Количественные высокой пропускной Single-клеточной цитотоксичности анализа для Т-клеток

Summary

Мы описываем одноклеточных высокой пропускной способностью анализа для оценки цитотоксичности Т-клеток при инкубации с опухолевыми клетками-мишенями. Этот метод используется плотная, эластомерных массив к югу от nanoliter скважин (~ 100000 скважин / массив) для пространственно ограничить Т-клетки и клетки-мишени в определенных соотношениях и соединен с флуоресцентной микроскопии для контроля эффекторных-целевого сопряжения и последующего апоптоза.

Abstract

Иммунотерапии рака могут использовать специфику иммунного ответа на цель и устранения опухоли. Приемные клеточная терапия (АКТ) на основе приемных передачи Т-клеток, генетически модифицированные, чтобы выразить химерный рецептор антигена (CAR) показали значительные перспективы в клинических испытаниях ^1-4. Есть несколько преимуществ использования CAR ⁺ Т-клеток для лечения рака, включая возможность направлять не-MHC антигенов и ограниченных к функционализации Т-клетки для оптимального выживания, самонаведения и настойчивость в принимающей, и, наконец, чтобы индуцировать апоптоз CAR ⁺ Т-клетки в случае хозяин токсичности ^5.

Разграничении оптимальной функции CAR ⁺ Т-клеток, связанных с клинические преимущества имеет важное значение для разработки следующего поколения клинических испытаний. Последние достижения в области изображений живых животных, как многофотонной микроскопии революцию в изучении функции иммунных клеток яп естественных ^6,7. Хотя эти исследования расширили наше понимание Т-клеточной функции в живом организме, Т-клеточной основе СПО в клинических испытаниях требует необходимость увязки молекулярные и функциональные особенности Т-клеточных препаратов предварительной инфузии с клинической эффективности после инфузии, с использованием в лабораторных анализов мониторинг Т-клеточной функции, такие как, цитотоксичности и секрецию цитокинов. Стандартный проточной цитометрии на основе анализа были разработаны, которые определяют общее функционирование популяций Т-клеток в одной клетке уровне, но они не пригодны для мониторинга формирования и сопряженных жизни или способности и той же клетке, чтобы убить несколько целей ^8.

Microfabricated массивов разработан в биосовместимые полимеры, такие как полидиметилсилоксана (PDMS) являются особенно привлекательным методом пространственно ограничить эффекторов и мишеней в небольших объемах ^9. В сочетании с автоматической покадровой флуоресцентной микроскопии, Тхоusands эффекторных-целевого взаимодействия могут быть проверены одновременно визуализации отдельных скважин из массива nanowell. Мы приведем здесь высокой пропускной методологии мониторинга Т-клеточной цитотоксичности на одной клеточном уровне, которые могут быть широко применены к изучению цитолитического функциональности Т-клеток.

Protocol

1. Подготовка реагентов

1. Подготовка RPMI-PLGH путем смешивания 500 мл RPMI-1640 и 5 мл каждого из пенициллин-стрептомицина, L-глутамин, и решение HEPES.
2. Подготовка R10 решение путем смешивания RPMI-PLGH с 10% эмбриональной телячьей сыворотки (FBS). FBS является инактивированной нагреванием при 56 ° С в течение 30 мин до того.
3. Предварительно теплой при 37 ° С 50 мл RPMI-PLGH, 15 мл PBS, и 15 мл R10 в стерильные конические пробирки.
4. Изготовление массивов nanowells в PDMS: мастер кремния изготавливается с помощью фотолитографии по существу, как описано выше ^10. Тщательно перемешайте Sylgard 184 эластомера базовый комплект и отвердителя при 10:1 весу в одноразовых чашку с помощью пластикового ножа. Дега смеси в вакуумной камере в течение 1 часа. Вылейте смесь на массиве nanowell, печать с предметное стекло и оставьте на 30 мин. Передача сборки в сушильном шкафу до 80 ° C в течение 2 часов и дайте остыть при комнатной температуре в течение 1 часа. Эластомер текущ.электронной течение этого периода и воля связь с стекле. Стекло, содержащая массив PDMS nanowell тщательно снят мастером кремния, покрытых скотчем и хранят до использования в будущем.

2. Целевая ячейка (T) Маркировка

1. Граф 5 миллионов клеток-мишеней с использованием культуры клеток гемоцитометр и осаждения клеток в стерильную 15 мл коническую трубку с помощью центрифугирования при 340 мкг в течение 5 мин. Культуры клеток делится в предыдущий день в 5 мл общего объема (плотность = 1 млн / мл) и культивировали в Т-25 колбу (VWR). Протоколы для подсчета клеток использованием гемоцитометр были подробно описаны ранее ¹¹
2. Аспирируйте избыток средств массовой информации оставив примерно 50 мкл средств массовой информации.
3. Подготовка рабочего раствора сотовых Tracker красный (CTR) путем смешивания 0,5 мкл складе CTR (1 мм) до 150 мкл RPMI-PLGH (конечная концентрация 2,5 мкм). Добавить 150 мкл рабочего раствора к клеткам-мишеням и тщательно перемешать с помощью пипетки P200.С другой стороны, PKH 26 (конечная концентрация 2 мкМ) могут быть использованы клетки целевой этикеткой в ​​соответствии с инструкциями изготовителя.
4. Инкубировать при 37 ° C / 5% CO ₂ в течение 20 мин.

3. Эффектор (E) мечения клеток

1. Граф 5 миллионов эффекторных клеток из клеточной культуры с помощью гемацитометре и осаждения клеток в стерильный 15 мл коническую трубку с помощью центрифугирования при 340 мкг в течение 5 мин.
2. Аспирируйте избыток средств массовой информации
3. Подготовка рабочего раствора Vybrant DyeCycleViolet пятна раствора, добавляя 1 мкл 5 мМ Vybrant складе фиолетового до 1 мл R10 средств массовой информации (конечной концентрации 5 мкМ). Добавить рабочего раствора в клетки и ресуспендируют использовании P200 пипетки. С другой стороны, PKH 67 (конечная концентрация 2 мкМ) могут быть использованы клетки целевой этикеткой в ​​соответствии с инструкциями изготовителя. Если PKH 67 используется, то Sytox зеленых не следует использовать, так как они находятся в том же флуоресценции канала. Перечисление апоптоза цели осуществляется исключительно с помощьюnnexinV окрашивания в этом случае.
   Примечание: При выполнении временной промежуток, а не конечной точке измерения, УФ-красками, как Vybrant Фиолетовый следует избегать.
4. Инкубировать при 37 ° C / 5% CO ₂ в течение 20 мин.

4. Разделение живых и мертвых клеток с помощью градиента плотности

1. Добавить 6,8 мл и 6,0 мл RPMI-PLGH к цели и эффекторных клеток, соответственно, и смешивать с помощью пипетки вверх и вниз мягко.
2. Слой 3,5 мл Ficoll-Пак Плюс к нижней части каждой конические трубки, содержащей цели и эффекторных клеток. Слой Ficoll медленно, чтобы обеспечить хорошее образование слоев между Ficoll и СМИ.
3. Центрифуга обе трубки при 340 х г в течение 30 мин. , без тормозов и ускорение.
4. Во время центрифугирования, передача 7 мл подогретого PBS до 4-луночный планшет. Подготовка nanowell массива (изготовлен в PDMS): чистая нижней части стекло с этанолом и окисляют PDMS на верхнем пороге РФ с помощью плазменных окислителя в течение 1 мин. Этот шаг будет Sterilize массива nanowell а также оказание PDMS гидрофильными. Немедленно переместите массива nanowell в пластину, содержащую PBS.
5. Передача пластины в кабинет биобезопасности и аспирации избыточного PBS. Сделайте 10 мл 1% благородных агар добавлением 100 мг порошок агара до 10 мл дистиллированной водой, а затем микроволновой печи в течение 30-45 сек. Нанесите теплый 1% благородных агара на верхний и нижний края стекло, которое содержит массив nanowell для иммобилизации массива и подождать 10 минут для агара, чтобы затвердеть. Добавьте 3 мл PBS и аспирации избыточного агар.
6. Добавьте 3 мл R10 на вершину массива nanowell и пусть оно равновесия в течение ~ 10 мин.
7. После Ficoll центрифугирования, аспирации 5 мл средства массовой информации из верхнего слоя каждой трубки. Будьте осторожны, чтобы не аспирацию слой, содержащий клетки.
8. Урожай клеток (белый слой) путем восстановления 1-2 мл из слоя между Ficoll и средств массовой информации с P1, 000 пипетки и переход на новые стерильные конические пробирки. Повторите эту процедуру для обоих наборов клеток, убедившись, что вы Максимхарактеризуют восстановления клеток.
9. Добавьте 3 мл подогретого RPMI-PLGH в каждую пробирку, перемешать с помощью пипетки и гранул путем центрифугирования при 340 мкг в течение 5 мин на полной ускорения и торможения.
10. Аспирируйте избыток средств массовой информации, добавляют 5 мл подогретого RPMI-PLGH в каждую пробирку и повторить центрифугирования при 340 мкг в течение 5 мин.
11. Аспирируйте избыток средств массовой информации и ресуспендируют осадок клеток в 500 мкл R10.
12. Граф живых клеток с использованием трипанового синего методом исключения на гемацитометре.

5. Сотовые загрузка на массив Nanowell

1. Аспирируйте лишний носитель из массива nanowell и добавить 2 мл свежего R10 через массив. Аспирируйте снова, а убедившись, что начало массива nanowell не слишком влажные / сухие, как это повлияет на распределение клеток.
2. Депозит 1 х 10 ⁵ клеток-эффекторов в 200 мкл R10 на поверхность массива nanowell (плотность = 5 х 10 ⁵ клеток / мл).
3. Пусть клетки урегулировать в течение 5 мин и с использованием стандартной тканевой культуре микроскопом проверку анУбедитесь, что распределение клеток является желательным. Добавить больше клеток в случае необходимости.
4. Депозит 1 х 10 ⁵ клеток-мишеней в 200 мкл R10 на поверхности массива nanowell (плотность = 5 х 10 ⁵ клеток / мл).
5. Пусть клетки урегулировать в течение 5 мин и с использованием стандартной тканевой культуре микроскопом проверку, чтобы убедиться, что распределение клеток является желательным. Добавить больше клеток в случае необходимости.
6. Промыть тщательно nanowell массив с 2 мл R10 и аспирации избыточных средств массовой информации.
7. Подготовка 3 мл подогретого R10 в 15 мл стерильной коническую трубку. Добавить 3 мкл 0,5 мм Sytox Зеленый нуклеиновых кислот Stain (конечная концентрация 0,5 мкМ) и 60 мкл аннексина V-Alexa Fluor 647 до подготовки рабочего раствора. Добавить рабочего раствора на 4-луночный планшет внимательно, удостоверившись, что клетки не вытесняется из скважины.
8. Инкубировать при 37 ° C / 5% CO ₂ в течение 15 мин.

6. 1 изображений

1. Получение изображений массива nanowell помощью флуоресценции микрoscope: В этом примере мы используем наблюдателей ZEISS Z-1 Микроскоп снабжен моторизованным сцене и лямбда-DG4.
2. Инициализация программного обеспечения и микроскоп и проверить интенсивность сигнала на проходящем свете и других флуоресцентных каналов. В целом, будет пять каналов, соответствующих: проходящем свете, аннексина V-647 (Cy5 фильтр), CTR (DsRed фильтр), Sytox Зеленый (FITC фильтр), и Vybrant Violet (DAPI фильтр). Убедитесь, что микроскоп его установки для обеспечения максимального сигнала к шуму, избегая при этом насыщения.
3. Установить X и Y позиции массива nanowell. Начало процесса установки в нулевое положение и инициализации внимание на центре 7 х 7 nanowell массива блока в левом верхнем углу штампа массива nanowell. Установите х, у позициям совпадает с центром каждого блока и Z-значение точно отражает фокус на каждом блоке.
4. Как только положение и фокус все готово, не забудьте установить получения изображения в линейном режиме и получать изображения. 2 на микроскопе по крайней мере, за 30 мин до эксперимента.

7. Пост-изображений

Передача 4-а пластину, содержащую массив nanowell в инкубатор (37 ° C / 5% CO ₂₎ в течение 6 часов.

8. 2 изображений

Получить изображение на второй временной точке, как описано в шаге 6.

9. Анализ изображений

1. Размещение клеток в nanowells определяется путем использования соответствующих программ сегментации изображения (например, ImageJ, http://rsbweb.nih.gov/ij/ ), по существу, как описано выше ^9,12.
2. Анализ исходного набора микроскопа изображений (Т = 0 ч, T ₀₎ используется для создания базы данных отдельных nanowells, содержащих ровно одну живую клетку-мишень (определеныпо CellTracker красный, красный) и не мертвых клеток (определяется по окрашиванию аннексина V, зеленый) [t1t ₀ nanowells].
3. Анализ второй комплект микроскопа изображений (Т = 6 ч, T ₆₎ используется самостоятельно определять вторую базу данных, содержащую 1 nanowells клетки-мишени (красный) _[6 t1t nanowells]. Проверка целостности (запрос к базе данных) осуществляется гарантировать, что все живые цели на T ₀ соответствуют целям при Т _{от 6} до получения окончательного наборе соответствующих целей (реализована как nanowells, которые имеют t1t ₀ = t1t _6, обозначены как T1match)
4. Количество клеток-эффекторов в nanowells определяется с помощью Vybrant окрашивания Фиолетовый При T ₀ [E1 nanowells]
5. Запрос к базе данных осуществляется для выявления nanowells содержащие одну эффекторов совместно инкубируют с одиночных целей (определяемых как nanowells, которые имеют E1 и T1 _матча, назначенного в качестве E1T1)
6. Effector индуцированного апоптоза забил я dentifying цели, которые аннексина V отрицательным при Т ₀ и аннексина V положительной при Т ₄ (E1T1 с аннексина V целевой окрашивания при Т _6).

10. Дополнительно замедленной Визуализация Killing Использование Nikon, Биостанция IM

1. Возьмите чашку Петри с покровным дно и вырезать небольшой кусок чипа массива nanowell (полученного на шаге 5), который будет точно соответствовать на покровное. Убедитесь, что чип остается влажной во время резки.
2. Смешайте 1 х 10 ⁶ целей и 1 х 10 ⁶ Т-клеток в 100 мкл среды, и пипеткой его на покровное.
3. Разрешить около 15-30 минут, чтобы позволить клеткам осесть.
4. Быстро инвертировать небольшой массив nanowell чип и поместить его на покровное.
5. Для того, чтобы гарантировать, что чип не сможет двигаться во время визуализации, место один или два 20мм х 20мм покровные на верхней части чипа. Подайте давление, мягко подтолкнуть чип на дно тарелки.

палатка "> Примечание: нижний чип nanowell массива является слишком толстым для изображений с высоким разрешением и, следовательно, должно быть перевернуто вверх дном За это, многие из клетки вымываются Так как это не может быть легко контролируемым, количество клеток в шаге 9.2.. и времени инкубации в шаге 9,3 должны быть оптимизированы.

Representative Results

Примером применения высокой пропускной цитолитического анализа показано, на рисунке 2. Короче говоря, помечены CD19 конкретных CAR ⁺ Т-клетки инкубируют с меченым мыши EL4 клетки-мишени в отдельных скважинах массива nanowell (разделы 1-5). Исходное изображение было записано на автоматизированные флуоресцентного микроскопа для определения присутствия (эффекторов и / или цели) каждого отдельного nanowell на массив (раздел 6). Обработка изображения была использована для выявления всех nanowells, содержащие ровно одну цель и один эффектор и исключить nanowells с мертвыми целями (раздел 9). Чип был переведен в инкубаторе в течение 6 ч, а затем второй образ чип был записан (разделы 7-8). Способность эффекторных индуцировать апоптоз в клетках-мишенях измеряли путем окрашивания аннексина V, в nanowells содержащих ровно один эффектор и одна цель. Две параллельные опыты проводились с теми же эффекторов и два комплекта OF клеток-мишеней (EL4-CD19 ⁺ и CD19-EL4-(негативный контроль)) для определения частоты антиген-специфического лизиса (рис. 2). Желательно, чтобы достичь низких частот неспецифического лизиса (~ 2-4%). Методология зависит от наличия соответствующей клетки-мишени и параллельный эксперименты выполняются для определения апоптоза в цели зависит от эффекторов. Высокие частоты целевой апоптоза в отсутствие эффекторов за 6ч период (> 8%) указывает на необходимость оптимизации культивирования и анализе условий. Массив nanowell может быть адаптирована для покадровой визуализации при непрерывном мониторинге необходимости (фильм 1), и это позволяет для наблюдения эффекторных-целевого сопряжения и последующей клеточной смерти.

Рисунок 1. А. Схема nanowell массива на основе цитолитического анализа. Меченые CAR ⁺Т-клетки (синие) и клеток-мишеней (красный) инкубируют в массив nanowells. Микроскопия используется для контроля эффекторных опосредованный цитолиз цели. B. Представитель композитных микрофотографии CD19 конкретных CAR ⁺ Т-клеток, которые индуцируют апоптоз в EL4-CD19 ⁺ клеток-мишеней и те, которые этого не делают.

Рисунок 2. Антиген-специфические цитолитическую активность CD19 конкретных CAR ⁺ Т-клеток. Целевые ячейки гистограммы участков скважин, содержащих один и эффекторные одной цели через 6 ч совместной инкубации. Согласованные гистограммы клеток-мишеней без эффекторов показано, чтобы сообщить о частоте фоне гибели клеток.

Фильм 1. Замедленной микроскопии CAR ⁺ Т-клеточного цитолиза. CAR ⁺ Т-клетки (немеченого) были совместно инкубируют с NALM-6-GFP + клеток-мишеней (зеленый) в паНовелл и снимки были сделаны через каждые 2 мин в общей сложности 12 часов, чтобы включить динамическое наблюдение. Аннексина V был добавлен в культуре средств массовой информации и апоптоза клеток становятся помечены красным цветом.

Discussion

Мы наметили протокол для высокой пропускной способности одноклеточных цитолитического анализа включается с помощью совместной инкубации эффекторов и мишеней в массивах nanowells (рис. 1). В дополнение к пропускной Основным преимуществом метода является возможность контролировать эффекторные-опосредованная цитотоксичность в отношении желаемой клетки-мишени без необходимости целевого клеточной инженерии, которая в свою очередь, позволяет использование аутологичных или соответствием / первичные опухолевые клетки, как клетки-мишени. Пространственного ограничения позволяют поиска и последующего клонирования функциональных Т-клеток в конце анализа ^9. Ограничение анализа является необходимость в специализированных микроскопов с автоматизированной этапы и быстрой коммутации оптики. Это, однако, не является серьезным ограничением при условии, что эти машины в настоящее время широко доступны как часть научно-исследовательских учреждений ядра.

Существуют различные проточной цитометрии на основе анализов, которые предлагают более высокую пропускную способность при preserviнг одноклеточных резолюции. Они включают в себя анализы, которые пятном для суррогатного маркера дегрануляции (CD107a) или перфорин содержание в эффекторов и каспазы / гранзимы деятельности в цели ^13,14. Эти исследования, однако, не по-настоящему контролировать эффекторные-целевого сопряжения или способность эффекторных, чтобы привлечь и убить несколько целей. По сравнению с золотом стандарте анализа, такие как 4 часа 51 Cr-релизе анализ, работать на E: T соотношении 1:1, наша методика обычно сообщает то же общее число цитолитического эффекторов, сохраняя при этом одноклеточных резолюции. Хотя протокол, изложенные здесь только информация о цитотоксичности, как описано ранее этого анализа может быть легко сочетается с microengraving анализа для определения цитокинов, выделяемых одной клеток-эффекторов на целевую перевязки ^9. Таким образом, можно создавать композитные функциональных профилей CAR ⁺ Т-клеток, которые сочетают цитотоксичности и секрецию цитокинов в одной клеточном уровне.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
RPMI-1640 w/o L-glutamine	Cellgro	15-040-CV
Penicillin-streptomycin	Cellgro	30-002-CI	10,000 I.U. Penicillin 10,000 μg/ml Streptomycin
L-glutamine	Cellgro	25-005-CI	200 mM solution
HEPES	Sigma Aldrich	H3537	1M
Fetal bovine serum (FBS)	Atlanta Biologicals	S11150	Lot tested
Cell Tracker Red Stain	Invitrogen	C34552	50 μg
Vybrant DyeCycle Violet Stain	Invitrogen	V35003	5 mM
SYTOX green Nucleic Acid Stain	Invitrogen	S7020	5 mM
Annexin V-Alexa Fluor 647	Invitrogen	A23204	500 μl
Dulbecco's PBS	Cellgro	21-031-CV	500 ml
Noble agar	DIFCO	2M220	100 g
Trypan Blue	Sigma Aldrich	T8154	0.4% liquid, sterile filtered
Hemocytometer	Hausser Scientifics	1492	Bright line
4-well plate	Thermo Fisher	167603
Harrick Plasma Cleaner	Harrick Plasma	PDC-32G	Basic plasma cleaner
Observer.Z1	ZEISS		Fluorescent microscope (works with the three parts below)
Lambda 10-3	Sutter Instrument		Filter controller
Lambda DG-4	Sutter Instrument		Ultra-High-Speed Wavelength switcher
Hamamatsu EM-CCD Camera	Hamamatsu	C9100-13	CCD-Microscope camera
15 ml conical tube	BD Falcon	352097
50 ml conical tube	VWR	3282-345-300
Nikon Biostation	Nikon Instruments Inc.	Biostation IM
Glass bottom culture dish	MatTek Corporation	P35G-0	35 mm petri dish, 10 mm microwell