maand).
3. Post-fixatie Processing, Hybridisatie en Post-hybridisatie Wast
Overzicht: Dit hoofdstuk beschrijft de processtappen voor embryo permeabilisatie voorafgaand aan de FISH, pre-hybridisatie,hybridisatie met RNA probes en post-hybridisatie wassingen. Voor de initiële stappen permeabilisatie de embryo's behandeld als een pool in een buis (stap 1-9 hieronder doel voor 10-15 pl vaste embryo / sample), maar ze zijn verdeeld in afzonderlijke putjes van een 96-wells plaat PCR alvorens de pre-hybridisatie (stap 10). Dit helpt ook behandeling van alle embryo waarborgen in de beginfase van het experiment. Wanneer u een FISH experiment, is het belangrijk om negatieve controles omvatten het niveau van achtergrondsignaal in afzonderlijke experimenten bepaald. Hiervoor adviseren wij met inbegrip van steekproefsgewijze een 'no-probe' en, zoals vermeld in paragraaf 1, een monster gehybridiseerd met de 'zin' RNA-probe, die meestal geeft een signaal te vergelijken met de toestand van de 'no-probe'.
Materialen:
- Methanol
- Fosfaat gebufferde zoutoplossing met 0,1% Tween-20 (PBT)
- Proteïnase-K 1 mg / ml voorraadoplossing (Sigma Aldrich, Oakville, ON, Canada. Catalog No P2308)
- Glycine (20 mg / ml voorraadoplossing)
- Hybridisatieoplossing: 50% formamide, 5x SSC, 0,1% Tween-20, 100 g / ml gefragmenteerd zalmsperma-DNA, 100 ug / ml heparine.
- 0,2 ml halfskirted 96-well PCR-platen, ABgene, Rochester, NY, USA Cat. Geen 0900)
Uitrusting
- Hybridisatie oven, digitale verwarmingsblok of water, instelbaar op 56 ° C, 80 ° C of 100 ° C, of een PCR machine.
- Meerkanaalspipetten (aan te raden om wasstappen te vereenvoudigen)
- Vortexmenger
- Spoel de embryo's in methanol, daarna in een 1:1 mengsel van methanol: PBT en vervolgens tweemaal in PBT.
- Bevestig de embryo gedurende 20 min in 1 ml van PBT met 3,7% formaldehyde (vers bereid zoals beschreven in stap 11) onder voortdurend schudden op een nutator.
- Was embryo's voor 3 keer gedurende 2 minuten in PBT terwijl schommelen.
- Bereid een oplossing van 3 ug / ml proteinase K (PK) verdund in PBT en voeg500 pi oplossing van monsters. Incubeer monsters gedurende 10 min bij kamertemperatuur zonder schudden. Meng embryo elke 2 min door spuiten met een pipet of door voorzichtig omkeren van de buis.
- Transfer embryo monsters op ijs gedurende 1 uur.
- Verplaats monsters tot kamertemperatuur en verwijder PK oplossing. Was 2 maal gedurende 2 minuten met 1 ml van PBT + 2 mg / ml glycine.
- Fix monsters 20 min in 1 ml van PBT + 3,7% formaldehyde met schudden. Spoel embryo's 5 keer in PBT.
- Spoel embryo met 1 ml van een 1:1 mengsel van PBT en Hyb oplossing. Vervangen met 0,5-1 ml 100% Hyb-oplossing (bij deze stap de embryo's kunnen worden opgeslagen voor meerdere dagen / week bij -20 ° C).
- Aliquot embryo's in afzonderlijke putjes van een 96-wells plaat (streven naar ~ 10 tot 15 ul van geregeld embryo's / well, let er dan een groot diafragma tips gebruiken om te voorkomen beschadiging van de embryo's).
- Kook 100 ul / monster van Hyb-oplossing gedurende 5 minuten en laat afkoelen op ijs gedurende 5 minuten. Deze oplossing wordt gebruikt voor monstervoorbehandeling hybridisatie (Pre-Hyb).
- Voeg 100 ul / monster van Pre-Hyb-oplossing en ten minste gedurende 2 uur bij 56 ° C.
- Voor elk monster verdund ~ 100 ng probe in 100 pl Hyb oplossing. Warmte bij 80 ° C gedurende 3 min afkoelen op ijs gedurende 5 min (verwarmd probes kunnen worden bewaard op ijs gedurende enkele uren).
- Verwijder de Pre-Hyb oplossing uit de embryo's en te vervangen door de RNA-probe-oplossing.
- Hybridiseren bij 56 ° C gedurende 12-16 uur.
- Voorverwarmen de volgende wasoplossingen bij 56 ° C: (A) 200 ul / monster aan Hyb oplossing; (B) 100 ul / monster van een 3:1 mix van Hyb: PBT; (C) 100 ul / monster van een 1:1 mengsel van Hyb: PBT; (D) 100 ul / monster van een 1:3 mix van Hyb: PBT; (E) 400 ul / monster van PBT.
- Spoel monsters met 100 pl wasoplossing A en voer de wasstap met 100 ul / monster van oplossingen AD bij 56 ° C gedurende 15 min elk. Vervolgens spoelmonsters 4 maal gedurende 5 min met 100 ul / monster oplossing E bij 56 ° C.
- Koel de monsters tot kamertemperatuur.
Overzicht: Deze sectie beschrijft de antilichamen en detectiereagentia gebruikt voor het detecteren en visualiseren de verdeling van de RNA probe signaal volgende hybridisatie. Deze stappen zijn schematisch aangegeven in figuur 2. Hier presenteren wij maar de standaard detectiereagentia die we gebruiken voor robuuste signaalversterking, maar er bestaat een verscheidenheid van commercieel verkrijgbare reagentia die gebruikt kunnen worden als alternatieven, vooral bij dubbele FISH experimenten gelijktijdig samen detecteren verschillende RNA voor eiwit-RNA double kleuring. Voorbeelden van resultaten verkregen met dit protocol worden in het mRNA expressie / lokalisatie patroon mozaïek in figuur 3.
Materieel
- HRP-geconjugeerd muis monoklonaal anti-DIG (Jackson ImmunoResearch Laboratories Inc Cat. No 200-032-156)
- Biotine-geconjugeerd muis monoklonaal anti-DIG (Jackson ImmunoResearch Laboratories Inc Cat. Neen 200-062-156)
- Streptavidine-HRP conjugaat (Molecular Probes, Eugene OR, USA, Cat. No.S991)
- Cy3-tyramide conjugaten (Perkin Elmer Life Sciences, Boston, MA, USA, Cat. No SAT704A)
- DABCO montageoplossing: In een 50 ml tube Verdun 1,25 g DABCO (1,4-diazabicyclo [2.2.2] octaan; Sigma D-2522) in 15 ml 1X PBS, vervolgens 35 ml glycerol en meng tot volledig homogeen. Door voormengen met PBS, de DABCO poeder snel opgelost. Store montage oplossing bij -20 ° C.
- Objectglaasjes, dekglaasjes
Uitrusting
- Vortexmenger
- Multichannel pipet
- Fluorescentiemicroscoop
- Bereid PBTB oplossing met PBT + 1% niet-vette droge melk (gewoonlijk 50-100 ml is voldoende voor alle detectiereagens incubatie en wasstappen).
- Blokkeren monsters gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur in 100 pl PBTB / sample terwijl schommelen op nutator. <li> Verwijder blokkeeroplossing uit embryo en incubeer monsters voor 1,5-2 uur bij kamertemperatuur met 100 ul / monster het monoklonale biotine anti-DIG antilichaam oplossing (verdund 1/400 uit voorraad in PBTB) met schudden.
- Spoelmonsters 6 keer gedurende 5 minuten elk met 100 ul PBTB / monster met schudden.
- Incubeer 1,5 uur bij kamertemperatuur met 75 ml / monster aan streptavidine-HRP oplossing (verdunning 1/100 uit voorraad in PBTB, 10 ug / ml eindconcentratie) met schudden.
- Was monsters 6 keer gedurende 5 minuten elk 100 ul PBTB / monster met rocking (voor de DNA tegenkleuring, DAPI Verdun tot 1x werken concentratie in PBTB en deze oplossing in de eerste wasstap gebruiken).
- Spoel embryo's met PBT, dan was 2 keer gedurende 5 minuten met PBS.
- Incubeer monsters gedurende 2 uur bij kamertemperatuur op de nutator met 50 ul / monster van Cy3-tyramide oplossing (verdund 1/50 in tyramide amplificatie buffer). Vanaf deze stap over, zorg ervoor om monsters te houden in een licht afgeschermd stopcontact. </ Li>
- Spoelmonsters 6 keer gedurende 5 minuten elk met 100 ul PBS / monster nutator.
- Verwijderen PBS en voeg 100-125 ul / monster montage oplossing die 70% glycerol en 2,5% (DABCO). Store monsters bij 4 ° C. Deze monsters kunnen worden opgeslagen voor meerdere jaren.
- Met behulp van een breed-boring tip, resuspendeer de embryo's door voorzichtig pipetteren de monsters en de overdracht 25 ul van embryo's op een glasplaatje, plaats dan een dekglaasje op de embryo's en de afdichting op de dia met nagellak.
- Analyseren embryo monsters met een fluorescentiemicroscoop.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Wanneer deze wordt uitgevoerd met succes, deze procedure biedt een opvallend hoger niveau van detail in de spatio-temporele analyse van genexpressie en mRNA lokalisatie dynamiek tijdens de vroege embryogenese van Drosophila. Zoals geïllustreerd in figuur 3A van de klassieke pair-rule gen runt (run), kan men dit protocol om genexpressie gebeurtenissen observeren via de detectie van ontluikende transcript foci in groepen expressie kernen. Bovendien, zoals getoond in de embryo mozaïek in figuur 3B, de methode kan de visualisatie van mRNA lokalisatie-eigenschappen in hoge resolutie.
Figuur 1. Overzicht van RNA probe voorbereiding. (A) Schematische weergave van onze strategie voor het synthetiseren Dig gemerkte RNA probes door in vitro transcriptie usinga lineaire DNA template geflankeerd door bacteriofaag RNA polymerase promoter elementen. (B) Afbeelding van standaard 1% agarose gel die voorbeelden tonen van in vitro getranscribeerde RNA probes voor het histon H2A, run en doc transposon RNAs. We voeren meestal een side-by-side elektroforese van zowel de PCR sjabloon en RNA probe. Het RNA wordt gewoonlijk als een intense discrete band met hogere mobiliteit dan bij het sjabloon
Figuur 2. Schematische weergave van de probe detectie stappen in de FISH-methode. Volgende probe hybridisatie verwerkte embryo, de DIG gemerkte probes opgenomen met een gebiotinyleerd α-DIG antistof die vervolgens gecomplexeerd met HRP geconjugeerd streptavidine. Tyramide signaalversterking (TSA) wordt dan uitgevoerd wat resulteert in de omzetting van de tyramide reagens in vrije radicalen vorm through de activiteit van HRP. Tijdelijk reactieve tyramide vrije radicalen covalent binden aan aromatische residuen van de nabijgelegen eiwitten, het voorkomen van het diffusie uit de buurt van de sonde locatie. De tyramide substraat is gecomplexeerd met fluorescente kleurstoffen, die kan worden gedetecteerd door fluorescentie microscopie.
Figuur 3. Voorbeelden van resultaten verkregen met deze procedure FISH aandacht voor de diversiteit van mRNA expressie en subcellulaire localisatie patronen in Drosophila embryo's. (A) FISH analyse van het paar regel-gen uitgevoerd bij verschillende fasen van de embryogenese zien hoe de eerste brede expressie in het middengedeelte van het embryo in embryonale stadium 4 wordt verfijnd tot een gesegmenteerde streeppatroon in latere stadia. (B) Mozaïek weergave van FISH resultaten die verschillende soorten mRNA localization patronen in stadium 4-7 embryo's. FISH werd uitgevoerd met Dig gemerkte antisense probes die werden gehybridiseerd en gedetecteerd door achtereenvolgende incubaties met het gebiotinyleerde anti-Dig antilichaam, streptavidine-HRP en Cy3 tyramide. RNA = blauw, DNA = rood. Schaalbalk in (A) = 25 pM, terwijl dat in (B) = 50 uM.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Voor sonde synthese stappen, hebben we meestal het genereren van run-off antisense RNA probes door in vitro transcriptie van volledige lengte Drosophila cDNA geamplificeerd van plasmiden in de Drosophila Gen (DGC), een bron beschreven op de volgende website: http://www .fruitfly.org / DGC / index.html 14,15. Deze benadering is veelvuldig gebruikt in grootschalige ISH studies gericht op het in kaart brengen van genexpressie en mRNA lokalisatie patronen in vlieg embryo 9,16. DGC plasmiden kunnen worden besteld bij de Drosophila Genomic Resource Center ( https://dgrc.cgb.indiana.edu/vectors/ ). De flexibiliteit in uitgangsmaterialen en ontwerpen met aangepaste primers T7, SP6 of T3 overhang maakt het mogelijk om gemakkelijk probes te detecteren specifieke mRNA isovormen (bijvoorbeeld alternatief gesplicede varianten) or niet-coderende RNA's die niet vertegenwoordigd zijn in de standaard cDNA collecties. Bij het overwegen ontwerpen isoform-specifieke probes, hebben wij gevonden dat templates variërend van 250-1,000 basen kunnen FISH uitstekende resultaten opleveren.
Voor FISH in vlieg embryo's, doen we niet fragment onze sondes door carbonaat behandeling, maar eerder gebruiken we full-length run-off transcripts, die kan in grootte variëren tussen 500-5000 basen. Bij het uitvoeren FISH op andere weefsels die minder doorlaatbaar voor grote probes, kan fragmentatie inderdaad voorkeur probe penetratie. We echter de voorkeur geven aan voorbereiding probes met kleinere PCR-geamplificeerd DNA templates of bundelen vele afzonderlijk gesynthetiseerde probes samen kleine, eerder dan de chemische fragmentatie van grote probes die variabele resultaten geven en de algehele kwaliteit probe.
Zoals beschreven in de embryo's worden verzameld stappen we meestal toe te voegen gist pasta aan op de embryo platen. Gist pasta zal sterktoename van het aantal eieren gelegd door de vliegen, zoals de productie van eieren is afhankelijk van de voedingswaarde-omgeving 17. Bovendien zal Drosophila vliegen vaak hun eitjes direct in de gist pasta. Deze embryo kan worden ontvangen door het oplossen van de gist plakken in water met een kleine penseel en het mengsel door een opvangkorf. Voor de dechorionation stap 3% bleekmiddeloplossing, bereid door commercieel bleekmiddel (typisch 6% concentratie) 1:1 met water, wordt in de meeste protocollen 13,18,19. In onze ervaring, hebben we ontdekt dat het incuberen embryo's met een 3% bleekmiddel oplossing voor 90 sec efficiënte dechorionation biedt. Deze parameters moeten mogelijk worden aangepast afhankelijk van de commerciële bleekmiddel oplossing die beschikbaar is, maar men moet ervoor zorgen dat u de embryo's bloot aan bleekmiddel, omdat dit kan schade aan de monsters. De dechorionation procedure nauwlettender, is het mogelijk om de embryo kijken onder een microscoop to ervoor zorgen dat de dechorionation reactie volledig is, dwz dat de embryo's verliezen hun dorsale aanhangsels als ze dechorionated. Tenslotte een goede embryo fixatie te verzekeren maakt een vers bereide formaldehyde oplossingen, oude oplossingen vaak precipitaat. Voor verdere verwijzing, is deze procedure is beschreven in de voorgaande methoden artikelen 13,18,19.
Voor stappen met betrekking tot permeabilisatie van embryonale weefsels met proteïnase K of detectiereagentia zoals antilichamen en Cy3-tyramide hebben wij gevonden optimale resultaten met de verdunningen in dit protocol. Echter, als gevolg van verschillen in de lab-omgevingen en reagens voorraden, raden wij aan dat elk laboratorium empirisch hun eigen reagentia te testen om de beste werken concentraties voor hun specifieke behoeften vast te stellen. Bovendien hebben we het optimale reagensconcentraties is afhankelijk van de geanalyseerde weefsels.
Om dat de FISH-procedure te garanderen is geven consistent reproduceerbare resultaten, raden wij altijd toevoegen van een aantal positieve controles aan de test, die zou kunnen sondes voor transcripten met goed gedefinieerde uitdrukking / lokalisatie patronen (bijv. run) op te nemen. Afschriften met opvallende mRNA lokalisatie patronen tijdens de vroege embryogenese van Drosophila zijn te vinden op de Fly-FISH website ( http://fly-fish.ccbr.utoronto.ca/ ). Omgekeerd te controleren voor achtergrond signaaldetectie, zoals hierboven vermeld, moet men ook 'no-probe "en / of sense RNA probe monsters.
Naast de Cy3 conjugaat tyramide beschreven in dit protocol, zijn er verschillende andere commercieel verkrijgbare fluorochroom-geconjugeerde tyramide reagentia van Perkin Elmer Life Sciences of Molecular Probes (Invitrogen, Canada, Inc), dat extra flexibiliteit kan voorzien multicolor imaging experimenten . Hoewel deze methode beschrijft onze basis proceure voor enkele RNA FISH, variaties van deze methode kan worden geïmplementeerd complexere experimenten, zoals dubbele FISH-RNA of RNA-eiwit co-detectie. Voor meer informatie met betrekking tot deze procedures, adviseren wij de volgende de procedures beschreven in bestaande FISH methoden papieren 18-20.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Geen belangenconflicten verklaard.
Acknowledgments
Werkzaamheden die in het Lecuyer laboratorium wordt ondersteund door financiering van de National Sciences and Engineering Council of Canada (NSERC), de Canadese Institutes of Health Research (CIHR) en het Fonds de Recherche en Sante du Quebec (FRSQ). Fabio Alexis Lefebvre en Gaël Moquin-Beaudry worden ondersteund door NSERC undergraduate research studiebeurzen, terwijl Carole Iampietro wordt ondersteund door de Angelo Pizzagalli postdoctoraal fellowship.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| T7, T3 or SP6 RNA Polymerase | Fermentas Life Sciences | EP0101,EP0111,EP0131 | Kits contain reaction buffer. |
| DIG RNA Labeling Mix | Roche Applied Science | 11 277 073 910 | |
| RNAguard | Amersham Biosciences | 27-0816-01 | |
| 3M sodium acetate | |||
| Cold 100% ethanol. | |||
| Cold 70% ethanol. | |||
| Chlorine bleach solution diluted 1:1 with water. | |||
| Heptane | |||
| Methanol | |||
| proteinase K | Sigma Aldrich Oakville, ON, Canada | Catalog No. P2308 | |
| 40% formaldehyde solution, freshly prepared | |||
| PBS-Tween solution (PBT) | 1xPBS, 0.1% Tween-20 | ||
| Glycine solution | 2 mg/ ml glycine in PBT | ||
| HRP-conjugated mouse monoclonal anti-DIG | Jackson ImmunoResearch Laboratories Inc | 200-032- 156 | (1/400 dilution of a 1 mg/ml stock solution in PBTB |
| HRP-conjugated sheep monoclonal anti-DIG | Roche Applied Science, Laval, QC | 1 207 733 | 1/500 dilution of stock solution in PBTB |
| Biotin-conjugated mouse monoclonal anti-DIG | Jackson ImmunoResearch Laboratories Inc., West Grove, PA, USA | 200-062-156 | (1/400 dilution of a 1 mg/ml stock solution in PBTB |
| Streptavidin-HRP conjugate | Molecular Probes, Eugene OR, USA | S991 | (1/100 dilution of a 1 μg/ml stock |
References
- Wilcox, J. N. Fundamental principles of in situ hybridization. J. Histochem. Cytochem. 41, 1725-1733 (1993).
- Tautz, D., Pfeifle, C. A non-radioactive in situ hybridization method for the localization of specific RNAs in Drosophila embryos reveals translational control of the segmentation gene hunchback. Chromosoma. 98, 81-85 (1989).
- Lecuyer, E., Tomancak, P. Mapping the gene expression universe. Curr Opin Genet Dev. 18, 506-512 (2008).
- Tomancak, P., et al. Global analysis of patterns of gene expression during Drosophila embryogenesis. Genome Biol. 8, 2007-208 (2007).
- Thisse, B., et al. Spatial and temporal expression of the zebrafish genome by large-scale in situ hybridization screening. Methods Cell Biol. 77, 505-519 (2004).
- Quiring, R., et al. Large-scale expression screening by automated whole-mount in situ hybridization. Mech. Dev. 121, 971-976 (2004).
- Pollet, N., et al. An atlas of differential gene expression during early Xenopus embryogenesis. Mech. Dev. 122, 365-439 (2005).
- Lein, E. S., et al. Genome-wide atlas of gene expression in the adult mouse brain. Nature. 445, 168-176 (2007).
- Lecuyer, E., et al. Global analysis of mRNA localization reveals a prominent role in organizing cellular architecture and function. Cell. 131, 174-187 (2007).
- Imai, K. S., Levine, M., Satoh, N., Satou, Y. Regulatory blueprint for a chordate embryo. Science. 312, 1183-1187 (2006).
- Bell, G. W., Yatskievych, T. A., Antin, P. B. GEISHA, a whole-mount in situ hybridization gene expression screen in chicken embryos. Dev. Dyn. 229, 677-687 (2004).
- Wilkie, G. S., Shermoen, A. W., O'Farrell, P. H., Davis, I. Transcribed genes are localized according to chromosomal position within polarized Drosophila embryonic nuclei. Curr. Biol. 9, 1263-1266 (1999).
- Rothwell, W. F., Sullivan, W. Drosophila embryo dechorionation. CSH Protoc. , (2007).
- Stapleton, M., et al. The Drosophila gene collection: identification of putative full-length cDNAs for 70% of D. melanogaster genes. Genome Res. 12, 1294-1300 (2002).
- Rubin, G. M., et al. A Drosophila complementary DNA resource. Science. 287, 2222-2224 (2000).
- Tomancak, P., et al. Systematic determination of patterns of gene expression during Drosophila embryogenesis. Genome Biol. 3, (2002).
- Terashima, J., Bownes, M. Translating available food into the number of eggs laid by Drosophila melanogaster. Genetics. 167, 1711-1719 (2004).
- Lecuyer, E., Parthasarathy, N., Krause, H. M. Fluorescent in situ hybridization protocols in Drosophila embryos and tissues. Methods Mol. Biol. 420, 289-302 (2008).
- Lecuyer, E. High resolution fluorescent in situ hybridization in Drosophila. Methods Mol. Biol. 714, 31-47 (2011).
- Kosman, D., et al. Multiplex detection of RNA expression in Drosophila embryos. Science. 305, 846 (2004).
