Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Immunology and Infection

Kvantitativ hög kapacitet encelliga cytotoxicitetsanalys för T-celler

Published: February 2, 2013 doi: 10.3791/50058

Summary

Vi beskriver en encellig hög genomströmning analys för att mäta cytotoxicitet hos T-celler när de inkuberas med tumörmålceller. Denna metod använder en tät, elastomer matris av sub-nanoliter brunnar (~ 100.000 brunnar / grupp) att rumsligt begränsa de T-celler och målceller vid definierade förhållanden och är kopplad till fluorescensmikroskopi för att övervaka effektor-mål konjugering och efterföljande apoptos.

Abstract

Cancer immunterapi kan utnyttja specificitet immunsvaret att rikta och eliminera tumörer. Adoptiv cellterapi (ACT) baserat på adoptiv överföring av T-celler genetiskt modifierade för att uttrycka en chimär antigenreceptor (CAR) har visat mycket lovande i kliniska prövningar 1-4. Det finns flera fördelar med att använda CAR + T-celler för behandling av cancer, inklusive förmågan att rikta icke-MHC begränsade antigener och att funktionalisera de T-celler för optimal överlevnad, målsökande och uthållighet i värden, och slutligen för att inducera apoptos av CAR + T-celler i händelse av värdtoxicitet 5.

Avgränsar de optimala funktioner CAR + T-celler associerade med klinisk nytta är avgörande för utformningen av nästa generation av kliniska prövningar. Senaste framstegen inom levande djur avbildning som multiphoton mikroskopi har revolutionerat studiet av immunceller funktion iN in vivo 6,7. Även om dessa studier har avancerat vår förståelse av T-cellfunktioner in vivo, T-cell baserad ACT i kliniska prövningar kräver att behovet av att koppla molekylära och funktionella egenskaper hos T-cell preparat före infusion med klinisk effekt efter infusionen, genom att utnyttja i vitro-analyser övervakning T-cellfunktioner som, cytotoxicitet och cytokin sekretion. Standard flödescytometri baserade analyser har utvecklats som bestämmer den övergripande funktion av populationer av T-celler vid encelliga nivå men dessa är inte lämpliga för övervakning av konjugat-bildning och livslängd eller förmågan hos samma cell för att döda flera mål 8.

Mikrofabricerade matriser utformade i biokompatibla polymerer som polydimetylsiloxan (PDMS) är en särskilt attraktiv metod för att rumsligt begränsa effektorer och mål i små volymer 9. I kombination med automatiserad time-lapse fluorescensmikroskopi, thousands av effektor-mål interaktioner kan övervakas samtidigt av avbildning enskilda brunnar i en nanowell array. Vi presenterar här en hög genomströmning metod för övervakning av T-celler förmedlad cytotoxicitet vid encelliga nivå som kan tillämpas i stor utsträckning för att studera den cytolytiska funktionaliteten av T-celler.

Protocol

1. Reagens Förberedelser

  1. Framställ RPMI-PLGH genom blandning 500 ml RPMI-1640 och 5 ml vardera av penicillin-streptomycin, L-glutamin, och HEPES-lösning.
  2. Bered R10 lösning genom att blanda RPMI-PLGH med 10% fetalt bovint serum (FBS). FBS är värmeinaktiveras vid 56 ° C under 30 min före tillsats.
  3. Pre-varm vid 37 ° C 50 ml RPMI-PLGH, 15 PBS ml och 15 ml R10 i sterila koniska rör.
  4. Tillverkning av grupper av nanowells i PDMS: Kisel Master är tillverkad med fotolitografi väsentligen såsom beskrivits tidigare 10. Blanda noga Sylgard 184 bas elastomer kit och härdare vid 10:01 viktförhållande i en disponibel kopp med en plast kniv. Avgasa blandningen i en vakuumkammare under 1 timme. Häll blandningen på nanowell arrayen täta med en glasskiva och låt det sitta i 30 minuter. Överför enheten i en ugn inställd på 80 ° C under 2 timmar och låt svalna vid rumstemperatur under 1 timme. Elastomeren kommer nuvarandee under denna period och binder till objektglaset. Glasskivan innehållande PDMS nanowell arrayen lyfts försiktigt bort kisel befälhavaren, täckt med tejp och lagras tills framtida användning.

2. Målcell (t) Märkning

  1. Räkna 5 miljoner målceller från cellkultur med användning av en hemocytometer och pelletera cellerna i en steril 15 ml koniskt rör genom centrifugering vid 340 x g under 5 minuter. Cellodlingen delas föregående dag i 5 ml total volym (densitet = 1 miljoner / ml) och odlades i T-25-kolv (VWR). Protokoll för cellräkning med hemocytometer har beskrivits i detalj tidigare 11
  2. Sug överflödigt material lämnar bakom ungefär 50 ^ medier.
  3. Bered en arbetslösning av Cell Tracker Red (CTR) genom att blanda 0,5 pl CTR lager (1 mM) till 150 pl RPMI-PLGH (slutlig koncentration 2,5 pM). Lägg 150 ul av arbetslösningen till målcellerna och blanda noggrant med en P200 pipett.Alternativt kan PKH 26 (slutlig koncentration av 2 M) användas celler etikett mål enligt tillverkarens anvisningar.
  4. Inkubera vid 37 ° C / 5% CO 2 i 20 min.

3. Effektor (E) cellmärkning

  1. Räkna 5 miljoner effektorceller från cellkultur med användning av en hemacytometer och pelletera cellerna i en steril 15 ml koniskt rör genom centrifugering vid 340 x g under 5 minuter.
  2. Aspirera överflödigt material
  3. Bered en arbetslösning av Vybrant DyeCycleViolet Stain lösning genom att tillsätta 1 pl 5 mM Vybrant Violet lager till 1 ml av R10 medium (slutlig koncentration av 5 pM). Lägg arbetslösningen till cellerna och återsuspendera med P200 pipett. Alternativt kan PKH 67 (slutlig koncentration av 2 M) användas celler etikett mål enligt tillverkarens anvisningar. Om PKH 67 används så SYTOX Grön ska inte användas eftersom de är i samma fluorescens kanal. Räkning av apoptotiska mål görs uteslutande med AnnexinV färgning i detta fall.
    Obs: Om du utför tidsförlopp och inte mätningar endpoint bör UV färgämnen som Vybrant Violet undvikas.
  4. Inkubera vid 37 ° C / 5% CO 2 i 20 min.

4. Separation av levande och döda celler med användning av densitetsgradient

  1. Lägg 6,8 ml och 6,0 ml RPMI-PLGH till mål och effektorceller, respektive och blanda genom att pipettera upp och ned försiktigt.
  2. Skiktet 3,5 ml Ficoll-Paque Plus till botten av varje koniskt rör innehållande mål-och effektorceller. Skiktet FICOLL långsamt för att säkerställa god bildning av skikt mellan FICOLL och media.
  3. Centrifugera båda rören vid 340 xg i 30 minuter. utan broms och acceleration.
  4. Under centrifugering, överför 7 ml förvärmd PBS till en 4-brunnars platta. Förbered nanowell array (tillverkad i PDMS): ren botten glasskiva med etanol och oxidera PDMS vid hög RF-inställningen med plasma oxidationsmedel under 1 minut. Detta steg kommer sterilize den nanowell arrayen samtidigt gör PDMS hydrofila. Omedelbart flytta nanowell arrayen i plattan innehåller PBS.
  5. Överför plattan till en biosäkerhet skåp och aspirera överskott PBS. Gör 10 ml 1% ädelagar genom att tillsätta 100 mg pulver-agar till 10 ml avjoniserat vatten och sedan mikrovågsugn det under 30-45 sek. Applicera varm 1% ädelagar på övre och nedre kanten av glasskivan som innehåller nanowell arrayen att immobilisera arrayen och vänta 10 minuter för agar stelna. Tillsätt 3 ml PBS och aspirera överskott agar.
  6. Tillsätt 3 ml av R10 ovanpå nanowell matris och låt den jämvikt under ~ 10 minuter.
  7. Efter centrifugering ficoU, aspirera 5 ml media från det översta lagret av varje rör. Var noga med att inte aspirera lagret som innehåller cellerna.
  8. Skörda cellerna (vita skiktet) genom utvinning 1-2 ml från skiktet mellan FICOLL och media med P1, 000 pipett och flyttar till nya sterila koniska rör. Upprepa detta för båda celler samtidigt se till att du maximize för återvinning cellerna.
  9. Tillsätt 3 ml förvärmd RPMI-PLGH till varje rör, blanda genom pipettering och pellet genom centrifugering vid 340 x g under 5 minuter vid full acceleration och broms.
  10. Aspirera överflödigt material, tillsätt 5 ml förvärmd RPMI-PLGH till varje rör och upprepa centrifugering vid 340 xg under 5 minuter.
  11. Aspirera extra papperen och resuspendera cellpelleten i 500 ul R10.
  12. Räkna levande celler med användning av trypanblått exklusionsmetoden på en hemacytometer.

5. Cell lastning på Nanowell Array

  1. Sug överflödigt material från nanowell array och tillsätt 2 ml färsk R10 över arrayen. Sug igen samtidigt se toppen av nanowell array är inte alltför våt / torr som det kommer att påverka fördelningen av celler.
  2. Deposit 1 x 10 5 effektorceller i 200 | il av R10 mot nanowell array yta (densitet = 5 x 10 5 celler / ml).
  3. Låt celler nöja 5 min och med en vanlig vävnad kontroll kultur mikroskop för att ensäker på att fördelningen av celler är önskvärt. Lägg till fler celler om det behövs.
  4. Deposition 1 x 10 5 målceller i 200 | il R10 på nanowell array yta (densitet = 5 x 10 5 celler / ml).
  5. Låt celler nöja 5 min och med användning av en vanlig vävnad kontroll kultur mikroskop för att säkerställa att fördelningen av celler är önskvärt. Lägg till fler celler om det behövs.
  6. Skölj nanowell array försiktigt med 2 ml R10 och aspirera överskott medier.
  7. Bered 3 ml förvärmd R10 i ett 15 ml sterilt koniskt rör. Tillsätt 3 | il 0,5 mM SYTOX Grön Nucleic Acid Stain (slutlig koncentration 0,5 pM) och 60 pl av Annexin V-Alexa Fluor 647 att framställa arbetslösning. Lägg den arbetande lösningen på 4-brunnar försiktigt samtidigt se till att cellerna inte förskjuts från brunnarna.
  8. Inkubera vid 37 ° C / 5% CO 2 i 15 min.

6. Imaging 1

  1. Acquire bilder av nanowell array med ett fluorescens MICRoscope: I det här exemplet använder vi en ZEISS Observer Z-1 mikroskop utrustat med en motoriserad scen och Lambda-GD 4.
  2. Initiera programvaran och mikroskopet och kontrollera signalintensiteten på ljus och andra fluorescerande kanalerna. Totalt kommer det att finnas fem kanaler som motsvarar: ljus, Annexin V-647 (Cy5-filter), CTR (DsRed filter), SYTOX Grön (FITC-filter) och Vybrant Violet (DAPI-filter). Se till att mikroskop setup för att säkerställa maximal signal till brus och samtidigt undvika mättnad.
  3. Ställ X och Y position för nanowell array. Börja genom att ställa in nolläget och initiera fokus på mitten av 7 x 7 nanowell array block på övre vänstra hörnet av nanowell array stämpel. Ställ in x, y positioner för att sammanfalla med mitten av varje block och z-värdet för att korrekt återge fokus på varje block.
  4. När läget och fokus är redo, se till att ställa bild förvärv i linjärt läge och hämta bilder. 2 på mikroskopet minst 30 minuter före försöket.

7. Post-avbildning

Överför 4-brunnsplatta innehållande nanowell arrayen i en inkubator (37 ° C / 5% CO 2) under 6 timmar.

8. Imaging 2

Förvärva bilder på den andra tid-punkt som beskrivs i steg 6.

9. Bildanalys

  1. Beläggning av celler inom nanowells bestäms genom användning av lämpliga program bildsegmentering (t.ex. ImageJ, http://rsbweb.nih.gov/ij/ ) i huvudsak enligt tidigare beskrivning 9,12.
  2. Analys av den initiala uppsättningen av mikroskopbilder (t = 0 h, t 0) används för att generera en databas av de individuella nanowells innehåller exakt en levande målcell (identifieradgenom CellTracker Röd, röd) och inga döda celler (identifieras av Annexin V färgning, grön) [T1t 0 nanowells].
  3. Analys av den andra uppsättningen av mikroskopbilder (t = 6 h, t 6) används för att oberoende bestämma en andra databas av nanowells innehållande 1 målcell (röd) [T1t 6 nanowells]. En integritetskontroll (databasfrågan) genomförs för att säkerställa att alla levande mål vid t 0 är anpassade till målen vid t 6 för att producera en slutlig uppsättning matchade mål (implementerad som nanowells som har T1t 0 = T1t 6, betecknas som T1match)
  4. Antalet effektorceller i nanowells bestäms med Vybrant Violet färgning vid t 0 [E1 nanowells]
  5. En databas fråga genomförs för att identifiera nanowells innehåller enstaka effektorer saminkuberades med enstaka mål (definierade som nanowells som har E1 och T1 match som utsetts E1T1)
  6. Effektor inducerad apoptos görs av i dentifying mål som är Annexin V negativ vid t 0 och Annexin V positiva vid t 4 (E1T1 med Annexin V mål färgning vid t 6).

10. Valfri Time-lapse avbildning av Killing Med Nikons BioStation IM

  1. Ta en petriskål med täckglas botten och skär ut en liten bit av nanowell array chip (beredd i steg 5) som exakt passar på täckglaset. Se till att chipet förblir våt under kapningen.
  2. Blanda 1 x 10 6 mål och 1 x 10 6 T-celler i 100 pl medium, och pipetten den på täckglaset.
  3. Tillåt ca 15-30 min för att låta cellerna lösa.
  4. Snabbt invertera lilla nanowell array chip och placera den på täckglaset.
  5. För att säkerställa att chipset inte kommer att kunna röra sig under avbildning, plats en eller två 20mm x 20mm täckglas ovanpå chipet. Applicera tryck mjukt att driva chipet till botten av skålen.
tält "> Anmärkning: nanowell arraychip botten är för tjock för högupplöst bildbehandling och därför måste vändas upp och ned under denna, många av cellerna tvättas Eftersom detta inte kan vara lätt att kontrollera, cellantal i steg 9,2.. och inkubationstid i steg 9,3 måste optimeras.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Ett exempel på tillämpningen av hög genomströmning cytolytiska analysen visas i figur 2. Kortfattat, märkt CD19-specifika CAR + T-celler sam-inkuberas med märkt mus EL4 målceller i de enskilda brunnarna i en nanowell array (avsnitt 1-5). En första bild spelades in på automatiserade fluorescerande mikroskop för att identifiera beläggning (effektorer och / eller mål) för varje enskild nanowell på matrisen (avsnitt 6). Bildbehandling användes för att identifiera alla nanowells innehåller exakt ett enda mål och en enda effektor och utesluta nanowells innehåller döda mål (avsnitt 9). Chipet överfördes till en inkubator under 6 h och sedan en andra bild av chip registrerades (§ 7-8). Förmågan hos effektor att inducera apoptos i målceller mättes genom färgning med annexin V, nanowells innehållande exakt en effektor och ett mål. Två parallella experiment kördes med samma effektorerna och två uppsättningar of målceller (EL4-CD19 + och EL4-CD19-(negativ kontroll)) för att bestämma frekvensen av antigen-specifik lys (figur 2). Det är önskvärt att uppnå låga frekvenser av icke-specifik lys (~ 2-4%). Metodiken är beroende av tillgången på lämpliga målceller och parallella experiment körs för att bestämma apoptos i mål oberoende av effektorer. Höga frekvenser av mål apoptos i frånvaro av effektorer under 6h perioden (> 8%) indikerar ett behov av att optimera odling och villkor analys. Den nanowell array kan anpassas för time-lapse avbildning när kontinuerlig övervakning behövs (film 1) och detta gör det möjligt att observera effektor-mål konjugering och efterföljande celldöd.

Figur 1
Figur 1. A. Schematisk nanowell array baserad cytolytisk analys. Märkt CAR +T-celler (blå) och målceller (röd) inkuberas i en mängd nanowells. Mikroskopi används för att övervaka effektor förmedlad cytolys mål. B. Representativa sammansatta mikrofotografier av CD19-specifika CAR + T-celler som framkallar apoptos i EL4-CD19 + målceller och de som inte gör det.

Figur 2
Figur 2. Antigenspecifik cytolytisk aktivitet av CD19-specifika CAR + T-celler. Målcellen histogram plottar av brunnar innehållande en enda effektor och ett enda mål efter 6 timmar av saminkubation. Matchade histogram av målceller utan effektorer visas att rapportera hur ofta bakgrunden celldöd.

Film 1. Time-lapse mikroskopi av CAR + T-cells medierad cytolys. CAR + T-celler (omärkt) sam-inkuberas med NALM-6-GFP + målceller (grön) i en naNowell och bilder togs var 2 min för totalt 12 timmar för att möjliggöra dynamisk övervakning. Annexin V sattes till odlingsmediet och apoptotiska celler blir märkta röd.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Vi har beskrivit protokollet för en hög genomströmning encelliga cytolytisk analys aktiveras via samtidig inkubation av effektorer och mål i grupper av nanowells (Figur 1). Förutom genomströmning en stor fördel med tekniken är möjligheten att övervaka effektor-medierad cytotoxicitet mot önskade målceller utan behov av målcellen teknik som i sin tur möjliggör användning av autologa eller matchade / primär tumörceller som målceller. Den rumsliga inneslutning tillåter hämtning och efterföljande kloning av funktionella T-celler vid slutet av analysen 9. En begränsning av analysen är behovet av specialiserade mikroskop med automatiserade steg och snabbt byta optik. Detta är dock inte en allvarlig begränsning eftersom dessa maskiner är nu allmänt tillgänglig som en del av forskningsanläggningar kärna.

Det finns en mängd olika flödescytometri analyser som erbjuder högre kapacitet, medan preserving encelliga upplösning. Dessa inkluderar analyser som färgar för surrogatmarkör för degranulering (CD107a) eller perforin innehåll i effektorer och kaspas / granzymes aktivitet i mål 13,14. Dessa analyser emellertid inte riktigt övervakar effektor-mål-konjugation eller förmågan hos effektor att ingripa med och döda flera mål. Jämfört med guldmyntfoten analys såsom en 4h 51Cr-frisättningsanalys, kör på E: T-förhållanden av 1:1, rapporterar vår metodik normalt samma totala antalet cytolytiska effektorer, samtidigt som det ger encelliga upplösning. Även det protokoll som beskrivs här endast detaljer om cytotoxicitet, som beskrivs tidigare denna analys kan lätt kombineras med microengraving analysen för att bestämma cytokiner utsöndrade av enskilda effektorceller vid mål ligering 9. Det är således möjligt att generera sammansatta funktionella profiler av CAR + T-celler som kombinerar cytotoxicitet och cytokinutsöndring vid encelliga nivå.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Inga intressekonflikter deklareras.

Acknowledgments

Forskningen redovisas i denna publikation stöddes av National Cancer Institute i National Institutes of Health i Award nummer R01CA174385. Innehållet är endast ansvar författarna och inte nödvändigtvis representerar officiella ståndpunkter National Institutes of Health.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
RPMI-1640 w/o L-glutamine Cellgro 15-040-CV
Penicillin-streptomycin Cellgro 30-002-CI 10,000 I.U. Penicillin 10,000 μg/ml Streptomycin
L-glutamine Cellgro 25-005-CI 200 mM solution
HEPES Sigma Aldrich H3537 1M
Fetal bovine serum (FBS) Atlanta Biologicals S11150 Lot tested
Cell Tracker Red Stain Invitrogen C34552 50 μg
Vybrant DyeCycle Violet Stain Invitrogen V35003 5 mM
SYTOX green Nucleic Acid Stain Invitrogen S7020 5 mM
Annexin V-Alexa Fluor 647 Invitrogen A23204 500 μl
Dulbecco's PBS Cellgro 21-031-CV 500 ml
Noble agar DIFCO 2M220 100 g
Trypan Blue Sigma Aldrich T8154 0.4% liquid, sterile filtered
Hemocytometer Hausser Scientifics 1492 Bright line
4-well plate Thermo Fisher 167603
Harrick Plasma Cleaner Harrick Plasma PDC-32G Basic plasma cleaner
Observer.Z1 ZEISS Fluorescent microscope (works with the three parts below)
Lambda 10-3 Sutter Instrument Filter controller
Lambda DG-4 Sutter Instrument Ultra-High-Speed Wavelength switcher
Hamamatsu EM-CCD Camera Hamamatsu C9100-13 CCD-Microscope camera
15 ml conical tube BD Falcon 352097
50 ml conical tube VWR 3282-345-300
Nikon Biostation Nikon Instruments Inc. Biostation IM
Glass bottom culture dish MatTek Corporation P35G-0 35 mm petri dish, 10 mm microwell

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Louis, C. U., et al. Antitumor activity and long-term fate of chimeric antigen receptor-positive T cells in patients with neuroblastoma. Blood. 118, 6050-6056 (2011).
  2. Savoldo, B., et al. CD28 costimulation improves expansion and persistence of chimeric antigen receptor-modified T cells in lymphoma patients. J. Clin. Invest. 121, 1822-1826 (2011).
  3. Kalos, M., et al. T cells with chimeric antigen receptors have potent antitumor effects and can establish memory in patients with advanced leukemia. Sci. Transl. Med. 3, 95ra73 (2011).
  4. Porter, D. L., Levine, B. L., Kalos, M., Bagg, A., June, C. H. Chimeric Antigen Receptor-Modified T Cells in Chronic Lymphoid Leukemia. N. Engl. J. Med. , (2011).
  5. Restifo, N. P., Dudley, M. E., Rosenberg, S. A. Adoptive immunotherapy for cancer: harnessing the T cell response. Nat. Rev. Immunol. 12, 269-281 (2012).
  6. Pittet, M. J., Weissleder, R. Intravital imaging. Cell. 147, 983-991 (2011).
  7. Sumen, C., Mempel, T. R., Mazo, I. B., von Andrian, U. H. Intravital microscopy: visualizing immunity in context. Immunity. 21, 315-329 (2004).
  8. Lamoreaux, L., Roederer, M., Koup, R. Intracellular cytokine optimization and standard operating procedure. Nat. Protoc. 1, 1507-1516 (2006).
  9. Varadarajan, N., et al. A high-throughput single-cell analysis of human CD8+ T cell functions reveals discordance for cytokine secretion and cytolysis. J. Clin. Invest. 121, 4322-4331 (2011).
  10. Ogunniyi, A. O., Story, C. M., Papa, E., Guillen, E., Love, J. C. Screening individual hybridomas by microengraving to discover monoclonal antibodies. Nat. Protoc. 4, 767-782 (2009).
  11. Streeck, H., Frahm, N., Walker, B. D. The role of IFN-gamma Elispot assay in HIV vaccine research. Nat. Protoc. 4, 461-469 (2009).
  12. Varadarajan, N., et al. Rapid, efficient functional characterization and recovery of HIV-specific human CD8+ T cells using microengraving. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 109, 3885-3890 (2012).
  13. Makedonas, G., Betts, M. R. Living in a house of cards: re-evaluating CD8+ T-cell immune correlates against HIV. Immunol. Rev. 239, 109-124 (2011).
  14. Telford, W. G., Komoriya, A., Packard, B. Z. Multiparametric analysis of apoptosis by flow and image cytometry. Methods Mol. Biol. 263, 141-160 (2004).

Tags

Cancer Biology immunologi Cellulär biologi molekylärbiologi medicin kemiteknik biomolekylär teknik bioteknik immunterapi adoptiv Microfluidics Nanowell arrayer PDMS BioStation T-celler tumörceller mål märkning cytotoxicitet mikroskopi analys
Kvantitativ hög kapacitet encelliga cytotoxicitetsanalys för T-celler
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Liadi, I., Roszik, J., Romain, G.,More

Liadi, I., Roszik, J., Romain, G., Cooper, L. J. N., Varadarajan, N. Quantitative High-throughput Single-cell Cytotoxicity Assay For T Cells. J. Vis. Exp. (72), e50058, doi:10.3791/50058 (2013).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter