Summary
Descrevemos uma única célula ensaio de elevado débito para medir a citotoxicidade de células T, quando incubado com as células-alvo tumorais. Este método emprega uma matriz elastomérica denso, de sub-nanolitro poços (~ 100000 poços matriz /) para confinar espacialmente as células T e as células alvo em proporções definidas e está acoplado a microscopia de fluorescência para monitorizar alvo efetuador conjugação e apoptose subsequente.
Abstract
Imunoterapia do cancro pode aproveitar a especificidade da resposta imunitária para alvejar e eliminar tumores. Terapia celular adoptiva (ACT) com base na transferência adoptiva de células T geneticamente modificadas para expressar um receptor de antigénio quimérico (CAR) se mostrou promissora em ensaios clínicos 1-4. Existem várias vantagens de usar CAR + células T para o tratamento de cancros, incluindo a capacidade para alvejar os antigénios do MHC não-limitados e para funcionalizar as células T para a sobrevivência óptima, homing e persistência no interior do hospedeiro, e, finalmente, para induzir a apoptose de CAR + As células T, em caso de toxicidade central 5.
Delineando as funções ideais de CAR + células T associados com o benefício clínico é essencial para projetar a próxima geração de ensaios clínicos. Os recentes avanços na imagem animal vivo como microscopia multifotônica revolucionaram o estudo da função de células imunes in vivo 6,7. Embora estes estudos tenham avançado a nossa compreensão da função das células T in vivo, de células T ACT baseada em ensaios clínicos exige a necessidade de ligar as características moleculares e funcionais de células T preparações pré-infusão com eficácia clínica pós-perfusão, utilizando-se, em Os ensaios in vitro de células T de monitorização funções como, citotoxicidade e a secreção de citocinas. Padrão de citometria de fluxo-ensaios baseados foram desenvolvidos para determinar o funcionamento geral das populações de células T ao nível de uma única célula, mas estes não são adequados para a monitorização e a formação de conjugado vidas ou a capacidade da mesma célula para matar alvos múltiplos 8.
Matrizes microfabricated projetados em polímeros biocompatíveis como polidimetilsiloxano (PDMS) é um método particularmente atraente para confinar espacialmente efetores e metas em pequenos volumes 9. Em combinação com a microscopia de fluorescência automatizado lapso de tempo, thousands de-alvo efetor interações podem ser monitoradas simultaneamente por poços individuais de imagem de uma matriz nanowell. Apresentamos aqui um método de alto rendimento para a monitorização de células T da citotoxicidade mediada ao nível de uma única célula que pode ser amplamente aplicado para estudar a função de células T citolíticas.
Protocol
1. Preparação de reagentes
- Prepare RPMI-PLGH misturando 500 ml ml de RPMI-1640 e 5 de cada um de penicilina-estreptomicina, L-glutamina, HEPES e solução.
- Prepare R10 solução misturando RPMI-PLGH com 10% de Soro Fetal Bovino (FBS). O FBS inactivado pelo calor é a 56 ° C durante 30 min antes da adição.
- Pré-aquecido a 37 ° C de 50 ml de RPMI-PLGH, 15 ml ml de PBS, e 15 de R10 em tubos cónicos estéreis.
- Fabricação de matrizes de nanowells em PDMS: O mestre de silício é fabricado usando fotolitografia, essencialmente como descrito anteriormente 10. Misturar cuidadosamente a base de Sylgard 184 kit elastómero e agente de cura de peso de 10:1 em um copo descartável usando uma faca de plástico. Desgaseificar a mistura, em uma câmara de vácuo durante 1 hr. Despeje a mistura para a matriz nanowell, vedar com uma lâmina de vidro e deixar repousar durante 30 minutos. Transferir o conjunto dentro de um forno ajustado para 80 ° C durante 2 h e deixar arrefecer à temperatura ambiente durante 1 hr. O elastômero vontade atue durante este período e vontade vínculo com a lâmina de vidro. A lâmina de vidro que contém a matriz de PDMS nanowell é cuidadosamente levantada do mestre de silício, cobertos com fita adesiva Scotch e armazenadas até utilização futura.
2. Célula alvo Labeling (T)
- Conte 5.000.000 células alvo a partir de cultura de células utilizando um hemocitómetro e sedimentar as células em um tubo estéril de 15 mL cónico por centrifugação a 340 xg durante 5 min. A cultura de células é dividida no dia anterior em 5 ml de volume total (densidade = 1 milhão / ml) e cultivadas em frasco T-25 (VWR). Protocolos para contagem de células utilizando um hemocitómetro foram descritos em detalhe anteriormente 11
- Aspirar a mídia em excesso, deixando para trás cerca de 50 ul de mídia.
- Preparar uma solução de trabalho de Célula tracker Red (CTR) através da mistura de 0,5 ul de estoque CTR (1 mM) a 150 ul de meio RPMI-PLGH (concentração final 2,5 uM). Adicionar 150 ul da solução de trabalho para as células alvo e misturar cuidadosamente com uma pipeta de P200.Alternativamente, PKH 26 (concentração final de 2 mM) pode ser usada como células alvo de etiquetas de acordo com as instruções do fabricante.
- Incubar a 37 ° C / 5% de CO2 durante 20 min.
3. Rotulagem de células efetoras (E)
- Conte 5.000.000 células efectoras provenientes da cultura de células utilizando um hemocitómetro e sedimentar as células em um tubo estéril de 15 mL cónico por centrifugação a 340 xg durante 5 min.
- Aspirar excesso de mídia
- Preparar uma solução de trabalho de solução DyeCycleViolet Vybrant Stain pela adição de 1 uL de 5 mM estoque Violet Vybrant a 1 ml de meio R10 (concentração final de 5 uM). Adicionar a solução de trabalho para as células e ressuspender P200 usando uma pipeta. Alternativamente, PKH 67 (concentração final de 2 mM) pode ser usada como células alvo de etiquetas de acordo com as instruções do fabricante. Se PKH 67 é utilizado, em seguida, SYTOX Green não deve ser utilizada uma vez que eles estão no mesmo canal de fluorescência. A enumeração de metas apoptóticas é feito exclusivamente através de umnnexinV coloração no presente caso.
Nota: Se executar lapso de tempo e medições não terminais, corantes UV como Violeta Vybrant deve ser evitado. - Incubar a 37 ° C / 5% de CO2 durante 20 min.
4. Separação de células vivas e mortas Usando um gradiente de densidade
- Adicionar 6,8 ml e 6,0 ml de meio RPMI-PLGH ao alvo e células efectoras, respectivamente, e misture pipetando para cima e para baixo suavemente.
- Camada ml 3,5 de Ficoll-Paque Plus a parte inferior de cada tubo cónico contendo alvo e células efectoras. FICOLL camada lentamente para garantir boa formação de camadas entre FICOLL e mídia.
- Centrifugar os tubos a 340 xg durante 30 min. sem freio e aceleração.
- Durante a centrifugação, transferir 7 mL de PBS pré-aquecido a uma placa de quatro poços. Prepare nanowell array (fabricado em PDMS): inferior de lâmina de vidro limpa com etanol e oxidar o PDMS no ajuste alto RF usando plasma oxidante durante 1 min. Esta etapa irá sterilize matriz nanowell enquanto também tornar o PDMS hidrofílico. Imediatamente mover a matriz nanowell na placa contendo PBS.
- Transfira a placa para uma cabine de segurança biológica e aspirar excesso de PBS. Fazer 10 ml de ágar a 1% por adição de 100 nobre pó de ágar a 10 mg de água DI ml e, em seguida, ela microondas por 30-45 segundos. Aplicar aquecer a 1% de ágar nobre na borda superior e inferior da lâmina de vidro que contém a matriz nanowell para imobilizar a matriz e esperar 10 minutos para agar solidificar. Adicionar 3 ml de PBS e agar excesso aspirado.
- Adicionar 3 ml de R10 para o topo da matriz e deixar nanowell equilibrar durante ~ 10 min.
- Subsequente à centrifugação de Ficoll, aspirar 5 ml de meio a partir da camada superior de cada tubo. Tenha cuidado para não aspirar a camada que contém as células.
- Colher as células (camada branca), recuperando ml 1-2 da camada entre FICOLL e mídia com P1, 000 pipeta e mudança para novos tubos cônicos estéreis. Repita este procedimento para os dois conjuntos de células ao se certificar de que você máximaize das células de recuperação.
- Adicionar 3 ml de RPMI pré-aquecido PLGH-se a cada tubo da mistura, por pipetagem e sedimento por centrifugação a 340 xg durante 5 min em plena aceleração e de travagem.
- Aspirar a mídia em excesso, adicionam-se 5 ml de meio RPMI pré-aquecido PLGH-se a cada tubo e repetir a centrifugação a 340 xg durante 5 min.
- Aspirar o excesso de media e ressuspender o sedimento de células em 500 uL de R10.
- Contar as células vivas utilizando o método de exclusão de azul de tripano em um hemacitómetro.
5. Carregando célula para matriz Nanowell
- Aspirar o excesso de mídia matriz nanowell e adicionar 2 ml de R10 fresco através da matriz. Aspirar novamente enquanto certificando-se o topo da matriz nanowell não é muito úmido / seco como ele vai afetar a distribuição de células.
- Depósito de 1 x 10 5 células efectoras em 200 ul de R10 para nanowell superfície da matriz (densidade = 5 x 10 5 células / ml).
- Deixe as células assentar durante 5 min e usando um padrão de tecido de verificação microscópio cultura de ense que a distribuição das células é desejável. Adicionar mais células, se necessário.
- Depósito 1 x 10 5 células-alvo em 200 ul de R10 nanowell superfície da matriz (densidade = 5 x 10 5 células / ml).
- Deixe as células assentar durante 5 min e usando um padrão de tecido de verificação microscópio cultura para assegurar que a distribuição das células é desejável. Adicionar mais células, se necessário.
- Lavar cuidadosamente com matriz nanowell 2 ml R10 e aspirado excesso de mídia.
- Preparar 3 ml R10 pré-aquecido num tubo de 15 ml estéril cónico. Adiciona-se 3 uL de 0,5 mM de ácido nucleico SYTOX Verde Stain (concentração final 0,5 uM) e 60 jil de anexina V-Alexa Fluor 647 para preparar a solução de trabalho. Adicionar a solução de trabalho para a placa de quatro poços cuidadosamente assegurando ao mesmo tempo que as células não são deslocadas a partir das cavidades.
- Incubar a 37 ° C / 5% de CO2 durante 15 min.
6. Imagem 1
- Adquirir imagens da matriz nanowell usando um micr fluorescênciaoscope: Neste exemplo, usamos um Observer ZEISS Z-1 microscópio equipado com um palco motorizado e Lambda-DG4.
- Inicializar o software e o microscópio e verificar a intensidade do sinal na luz transmitida e os outros canais fluorescentes. De modo geral, haverá cinco canais correspondentes a: luz transmitida, anexina V-647 (Cy5 filtro), CTR (DsRed filtro), SYTOX Green (FITC filtro), e Vybrant Violet (DAPI filtro). Certifique-se que o microscópio que configurar para garantir sinal máximo de ruído, evitando a saturação.
- Definir X e Y posição para a matriz nanowell. Iniciar o processo, definindo a posição zero ea inicialização de foco no centro de 7 x 7 bloco matriz nanowell no canto superior esquerdo do selo matriz nanowell. Definir as posições x, y, para coincidir com o centro de cada bloco e o valor de z para reflectir com precisão a focagem em cada bloco.
- Uma vez que a posição eo foco está tudo pronto, certifique-se de definir a aquisição de imagens em modo linear e adquirir imagens.
7. Pós-imagem
Transferir a placa 4 poços contendo a matriz nanowell numa incubadora (37 ° C / 5% CO 2) durante 6 horas.
8. Imagem 2
Adquirir as imagens no segundo ponto do tempo, conforme descrito no Passo 6.
9. Análise de Imagem
- A ocupação de células dentro da nanowells é determinada através da utilização de programas apropriados de segmentação de imagem (por exemplo, ImageJ, http://rsbweb.nih.gov/ij/ ) essencialmente como descrito anteriormente 9,12.
- A análise do conjunto inicial de imagens de microscópio (t = 0 horas, t 0) é utilizado para gerar um banco de dados das nanowells individuais contendo exactamente uma célula alvo vivo (identificadopor CellTracker Red, vermelho) e sem células mortas (identificados por anexina V coloração, verde) [0 T1t nanowells].
- Análise de o segundo conjunto de imagens de microscópio (t = 6 horas; t 6) é utilizado para determinar de forma independente um segundo banco de dados de nanowells contendo uma célula alvo (vermelho) [6 T1t nanowells]. Uma verificação de integridade (consulta de banco de dados) é implementada para assegurar que todos os alvos vivos em t 0 são compatíveis com alvos em t 6 para produzir um conjunto final de metas combinadas (implementado como nanowells que têm T1t 0 = T1t 6, designado como T1match)
- O número de células efectoras em nanowells é determinada utilizando coloração violeta Vybrant em t 0 [E1 nanowells]
- Uma consulta de base de dados é implementado para identificar nanowells contendo efectores individuais co-incubado com alvos individuais (definida como nanowells que têm correspondência E1 e T1, designados como E1T1)
- Apoptose induzida efetor é marcado por i dentifying alvos que estão anexina V negativa em t 0 e V Anexina positivo em t 4 (E1T1 com anexina V na coloração de alvo t 6).
10. Imagem Time-lapse opcional de Matar Usando BioStation Nikon IM
- Pegue uma placa de Petri com o fundo lamela e cortar um pequeno pedaço do chip matriz nanowell (preparado na Etapa 5) que vai caber exatamente na lamela. Certifique-se de que o chip fica molhada durante o corte.
- Misturar 1 x 10 6 alvos e 1 x 10 6 células T em 100 ul de meios de comunicação, e pipeta-lo para a lamela.
- Permitir que cerca de 15-30 minutos para permitir que as células resolver.
- Rapidamente inverter o chip matriz pequena nanowell e colocá-lo sobre a lamela.
- A fim de assegurar que o chip não será capaz de se mover durante a imagiologia lugar, um ou dois 20 milímetros x 20 milímetros lamelas sobre a parte superior do chip. Aplicar uma pressão suave para empurrar o chip para o fundo do prato.
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Representative Results
Um exemplo da aplicação do ensaio de elevado débito citolítica é demonstrado na Figura 2. Resumidamente, CD19 marcado específico CAR + células T foram co-incubadas com células EL4 marcadas rato alvo nos poços individuais de uma matriz nanowell (secções 1-5). Uma imagem inicial foi gravado no microscópio fluorescente automatizada para identificar a ocupação (efectores e / ou alvos) de cada nanowell único na matriz (Secção 6). Processamento de imagem foi usada para identificar todos os nanowells contendo exatamente um alvo único e um efetor única e para excluir nanowells que contenham metas mortos (Seção 9). O chip foi transferido para uma incubadora durante 6 horas e, em seguida, uma segunda imagem do chip foi registada (secções 7-8). A capacidade de efector para induzir a apoptose em células alvo foi medida através da coloração com anexina V, em nanowells contendo exactamente um alvo e uma efectora. Dois experimentos foram executados em paralelo com os mesmos efetores e dois conjuntos Øf células alvo (EL4-CD19 + e CD19-EL4 (controlo negativo)) para determinar a frequência de lise específica de antigénio (Figura 2). É desejável alcançar baixas frequências de lise não específica (~ 2-4%). A metodologia utilizada é dependente da disponibilidade das células alvo adequadas e experimentos paralelos são executados para determinar a apoptose em alvos independentes de efectores. As altas frequências alvo de apoptose na ausência de efectores para o período de 6 horas (> 8%) indica a necessidade de optimizar a cultura e condições de ensaio. A matriz nanowell pode ser adaptado para imagiologia de lapso de tempo quando a monitorização contínua é necessária (Filme 1) e isto permite a observação de meta-efector e conjugação subsequente morte celular.
Figura 1. A. Esquema de matriz nanowell ensaio baseado citolítica. Rotulados CAR +Células T (azul) e células alvo (vermelho) foram incubadas em uma matriz de nanowells. Microscopia é usado para monitorar a citólise mediada por efector-alvo. Micrografias B. composta representativa de CD19 específico CAR + células T que induzem a apoptose em EL4-células CD19 + alvo e aqueles que não o fazem.
Figura 2. Antigénio específico da actividade citolítica CD19 específico CAR + células T. Parcelas célula alvo histograma de poços contendo um efetor única e um único alvo, após 6 horas de co-incubação. Histogramas correspondentes de células-alvo sem efetores são mostrados para informar a freqüência de morte celular de fundo.
Filme 1. Lapso de tempo microscopia de CAR + T-cell citólise mediada CAR. Células T (não marcado) foram co-incubadas com NALM-6-GFP + células-alvo (verde) de uma ndNowell e imagens foram feitas a cada 2 minutos para um total de 12 horas para permitir o monitoramento dinâmico. A anexina V foi adicionado ao meio de cultura e as células apoptóticas se tornam vermelho rotulado.
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Discussion
Temos descrito o protocolo para um ensaio de elevado rendimento de célula única citolítica activado através de co-incubação de efectores e alvos em matrizes de nanowells (Figura 1). Além disso a taxa de transferência de uma grande vantagem da técnica é a capacidade de monitorizar efectora mediada por citotoxicidade contra células alvo desejadas, sem a necessidade para a engenharia de células alvo, que por sua vez permite o uso de autólogos ou matched / primário de células tumorais, como as células-alvo. O confinamento espacial permite a recuperação e a subsequente clonagem de células T funcionais, no final do ensaio 9. A limitação do ensaio é a necessidade de microscópios especializados com estágios automatizados e rápido de comutação óptica. Esta não é, contudo, uma limitação séria, uma vez que estas máquinas são agora amplamente disponível como parte das instalações de centrais de pesquisa.
Há uma variedade de citometria de fluxo baseados em ensaios que oferecem um maior rendimento, enquanto preserving única célula de resolução. Estes incluem ensaios que mancha para o marcador substituto para degranulação (CD107a) ou conteúdo perforina em efeitos e caspase / atividade granzimas em alvos 13,14. Estes ensaios, todavia, não verdadeiramente monitorar alvo efetuador conjugação ou a capacidade de se envolver o efector e matar alvos múltiplos. Em comparação com o ensaio padrão ouro, como um ensaio de lançamento 51Cr-4h, executado em E: T relações de 1:1, nossa metodologia normalmente relata o mesmo número total de efetores citolíticos, enquanto continua a fornecer uma única célula de resolução. Embora o protocolo descrito aqui apenas detalhes sobre a citotoxicidade, como descrito anteriormente neste ensaio podem ser facilmente combinados com o ensaio para determinar microengraving citocinas secretadas por células efectoras individuais mediante ligadura alvo 9. Assim, é possível gerar compostos perfis funcionais de CAR células T + que combinam a citotoxicidade e a secreção de citoquinas ao nível de uma única célula.
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Disclosures
Não há conflitos de interesse declarados.
Acknowledgments
Pesquisa relatada nesta publicação foi apoiada pelo Instituto Nacional do Câncer do Instituto Nacional de Saúde sob o número Prêmio R01CA174385. O conteúdo é da exclusiva responsabilidade dos autores e não representam necessariamente a posição oficial do Instituto Nacional de Saúde.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| RPMI-1640 w/o L-glutamine | Cellgro | 15-040-CV | |
| Penicillin-streptomycin | Cellgro | 30-002-CI | 10,000 I.U. Penicillin 10,000 μg/ml Streptomycin |
| L-glutamine | Cellgro | 25-005-CI | 200 mM solution |
| HEPES | Sigma Aldrich | H3537 | 1M |
| Fetal bovine serum (FBS) | Atlanta Biologicals | S11150 | Lot tested |
| Cell Tracker Red Stain | Invitrogen | C34552 | 50 μg |
| Vybrant DyeCycle Violet Stain | Invitrogen | V35003 | 5 mM |
| SYTOX green Nucleic Acid Stain | Invitrogen | S7020 | 5 mM |
| Annexin V-Alexa Fluor 647 | Invitrogen | A23204 | 500 μl |
| Dulbecco's PBS | Cellgro | 21-031-CV | 500 ml |
| Noble agar | DIFCO | 2M220 | 100 g |
| Trypan Blue | Sigma Aldrich | T8154 | 0.4% liquid, sterile filtered |
| Hemocytometer | Hausser Scientifics | 1492 | Bright line |
| 4-well plate | Thermo Fisher | 167603 | |
| Harrick Plasma Cleaner | Harrick Plasma | PDC-32G | Basic plasma cleaner |
| Observer.Z1 | ZEISS | Fluorescent microscope (works with the three parts below) | |
| Lambda 10-3 | Sutter Instrument | Filter controller | |
| Lambda DG-4 | Sutter Instrument | Ultra-High-Speed Wavelength switcher | |
| Hamamatsu EM-CCD Camera | Hamamatsu | C9100-13 | CCD-Microscope camera |
| 15 ml conical tube | BD Falcon | 352097 | |
| 50 ml conical tube | VWR | 3282-345-300 | |
| Nikon Biostation | Nikon Instruments Inc. | Biostation IM | |
| Glass bottom culture dish | MatTek Corporation | P35G-0 | 35 mm petri dish, 10 mm microwell |
References
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